GIBCO细胞培养基本知识手册中文版.pdf

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引言 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1手册目的 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1细胞培养简介 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2什么是细胞培养？ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2有限细胞系与连续细胞系 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2培养条件 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 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生物污染 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14简介 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14细菌 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14酵母 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15霉菌 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15病毒 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16支原体 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16交叉污染 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17抗生素的使用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17细胞培养基本知识 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18细胞系 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18选择合适的细胞系 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18获取细胞系 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18

培养环境 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19贴壁培养与悬浮培养 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19培养基 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20 pH 值 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21二氧化碳 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21温度 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21细胞形态 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22哺乳动物细胞 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22哺乳动物细胞形态差异 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22 293 细胞的形态 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23昆虫细胞 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24

Sf21 细胞的形态 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24 Sf9 细胞的形态 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25方法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26

细胞培养维持指导原则 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26什么是传代？ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26何时传代？ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27常用细胞系推荐使用培养基 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28贴壁细胞的解离 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30 TrypLE? 解离酶 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30贴壁细胞的传代 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31所需材料 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31贴壁细胞传代流程 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31贴壁昆虫细胞传代的注意事项 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32

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悬浮细胞的传代 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33悬浮细胞的传代 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33悬浮培养容器 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33所需材料 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34悬浮细胞传代流程 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34悬浮昆虫细胞传代的注意事项 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36细胞的冷冻 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37冻存 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37细胞冻存指导原则 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37冻存培养基 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38所需材料 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38培养细胞冻存方案 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39冷冻细胞的解冻 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40细胞解冻指导原则 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40所需材料 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40冷冻细胞解冻方案 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40支持技术方案 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41利用血球计数器进行细胞计数 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41台盼蓝拒染法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42浓缩细胞 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42附录 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43疑难解析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43细胞培养产品 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44细胞系 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44哺乳动物细胞培养基 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45昆虫细胞培养基 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46细胞培养用血清产品 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46细胞培养用实验试剂 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47抗生素和抗真菌剂 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .48细胞培养用辅助产品 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49生长因子和纯化蛋白 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49转染和选择 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50转染试剂 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51其他资源 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52哺乳动物细胞和昆虫细胞培养 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52细胞与组织分析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52转染选择工具 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52安全数据表 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52分析证书 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52技术支持 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .53

引言

手册目的

细胞培养基本知识随身手册是对细胞培养基本知识教学视频 (www .invitrogen .com/

cellculturebasics) 的补充。

该手册和视频介绍了细胞培养的基本知识，涉及的内容包括：了解细胞培养专业实验室

要求、实验室安全、无菌技术和细胞培养的微生物污染以及介绍培养细胞的传代、冷冻

和解冻基本技术。

本手册和教学视频中提供的信息和指导原则仅针对细胞系 (有限或连续细胞系)，不涉及

诸如组织分离和解离等原代培养实验和技术。

请注意：虽然细胞培养实验基本技术有一些相似之处，但每种细胞的培养条件相差甚

大。偏离某种细胞所需的培养条件会导致细胞表达不同的表型；因此，我们建议您应熟

悉自己使用的细胞系，实验中严格遵守所有产品的操作说明。

第一部分. 引言

细胞培养简介

什么是细胞培养？细胞培养是指从动物或植物中取出细胞，然后使其在合适的人工环境中生长。这些细胞

可于培养前直接从组织中取出并采用酶或机械方法进行解离，或者也可来自已经建立的

细胞系或细胞株。

原代培养

原代培养是指将细胞从组织中分离后，使其在合适的条件下增殖直到占据所有可用基质

(即：达到汇合状态) 的培养阶段。在此阶段，必须将细胞转移到新的容器中并更换新鲜

培养基，从而对细胞进行传代培养，为其提供更多继续生长的空间。

细胞系

首次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系或者亚克隆。来自于原代培养的细胞系

寿命有限 (即：有限细胞系，见下文)，随着细胞的传代，生长能力最强的细胞会占据优

势，最终导致细胞群体在基因型和表型上达到一定程度的均一性。

细胞株

如果将细胞系的一个亚群通过克隆或者其他方法从培养物中明确地选择出来，则此细胞

系就成为一个细胞株。与亲代细胞系起始时相比，细胞株往往会获得其他一些遗传学

改变。

有限细胞系

与连续细胞系正常细胞通常只能分裂有限的次数，随后就会丧失增殖的能力，这是一个由遗传决定的

事件，被称为衰老；这种细胞系被称为有限细胞系。但是，一些细胞系会通过被称为

转化的过程变为永生性细胞系，这一过程可自然发生，也可经化学或病毒诱导发生。有

限细胞系发生转化获得无限分裂能力后，就成为连续细胞系。

培养条件各种细胞的培养条件相差很大，但是细胞培养的人工环境必须包括合适的容器，容器中

含有一定的基质或介质，为细胞提供必需的营养素 (氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物

质)、生长因子、激素和气体 (O2、CO2)，并可调节其物理化学环境 (pH、渗透压、温度)。

大多数细胞均具有贴壁依赖性，必须贴附在固体或半固体基质上培养 (贴壁或者单层培养)，

而另一些细胞则可在培养基中漂浮生长 (悬浮培养)。

冻存如果传代时有多余的细胞，可通过适当的保护剂 (例如：DMSO 或甘油) 处理细胞，储存

在 –130°C 以下的温度下 (冻存)，直到需要使用之时。有关细胞传代培养和冻存的更多信

息，请参阅第 26 页至第 40 页的“培养细胞维持指南”部分。

第一部分. 引言

培养细胞的形态根据形状和外观 (即：形态) 可将培养的细胞分为三大类。

? 成纤维细胞 (或者成纤维细胞样细胞) 为双极或多极细胞，呈细长形，贴附在基质上生长。

? 上皮样细胞呈多角形，尺寸更为规则，贴附在基质上呈散在斑片状生长。

? 淋巴母细胞样细胞呈球形，通常悬浮生长，不贴附在基质表面。

细胞培养的应用细胞培养是细胞和分子生物学中最重要的一项技术，可为细胞正常生理和生化 (例如：代谢研究、衰老研究)、药物和毒性化合物对细胞的作用以及致突变和致癌研究提供上佳的

模型系统。细胞培养还可用于药物筛选和开发以及生物化合物 (例如：疫苗、治疗性蛋

白) 的大规模生产。细胞培养在上述领域应用的主要优势在于，可以使用一批同源细胞获

得稳定、可重复的结果。

细胞培养实验室

安全

除了大多数日常工作场所共有的一些安全风险例如电击和火灾之外，细胞培养实验室由

于要操作和处理人或动物细胞和组织以及一些有毒、有腐蚀性或者有致突变性的溶剂和

试剂，因而还具有一些特殊的危险。其中，最常见的一些危险包括：注射器针头或者其

他污染锐器刺伤、液体泼溅到皮肤和粘膜上、经口吞入毒物以及吸入感染性气体挥发。

任何生物安全程序的基本目的都是为了减少或避免实验室工作人员和外部环境与潜在危

害性生物物质的接触。细胞培养实验室中最重要的安全要素是严格遵守标准微生物学准

则和技术。

生物安全性等级美国生物安全性法规和建议包含在由美国疾病预防控制中心 (CDC) 和国立卫生研究院

(NIH) 制定、美国卫生和福利部颁布的《微生物和生物医学实验室生物安全》文件中。该

文件规定了四个逐级升高的控制等级，依次称为生物安全 1 级至 4 级，介绍了按照操作

某一制剂时对应的危险等级应遵守的微生物学准则、应使用的安全设备以及应采取的设

施安全措施。

生物安全 1 级 (BSL-1)

BSL-1 为适合大多数研究和临床实验室的基础防护等级，适用于不会导致健康正常人发生

疾病的物质。

生物安全 2 级 (BSL-2)

BSL-2 适用于经口吞入或者经皮肤、粘膜接触会导致人发生不同严重程度疾病的中度危险

性物质。大多数细胞培养实验室至少应达到 BSL-2 等级，但是确切要求取决于所用细胞系

以及开展的工作类型。

生物安全 3 级 (BSL-3)

BSL-3 适用于已知可能会通过气体挥发传播的本地或外来性物质以及可导致严重、甚至致

命感染的物质。

生物安全 4 级 (BSL-4)

BSL-4 适用于具有高度个体风险、可通过感染性气体挥发导致威胁生命的不治之症的外来

性物质。应将此类物质控制在高防范等级的实验室内。

有关生物安全等级指导原则的更多信息，请参阅《微生物和生物医学实验室生物安全》

第五版，该文件可从 www .cdc .gov/od/ohs/biosfty/bmbl5/bmbl5toc .htm 下载。

第二部分. 细胞培养实验室安全数据表 (SDS)安全数据表 (SDS)，又被称为材料安全数据表 (MSDS)，是一种包含某物质各种属性信息

的表格。SDS 中包括诸如熔点、沸点和闪点等物理数据、有关该物质毒性、反应性、健康

影响、储存和处置的信息，以及应对泼溅的推荐防护设备和措施。

所有 Invitrogen 产品的安全数据表均可登录 www .invitrogen .com/sds 查阅。

安全设备细胞培养实验室的安全设备包括初级屏障，例如：生物安全柜、密闭容器及其他用于消

除或尽量减少危险品接触的工程控制设备，以及常与初级屏障配合使用的个人防护设备

(PPE)。生物安全柜 (即：细胞培养通风橱) 是最重要的安全设备，可以限制多种微生物学

操作产生的感染性泼溅或气体挥发，并可防止您培养的细胞受到污染。更多信息，请参

阅第 7 页的“细胞培养通风橱”部分。

个人防护设备 (PPE)个人防护设备 (PPE) 在人员与危险品之间形成一道直接的屏障，包括用于个人防护的物

品，例如：手套、实验室工作服和隔离衣、鞋套、靴子、呼吸器、面罩、防护镜或护目

镜。个人防护设备常与生物安全柜及其他可限制所操作物质或材料的装置配合使用。我

们建议您参阅您所在机构的指南，在实验室中采用合适的个人防护设备。

实验室安全规范下列建议仅为实验室安全规范的指导原则，不应将其视为完整的工作准则。请咨询您所

在机构的安全委员会，遵守当地有关实验室安全的规章制度。

有关微生物学标准规范的更多信息以及具体生物安全等级指导原则，请参阅《微生物和

生物医学实验室生物安全》第五版 (www .cdc .gov/od/ohs/biosfty/bmbl5/bmbl5toc .htm)。

? 必须始终穿戴适当的个人防护设备。手套污染时应更换，将用过的手套与其他污染的

实验室废物一起处置。

? 操作可能具有危害的物质后以及离开实验室前应洗手。

? 在实验室内不得进食、饮水、吸烟、处理隐形眼镜、涂抹化妆品或者存放供人食用的

食物。

? 遵守所在机构关于锐器 (即：针头、手术刀、吸管和破裂的玻璃器皿) 安全操作的准

则。

? 小心操作，尽量避免形成气体挥发和/或泼溅。

? 实验开始前、结束后以及可能具有传染性的物质发生泼溅时，应立即使用适当的去污

剂对所有工作台面进行去污。无论实验室设备是否被污染，均应定期进行清洁。

? 在对可能具有传染性的物质进行处置前应先去除污染。

? 发生事故可能导致感染性物质暴露时，应向相应人员 (例如：实验室主管、安全员)

报告。

第二部分. 细胞培养实验室

细胞培养设备

细胞培养实验室的具体要求主要取决于开展的研究类型；例如：专业从事癌症研究的哺

乳动物细胞培养实验室与从事蛋白质表达工作的昆虫细胞培养实验室的需求相差甚大。

但是，所有细胞培养实验室都要求内部没有致病性微生物存在 (即：无菌)，并且均有一

些相同的细胞培养必需基本设备。

此部分列出了大多数细胞培养实验室共有的一些设备和用品，以及可使工作更为高效、

准确或者可提高检测和分析范围的实用性设备。请注意此列表并非无所不包；任何细胞

培养实验室的需求均取决于其所开展的工作类型。

基本设备? 细胞培养通风橱 (即：层流通风橱或生物安全柜)

? 培养箱 (推荐使用湿式二氧化碳培养箱)

? 水浴锅

? 离心机

? 冰箱和冰柜 (–20°C)

? 细胞计数器 (例如：Countess? 自动细胞计数器或血球计数器)

? 倒置显微镜

? 液氮 (N2) 冷冻柜或冻存容器

? 灭菌器 (即：高压灭菌器)

扩增设备

? 抽吸泵 (蠕动泵或真空泵)

? p H 计

? 共聚焦显微镜

? 流式细胞仪

其他用品? 细胞培养容器 (例如：培养瓶、培养皿、滚瓶、多孔板)

? 吸管和移液器

? 注射器和针头

? 废物容器

? 培养基、血清和试剂

? 细胞

第二部分. 细胞培养实验室细胞培养实验室

无菌工作区域细胞培养实验室的主要要求是需要维持细胞培养工作区域处于无菌状态。尽管最好设置

独立的组织培养室，在较大的实验室内划出的细胞培养区域同样可用于无菌操作、孵育

以及细胞培养物、试剂和培养基的储存。获得无菌条件的最为简单、经济的方式就是使

用细胞培养通风橱 (即：生物安全柜)。

细胞培养通风橱细胞培养通风橱可提供无菌工作环境，同时限制多种微生物学操作产生的感染性泼溅或

气体挥发。目前已经开发出 I 级、II 级和 III 级三种细胞培养通风橱，以适应不同的研究和

临床需要。

细胞培养通风橱的分类

I级细胞培养通风橱配合良好的微生物学技术，可为实验室工作人员和环境提供相当水平

的防护，但是此类通风橱无法防止培养物污染，其在设计和空气流动性上均与化学通风

橱类似。

II 级细胞培养通风橱用于涉及BSL-1、2和3 级物质的工作，同样可为细胞培养实验提供必

需的无菌环境。II 级生物安全柜适用于操作可能具有危害的物质 (例如：来源于灵长类动

物的培养物、被病毒感染的培养物、放射性同位素、致癌性或毒性试剂)。

III级生物安全柜为气密性设备，可为工作人员和环境提供能够达到的最高等级的防护。

III 级生物安全柜适用于涉及已知人类致病原及其他 BSL-4 级物质的工作。

细胞培养通风橱的气流性质

细胞培养通风橱通过维持工作区域上方稳定、单向的 HEPA 过滤空气流动，保护工作环境

免受灰尘及其他空气污染物污染。气流可以呈水平方向，与工作台面平行吹过，或者也

可呈垂直方向，从通风橱上方吹向工作台面。

根据设计的不同，水平流通风橱可为培养物 (即：空气吹向使用者) 或者使用者 (即：空

气由通风橱内的负压经前方吸入) 提供保护。而垂直流通风橱则可同时为使用者和培养的

细胞提供良好的保护。

超净工作台

水平层流或垂直横流“超净工作台”不属于生物安全柜；该设备可将 HEPA 过滤空气由工

作台后方经工作台面吹向使用者，导致使用者可能接触到有潜在危害的物质。此设备只

能为产品提供保护。超净工作台可用于某些洁净操作，例如：无菌或电子设备的无尘组

装，不得用于操作细胞培养物质或药物配方以及可能具有传染性的物质。

有关生物安全柜的选择、安装和使用的更多信息，请参阅《微生物和生物医学实验室

生物安全》第五版，该文件可从 www .cdc .gov/od/ohs/biosfty/bmbl5/bmbl5toc .htm 下

载。

第二部分. 细胞培养实验室

细胞培养通风橱布局细胞培养通风橱大小应足够一人使用，内部和外部均易于清洁，具有充足的照明，使

用舒适，不会导致体位不便。保持细胞培养通风橱内工作空间整洁有序，将所有物品

置于直视范围内。向放入细胞培养通风橱内的所有物品喷洒 70% 乙醇，擦拭清洁，进

行消毒。

细胞培养通风橱内物品的摆放一般遵循以下右手使用习惯，并可根据特殊实验中增加的

物品进行相应的改动。

? 在通风橱中部开阔区域放置细胞培养容器

? 移液器置于右前方易于取用的地方

? 试剂和培养基置于右后方，便于吸取

? 试管架置于中后部，用于固定其他试剂

? 小型容器置于左后部，用于盛放废液

图 2 .1 . 适合惯用右手的工作人员的细胞培养通风橱基本布局。惯用左手的工作人员可相应地调整工作台面

上物品的摆放位置。

第二部分. 细胞培养实验室培养箱培养箱的作用是为细胞生长提供合适的环境。培养箱大小应足够满足实验室需要，具有强制空气循环，并且具有温度控制系统，可将温度波动控制在 ±0 .2°C 范围内。不锈钢培

养箱易于清洁，耐腐蚀，尤其适合使用湿化空气进行培养的情况。虽然细胞培养箱的无

菌性要求不如细胞培养通风橱严格，但是必须经常对其进行清洁，以免培养的细胞受到

污染。

培养箱种类

目前培养箱有两种基本类型，即：干式培养箱和湿式二氧化碳培养箱。干式培养箱较为

经济，但是需要将细胞在密封的培养瓶中培养，以防止培养基蒸发。在干式培养箱中放

置一只水盘可以增加一定的湿度，但是无法精确控制培养箱内的空气条件。湿式二氧化

碳培养箱较为昂贵，但是能够准确控制培养条件。这种培养箱可用于培养皿或多孔板中

细胞的培养，这种培养方式需要将空气控制在高湿度、高二氧化碳压力的状态。

储存细胞培养实验室应设置多个储存区，分别用于存放液体 (如培养基和试剂)、化学品 (如药物和抗生素)、耗材 (如一次性吸管、培养瓶和手套)、玻璃器皿 (如培养基瓶和玻璃吸管)、

特殊设备以及组织和细胞。

玻璃器皿、塑料制品和特殊设备可置于架子上或抽屉中于室温下存放；但是，所有培养

基、试剂和化学品均应按照标签说明存放。

一些培养基、试剂和化学品对光线敏感，尽管其可耐受光照状态下正常的实验室使用，

但是不使用时必须将其存放在暗处或者用铝箔包裹起来。

冰箱

对于小型细胞培养实验室，家用冰箱 (最好是不含自动除霜冷冻室的冰箱) 即可供试剂和

培养基于 2–8°C 下存放之用，而且价格低廉。大型实验室，采用专供细胞培养的冷藏室较

为合适。应确保定期打扫冰箱或冷藏室，以防污染。

冰柜

大多数细胞培养试剂可于 –5°C 至 –20°C 下储存；因此，可以采用超低温冰柜 (即：–80°C

冰柜) 存放多数试剂。与实验室冰柜相比，家用冰柜是一种较为便宜的选择。尽管大多数

试剂可耐受自动除霜 (即：自动解冻) 冰柜内的温度波动，但是有些试剂 (例如抗生素和

酶) 则应储存在无自动除霜功能的冰柜中。

第二部分. 细胞培养实验室

低温储存随着传代次数的增加，连续培养的细胞系可能发生遗传不稳定；因此，必须准备工作细

胞储备并将其存放于低温状态下 (更多信息，请参阅第 37 页的“细胞冻存”部分)。不得

将细胞存放于 –20°C 或 –80°C 冰柜中，因为细胞存放于上述温度条件下活力会迅速降低。

目前主要有两种液氮储存系统，即：蒸汽相和液相储存系统，分别采用广口和细口储存

容器。蒸汽相系统可降低冻存管爆炸危险，储存生物危害性物质时应使用该系统，液相

系统通常具有更长的静态保温时间，因而更为经济。

细口容器中液氮蒸发速度较慢，更为经济，而广口容器存取方便，储存容量较大。

细胞计数器细胞计数器是定量监测细胞增殖动力学的必备工具，实验室内同时培养 2-3 种以上细胞

时，细胞计数器能够提供巨大的便利。

Countess? 自动细胞计数器是一款台式设备，它采用标准台盼蓝摄入技术，可准确测

定细胞数量和活性 (活细胞、死细胞和总细胞)，测定每个样品只需不到 1 分钟的时

间。Countess? 自动细胞计数仪计数所需的样本量与您目前使用的血球计数器所需量相

同，且不到一分钟即可完成一个样本的典型细胞计数，适用于各种真核细胞。

第二部分. 细胞培养实验室无菌技术

简介细胞培养的成功很大程度上取决于保护细胞免受细菌、真菌和病毒等微生物的污染。非

无菌物品、培养基和试剂、带有微生物的空气颗粒、不干净的培养箱和污染的工作台面

均是导致微生物污染的来源。

无菌技术的作用是在环境微生物与无菌的细胞培养物之间形成一道屏障，它通过一套操

作流程来降低培养物被上述污染源污染的可能。无菌技术的组成要素包括：无菌工作区

域、良好的个人卫生、无菌试剂和培养基以及无菌操作。

无菌工作区域最为简单、经济的减少空气颗粒和气体挥发 (例如：灰尘、芽孢、皮屑、喷嚏) 污染的方

法就是采用细胞培养通风橱。

? 细胞培养通风橱应正确设置，放置于专门用于细胞培养的区域，同时要避免来自门、

窗及其他设备的气流，不能有直接的来往通道。

? 工作台面应保持整洁，只放置特定实验所需的物品；不能用作储存区域。

? 使用前后均应彻底消毒工作台面，周围区域和设备应定期清洁。

? 常规清洁时，工作前和工作过程中，特别是发生泼溅后，应使用 70% 乙醇擦拭工作

台面。

? 使用完毕后，可用紫外灯对细胞培养通风橱内空气和暴露在外的工作台面进行消毒。

? 在细胞培养通风橱内不需要也不建议使用煤气灯火焰。

? 细胞培养通风橱应始终保持运转，长时间不使用时方可关闭。

良好的个人卫生操作细胞培养物前后应洗手。穿戴个人防护设备不仅可保护您免受危险品污染，还可降

低皮屑以及衣服上污物和灰尘污染培养物的可能。

第二部分. 细胞培养实验室

无菌试剂和培养基商品化试剂和培养基经过严格的质量控制以确保其无菌性，但是在操作过程中这些产品

可能被污染。应遵循以下无菌操作原则以免污染。必须采用适当的灭菌方法 (例如：高压

蒸汽、无菌过滤) 对实验室中配制的所有试剂、培养基和溶液进行灭菌。

无菌操作? 必须用 70% 乙醇擦拭双手和工作区域。

? 在将容器、培养瓶、培养板和培养皿放入细胞培养通风橱之前，必须用 70% 乙醇擦拭

其外部。

? 不要从试剂瓶或培养瓶中直接倾倒培养基和试剂。

? 使用无菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液体；每支吸管只能使用一次，以

免交叉污染。使用时方可打开无菌吸管的包装。吸管应始终位于工作区域内。

? 试剂瓶和培养瓶用后必须盖上，用胶带将多孔板密封起来或者将其放入重复密封袋

中，以免微生物和空气污染物进入，污染培养物。

? 无菌培养瓶、试剂瓶、培养皿等物品使用时方可揭开盖子，不得将其开放暴露于环境

中。操作完成后尽快盖上盖子。

? 取下盖子时应将盖子开口朝下放在工作台面上。

? 必须使用无菌玻璃器皿和其他设备。

? 进行无菌操作时不要说话、唱歌或者吹口哨。

? 尽快完成实验，以尽量避免污染。

第二部分. 细胞培养实验室无菌技术核对表

以下核对表简要列出了一些建议和方法，指导您切实使用无菌技术。有关无菌技术的深

入介绍，请参阅《动物细胞培养：基本技术手册 (Freshney，2000)》。

第二部分. 细胞培养实验室

生物污染

简介

细胞培养物污染往往是细胞培养实验室最常遇到的问题，有时会带来十分严重的后果。细胞培养污染物主要分为两类，一类是化学污染物，例如：培养基、血清和水中的杂质、内毒素、增塑剂和去污剂，另一类是生物污染物，例如：细菌、霉菌、酵母、病毒、支原体以及其他细胞系的交叉污染。尽管无法彻底消除污染，但是可以通过充分了解污染源以及采用良好的无菌技术，降低污染发生的频率和严重程度。此部分将概括介绍主要的几种生物污染。

细菌

细菌是一大类广泛存在的单细胞微生物。细菌直径一般为几个微米，外形多样，例如：球状、杆状和螺旋状。细菌由于分布广泛、生长迅速以及体积大小的特点，与酵母和霉菌一起构成了细胞培养中最常遇到的生污染物。培养物被细菌污染后，几天内即可通过简单的肉眼观察发现；被感染的培养物通常呈云雾状 (即：浑浊状)，有时表面会覆盖一层薄膜。另外，经常还会发现培养基的 pH 值突然降低。在低倍显微镜下可见，细菌为细胞之间移动的微小颗粒，在高倍显微镜下观察可以分辨出各个细菌的形状。下列模拟图像显示了贴壁生长的 293 细胞被大肠杆菌污染。

图 2 .2 . 模拟相差图像显示贴壁生长的 293 细胞被大肠杆菌污染。低倍显微镜下可见贴壁细胞间的区域存在一些微微发亮的微小颗粒，但是各个细菌不易区分 (A 图)。将黑色方框区域进一步放大后可以显示出各个大肠杆菌细胞，这些细胞通常为杆状，约 2 μm 长，直径约 0 .5 μm 。图 A 中黑色方框的每边长度均为 100 μm 。

A B

第二部分. 细胞培养实验室

酵母

酵母是真菌界的一种单细胞真核微生物，大小从数微米 (多见) 到 40 微米 (罕见) 不等。与细菌污染类似，培养物被酵母污染后也会变得浑浊，特别是进入污染后期时。培养物被酵母污染后 pH 值变化极小，污染严重时 pH 值才会升高。在显微镜下，酵母呈单个卵圆形或球形颗粒，有些会芽生出较小的颗粒。下列模拟图像显示了贴壁生长的 293 细胞接种 24 小时后被酵母感染。

霉菌

霉菌是真菌界的一种真核微生物，以被称为菌丝的多细胞丝状体形式生长。这些多细胞丝状体构成的交联网络含有遗传性相同的细胞核，被称为集落或者菌丝体。与酵母污染类似，霉菌污染初期培养物 pH 值会维持稳定，污染加重后 pH 值会迅速升高，导致培养物浑浊。在显微镜下，菌丝体通常呈细束状纤维，有时呈较为密集的孢子团块。许多种霉菌的孢子在休眠期均可耐受极端严峻、不利的环境，当其遇到合适的生长条件时才会被活化。

图 2 .3 . 模拟相差图像显示贴壁培养的 293 细胞被酵母污染。污染的酵母细胞呈卵圆形颗粒，复制时会芽生出较小的颗粒。