微生物几丁质酶研究进展
昆虫几丁质酶及其在植物保护中的应用
吴青君 女 岁 现在中国农业大学应用化学系攻读博士学位 主要从事农药学和昆虫毒理学研究?通讯地址 北京海淀区白石桥路 号 中国农业科学院蔬菜花卉研究所植保室?收稿日期 2 2 昆虫几丁质酶及其在植物保护中的应用 吴青君 张文吉 中国农业大学应用化学系 北京 张友军 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 北京 Ινσεχτχηιτινασεανδιτσποτεντιαλυσεινπλαντπροτεχτιον ? ± 2 ∏ ? 2 ?επαρτμεντοφΑππλιεδΧηεμιστρψ ΧηιναΑγριχυλτυραλΥνι?ερσιτψ ≤ ≠ ∏2 ∏ Ινστι2τυτεοφ?εγεταβλεσανδΦλοωερσ ΧηινεσεΑχαδεμψοφΑγριχυλτυραλΣχιενχεσ ≤ Αβστραχτ × ∏ 2 ∏ ∏ √ Κεψωορδσ ∏ 摘 要 本文从生理学!生物化学和分子生物学 个方面综述了昆虫几丁质酶的研究进展 并概述了它在害虫防治!主要是在抗虫育种中作为重要的基因源中的应用?关键词 几丁质 昆虫几丁质酶 植物保护 应用
几丁质是由 )乙酰葡萄胺通过Β) 键连接起来的直链多聚物 是自然界中含量最丰富的多糖之一 在昆虫的外骨骼和肠道内壁 真菌和一些藻类的细胞壁及甲壳动物的外壳中均发现它的存在?催化水解几丁质的水解酶广泛地存在于含几丁质的有机体及不含几丁质的生物 如微生物!高等植物和动物中?不同生物源的几丁质酶具有不同的生物功能 昆虫和甲壳动物的几丁质酶主要作用是蜕去外骨骼 真菌几丁质酶负责细胞的生长和分裂 细菌几丁质酶则分解几丁质提供营养源 而植物几丁质酶主要用于防御害虫和病菌的侵袭 增加植物的抗逆能力? 植物在逆境胁迫下体内几丁质酶的含量迅速升高 植物几丁质酶的诱导及防卫反应机制的研究是目前分子生物学研究的热点之一?大量的植物几丁质酶基因或 ? 被克隆 某些基因已被成功地导入植物中 成为抗病育种中的重要基因源?几丁质是昆虫表皮独特的组份 昆虫蜕皮时约有 的几丁质被降解≈ 因此 昆虫几丁质及其水解酶对昆虫的生长!发育起重要的作用 人们对它的重视也由来已久 但在总体研究水平上要落后于植物几丁质酶?进入 年代后 由于相关知识和精密技术不断被引入昆虫学领域 人们对昆虫几丁质酶的物理学!化学!动力学和基因调控特点 以及作为生物农药的发展潜力≈ 主要是在植物抗虫性方面的研究正在不断地探索 并取得了实质性进展?本文将综述该领域有关方面的主要研究进展? 1昆虫几丁质酶的生理学功能 昆虫的蜕皮和变态机制一直是昆虫生理学家研究的重点 早在 年 的一篇专题论文中有关家蚕Βομβψξμορι解剖学问题中就首次描述过蜕皮液 但人们对蜕皮液的功能认识很模糊 甚至有观点认为它主要用于贮存和释放营养物质≈ ?直到进入 世纪后才逐渐明确蜕皮液的功能是昆虫在蜕皮前用于消化旧的表皮? 昆虫周期性地蜕去旧表皮并合成新表皮 这一复杂的过程是由旧表皮和表皮层之间累积的蜕皮液中几丁质酶的精确滴度调节的 需要多种类型酶的参与 每种酶又具有多种异构形式?现已明确的有两种类型的几丁质水解酶?将从内部裂解 ≤多聚链的酶被称作几丁质酶 ∞≤ 从链的非还原性末端依次切下 ≤单体的酶为Β) )乙酰葡萄胺酶 ∞≤ ? ∏ 和 ≈ ? 以烟草天蛾Μανδυχασεξτα为模式昆虫 建立的二元酶系统模型较合理地解释了几丁质的水解机制?首先 不溶性的几丁质被几丁质酶随机裂解为寡糖 这些可溶性的寡糖即成为Β) )乙酰葡萄胺酶的底物 从链末端依次切下几丁质二糖 释放出 ≤ 2 ≤最终又被循环利用参与新表皮的形成?同时研究发现 这两种酶在分解几丁质中还具有较强的增效活性?几丁质酶和Β) )乙酰葡萄胺酶以适宜比例混合 分解几丁质的速度是二者单独作用速度总和的 倍? 除昆虫表皮外 在其肠道组织中也检测到几丁质酶的活性?肠道几丁质酶具有分解肠道内和围食膜中的几丁质及消化的功能?昆虫蜕皮过程完成后 肠道几丁质酶能够将蜕皮消化参与合成新的围食膜≈ ? 昆虫蜕皮机制问题的解决 促进了昆虫蜕皮液的生理学和生物化学的发展 其中最主要的几丁质酶和Β) )乙酰葡萄胺酶已被分离纯化 得到 ? 克隆 并有可能用于植物抗虫性的转基因育种研究中? 2昆虫几丁质酶的基因结构及表达 2 1昆虫几丁质酶基因的结构 昆虫几丁质酶基因的研究最早见于烟草天蛾? 年 等≈ 分离得到编码烟草天蛾几丁质酶基因的全长 ? 克隆 并进行了序列分析? 由 个核苷酸组成 可译框架含 个核苷酸 起始密码子 × 在 位 终止于 位 所编码的蛋白为 个氨基酸残基 分子量为 ??其 χ)端非翻译区含有 个核苷酸 # # 昆虫知识∞ × ≤ ? ∞? ∞
脂肪酶
脂肪酶的应用进展综述 09生物技术0902021040 陈莹莹 摘要：脂肪酶被认为是工业中很重要的一利酶。本文概述了当前研究中广泛使用的脂肪酶及其固定化产品的应用途径, 包括在食品加工、饲料、纺织、医药、生物柴油和传感器等领域中的应用。脂肪酶应用的主要障碍是其成本高。但技术进步尤其是基因技术的发展有望使成本降低, 脂肪酶在药物合成中的应用在本文中也作了展望。 关键词：脂肪酶；性质；生产；来源，应用 脂肪酶（Triacylglycerol lipase E C3.1.1.3）是广泛存在的一种酶，在脂质代谢中发挥重要的作用。在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯键水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。脂肪酶反应条件温和，具有优良的立体选择性，并且不会造成环境污染，因此，在食品、皮革、医药、饲料和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用。 一、脂肪酶的来源 脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富(Pandey等)。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。 二、脂肪酶的性质 脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等(Hara；Schmid)。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。 脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同(V eeraragavan等)。总
昆虫的体壁和几丁质酶
几丁质酶 几丁质酶是以几丁质为作用底物的水解酶。在昆虫中，几丁质是围食膜及体壁的主要组成成分之一，通过几丁质酶对其有规律地降解以保证昆虫正常生长发育。若编码该酶的基因在不适当的时候表达或该表达时未表达，都会对昆虫造成伤害。在植物害虫防治中，昆虫几丁质是几丁质酶的一个极具吸引力的作用靶标。 1.1昆虫几丁质酶生物化学与生理作用 昆虫几丁质酶存在于中肠、蜕皮腺及某些昆虫的毒腺中，是一种糖蛋白,可以水解昆虫体壁和中肠中的几丁质，酶切位点通常随机发生在链中间的任何一个部位，其最终产物是可溶低分子量的GlcNAC寡聚物。昆虫蜕皮时约有90%的几丁质被降解，几丁质酶和几丁质之间的作用是一种动态过程，包括经过几丁质结合区的吸附过程、水解过程、解吸附作用及活性催化区在作用底物表面的配置过程。昆虫几丁质酶分泌到肠道中,以无活性酶原形式存在，在需要时被胰蛋白酶激活而降解围食膜。蜕皮腺中的几丁质酶可调节昆虫的周期性蜕皮并合成新表皮。毒腺中的几丁质酶有助于毒腺物质在取食对象的组织中扩散渗透。 1.2昆虫几丁质酶基因的体内表达 昆虫几丁质酶的表达受蜕皮激素的诱导，而保幼激素抑制其表达。有研究表明，在没有几丁质酶基因表达的虫期,蜕皮激素类似物能够诱导云杉卷叶蛾几丁质酶基因的表达，在诱导36h后表达量最大，且几丁质酶基因仅在体壁表达，这种现象可能是因为诱导表达是一种间接表达，需要某些只在体壁才具有的因子参与。在昆虫生长发育过程中，几丁质酶表达具有组织特异性。 影响昆虫几丁质酶活性因素主要有温度、pH、紫外线等因子均可影响昆虫几丁质酶的活性。昆虫几丁质酶pH范围较宽，使其能在微酸(血淋巴)和微碱性环境(内脏)中起作用。昆虫几丁质酶在pH为4~8范围内具有活性，在30~60℃之间昆虫几丁质酶活性较高且较久。底物不同时，昆虫几丁质酶表达的适宜pH、温度也不尽相同。pH值对昆虫几丁质酶活性的影响，可能是因为昆虫几丁质酶在多区结构及氨基酸序列方面的不同造成的。某些二价阳离子也影响昆虫几丁质酶的活性。 对昆虫几丁质酶的利用，包括使昆虫体内的几丁质酶水平低于或高于正常水平两个方面，从而扰乱昆虫正常的生长发育节律，甚至使昆虫死亡。Blattner-R
脂肪酶综述
脂肪酶综述 摘要：脂肪酶是一类能够催化酯的水解反应以及在非水相体系中催化脂肪酸和醇类发生酯化反应的酶类。随着酶学技术的快速发展，微生物脂肪酶也受到了越来越多的关注作为生物催化剂，脂肪酶一直以来都是生物技术领域中最重要的一类酶。 关键字：脂肪酶，酶活测定，非水相，食品工业应用。 简介：脂肪酶(三酰甘油酯水解酶，EC 3.1.1.3)，是一类广泛存在于多种微生物中的生物催化剂。脂肪酶最早被发现可追溯至1901年，其天然作用底物为三脂酰甘油酯，能够将酯键水解，释放甘油二酯甘油一酯甘油以及游离脂肪酸随着非水酶学的发展，研究者发现，脂肪酶在非水相中能够催化酯化。酯交换以及转酯化反应，并且具有高度的选择性和专一性，已广泛应用于食品、医药、洗涤剂等行业。特别是在食品行业中得到了大量的应用，并逐渐成为食品领域中应用最为广泛的酶类之一。但是，由于目前脂肪酶相对于传统的化学催化剂的生产成本仍然偏高，这是制约脂肪酶工业化应用的主要问题，因此，在了解脂肪酶催化特性的基础上，通过筛选高产菌株，或者改变脂肪酶催化环境等方法提高脂肪酶的产率和利用率，降低利用脂肪酶进行工业化生产的成本是目前急需解决的主要问题。 1、脂肪酶的结构特点 研究表明, 来源不同的脂肪酶,其氨基酸组成数目从270~ 641不等,其分子量为29 000~ 100 000。迄今为止,人们已经对多种脂肪酶进行克隆和表达,并利用X -衍射等手段和定向修饰等技术测定了酶的氨基酸组成、晶体结构、等电点等参数, 确定了组成脂肪酶活性中心的三元组( triad)结构。多数脂肪酶都是单链蛋白, 比如CCL( A) 含有534个氨基酸残基, 其组成3 个小的和11个大的β-折叠及10个α-螺旋。其催化活性三元组由Ser-209、His-449和Glu341组成, Ser-209处于超二级结构折叠-螺旋[β-折叠( 202~208)-α -螺旋( 210~220) ]的转角处。多数成熟的天然蛋白还含有糖类组分, 如CCL( A) 含有4. 2%葡萄糖、甘露糖和木糖等,所以实际测得的分子量比理论分子量偏大[157 223(理论) , 60 000(实测)]。 脂肪酶通过与水/底物界面的相互作用来获得不同的构象状态。在关闭构象状态时“盖子”覆盖在酶的活性位点上。酶难以靠近底物分子而转变到开放构象状态时，催化通道入口打开. 近年来发现“盖子”的作用不仅仅是调节底物靠近活性位点的大门。“盖子”是两性分子结构在关闭状态酶的结构是亲水端面对溶剂，疏水端朝向蛋白质的内部，当酶转变到开放状态时疏水端会暴露出来隐藏亲水残基团，在丝氨酸残基周围形成亲电子域引起脂肪酶的构象改变增加了酶与脂类底物的亲和性，并稳定了催化过程中过渡态中间产物。酶分子周围通常保留一定量的水分，从而保证了脂肪酶在油/水界面和脂相中的自体激活。 2、脂肪酶的来源 脂肪酶是一种普遍存在于生物体的酶类，具有重要的生理学意义，同时也具有工业化应用的潜在可能性脂肪酶能够催化三酰甘油酯水解成为甘油和游离脂肪酸，而在有机相中，脂肪酶则催化酯化酯交换以及转酯化反应。在真核生物体内，脂肪酶参与许多类脂化合物的代谢过程，包括脂肪的消化、吸收、利用以及脂蛋白的代谢，在植物中，脂肪酶存在于储存能量的组织中。脂肪酶在微生物界分布很广，大约65 个属微生物可产脂肪酶，其中细菌有28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属，但实际上微生物脂肪酶分布远远超过这个数
嗜热微生物的研究进展及应用
嗜热微生物的研究进展及应用 宜春学院化学与生物工程学院03生物教育张志刚 指导老师：姜琼 摘要嗜热微生物是一类最适生长温度高于45?C的微生物，嗜热酶是从嗜热微生物中分离得到的一类热稳定性酶，由于嗜热酶分子内部有很多氢键、二硫键及紧密而有韧性的空间结构的存在，所以嗜热酶在高温条件下具有很强的稳定性，高温反应活性，以及对有机溶剂、去污剂和变性剂的较强抗性，嗜热酶在许多方面都有广泛的应用。当前获得嗜热酶的方法主要有：直接从嗜热微生物中提取、利用基因工程技术在中温宿主中表达和利用定向分子进化技术筛选。目前酶的纯化主要采用层析法、高效液相色谱法和电泳法等方法。由于环境恶化,能源危机,全球变暖等原因, 嗜热酶的开发和应用将出现更加诱人的前景。 关键词嗜热微生物；嗜热酶；嗜热机制；应用 Thermophilic microorganism research progress and application Zhang Zhigang College of Chemistry and Bioengineering, Bioengineering (Biology education), YiChun University Advisor: Jiang Qiong Abstract Thermophilic microorganisms is a type of microorganisms that the most suitable growth temperature is above 45?C,the thermophilic enzyme is a type of a thermostable enzyme separated from the thermophilic microorganism, because there is a lot of hydrogen keys and two-sulphur keys in the thermophilic enzyme molecule, so the thermophilic enzyme have a very strong stability in the hot condition, as well as there is a stronger fastness to organic solvent、eradicator and denaturant,the thermophilic enzyme have an extensive application in many fields.The method which obtained the thermophilic enzyme includes three kinds at present: distilled directly from the thermophilic microorganism, expressed in the mild host making use of a genetic engineering technique and sieved with the directional molecule evolution technique. At present the enzyme purification methods are:chromatography、HPLC and electrophoresis. Due to the cause of worsening environment, energy crisis,warmer weather, the development and application of the thermophilic enzyme will appear more captivating foreground. Keywords Thermophilic microorganisms; Thermophilic enzyme; Thermophilic mechanism; Application 最适生长温度高于45?C的微生物称为嗜热微生物，是在高温环境下生存的一类微生物，它们有其自己的适应机制和特定的新陈代谢能力，具有独特的基因类型、特殊的生理机制及代谢产物，是地球上的边缘生命形式。嗜热酶是从嗜热微生物中分离得到的一类热稳定性酶，具有化学催化剂无法比拟的优点，尤其是在高温条件下保持极好的稳定性，使很多高温化学反应得以实现从而将极大的促进生物技术产业的发展。近年来，人们已从嗜热微生物中分离得到多种嗜热酶。今后，还应继续在嗜热酶的结构与功能、应用等方面作深入而全面的研究。本文主要对嗜热酶的研究进展及应用作一综述。 1 嗜热微生物的分类及其酶的种类和特点 1.1 嗜热微生物的分类 嗜热微生物是一类生长温度跨度在40～150℃之间的微生物,它可分为轻度嗜热(最适生长温度低于60℃)、中度嗜热(最适生长温度低于85℃) 和极度嗜热(最适生长温度大于85℃) ,主要分布于地热环境
产几丁质酶的筛选及活力测定
产几丁质酶的筛选及活力测定 一、实验材料 1.菌种：白僵菌，或其他菌种及土壤采样等(菌种接种于PDA斜面上，28℃，80％RH 培养14 d后分别置于4℃和20℃备用。) 2.试剂：DNS试剂:（称取3，5-二硝基水杨酸3．15 g，加水500 mL。，搅拌5 s，水浴至45。然后逐步加入100 mL 0．2g/mL的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌。直到溶液清澈透明(注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃)。再逐步加入四水酒石酸钾钠91．0 g苯酚2．5 g和无水亚硫酸钠2．5 g。继续45"C水浴加热，同时补加水300 mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000 mL。用烧结玻璃过滤器过滤，取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7 d后可以使用。) 几丁质酶基础培养基(g／L)：葡萄糖5．09，蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，FeS04·2H20 0．1 g，pH 7．0。 几丁质酶诱导培养基(g／L)：蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，ZnS04·7H202 0．01 g，胶体几丁质10 ml，pH 7．0。（胶体几丁质固体培养基。0.5 g K2HPO4，0.5 gKH2PO4，0.5 g MgSO4·H2O，0.1 g FeSO4·7H2O，0.1 gZnSO4·7H2O 500 ml 1%胶体几丁质，500 ml蒸馏水，15 g 琼脂，pH7.2，121℃灭菌15 min，冷却至50℃左右倒平板） 马铃薯培养基(PDA)；去皮的马铃薯200 g切块，沸水煮30 min，纱布过滤，20 g蔗糖，209琼脂，加热至全部溶解，定容至1 L。
固定化酶的研究进展
固定化酶的研究进展 固定化酶是20世纪60年代发展起来的一项新技术。最初主要是将水溶性酶与不溶性体结合起来，成为不溶于水的酶衍生物，所以曾叫过“水不溶酶”和“固相酶”。但是，后来发现，也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出。在这种情况下，酶本身仍是可溶的，只不过被固定在一个有限的空间内不能再自由流动。因此，用水不溶酶或固相酶的名称就不再恰当。在1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”的名称[1]。 一固定化酶的发展历程[1] 酶参与体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变换。作为一种生物催化剂，酶可以在常温常压等温和条件下高效地催化反应，一些难以进行的化学反应在酶的催化作用下也可顺利地进行反应，而且反应底物专一性强、副反应少等优点大大促进了人们对酶的应用和酶技术的研究。近年来，酶被人们广泛应用于食品生产与检测、生物传感器、医药工程、环保技术、生物技术等领域。 1916年美国科学家NELSON和GRIFFIN最先发现了酶的固定化现象；直到20世纪50年代，酶固定化技术的研究才真正有效地开展；1953年，德国科学家GRUB-HOFER 和SCHLEITH首先将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶等与上述载体结合制备固定化酶；到20世纪60年代，固定化技术迅速发展；1969年日本千畑一郎利用固定化氨基酰胺酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸，是世界上固定化酶大规模应用的首例；在1971年的第一届国际酶工程会议上，正式建议使用固定化酶(mimobilizedenzyme)这个名称。我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是中国科学院微生物所和上海生化所的酶学工作者同时开始了固定化酶的研究工作 二固定化酶的特点[2] [3] 固定化酶具有许多优点：极易将固定化酶与底物、产物分开；可以在较长时间内进行分批反应和装柱连续反应；在大多数情况下，可以提高酶的稳定性；酶反应过程能够加以严格控制；产物溶液中没有酶的残留，简化了提取工艺；较水溶性酶更适合于多酶反应；可以增加产物的收率,提高产物的质量；酶的使用效率提高，成本降低。但是，固定化酶也有其不足之处，如固定化时，酶活力有损失；增加了固定化的成本，工厂开始投资大；只能用于水溶性底物，而且较适用于小分子。 三固定化酶固定化方法[3] [4] 由于所固定的酶或细胞的不同，或者固定的目的及固定用的载体的不同，使固定化方法大相径庭。根据固定的一般机理，可将之分为如下几种方法。酶的固定化方法有：
产脂肪酶的微生物研究进展
产脂肪酶细菌的筛选与鉴定 姓名：范丽萍学号：0911040203 班级：生09级6班 前言 1.脂肪酶的简介 脂肪酶(Lipase，EC3．1．1．3，甘油酯水解酶)是分解脂肪的酶u J。在动植物体和微生物中普遍存在，它是一类特殊的酯键水解酶，催化如下反应：甘油三酯+水=甘油+游离脂肪酸。它的另一重要特征是只作用于异相系统，即在油(或脂)一水界面上作用，对均匀分散的或水溶性底物无作用即使作用也极缓慢，因此脂肪酶也可说是专门在异相系统或水不溶性系统的油(脂)一水界面上水解酯的酶。 2.微生物产脂肪酶的研究历程 脂肪酶是最早研究的酶类之一(见表1)。从1834年兔胰脂肪酶活性的报道至如今的微生物脂肪酶已有上百年的历史。微生物发酵法的应用前景要远远大于提取法及化学合成法。如今，黑曲霉、白地霉、毛霉等微生物来源的酶已制成结晶。根霉、圆柱假丝酵母、德氏根霉、多球、，粘质色杆菌等也得到高度提纯，并对它们的理化性质[1]开展进一步研究。早在60年代，假丝酵母[2]、曲霉、根霉等菌产生的脂肪酶相继在日本进入商品生产(见表2)。我国60年代也已开展脂肪酶的研究开发。1967年，中科院微生物所筛选到解脂假丝酵母(Candida lipolytica)AS2．1203并于1969年制成酶制剂供应市场。 表1 常见的产脂肪酶的徽生物 菌名 黑曲霉荧光假单胞菌 白地霉无根根霉 毛霉圆柱假丝酵母 巢子须霉德氏根霉 多球菌棉毛状酶 圆弧青霉粘质色杆菌 表2 常见商品酶 enzyme abbreviation manufacturer Candida cylindraces CC Sigina,amano Aspergillus niger AN Amino,fluka Rhisopus delemar RD amano 就微生物脂肪酶而言，虽然在产酶菌株选育、培养条件、酶的性质及工业应用上已研究了几十年，但由于脂肪酶的结构及性质的多样性、酶的不稳定性、底物的水不溶性、酶的来源不足、提纯困难以及应用范围不广泛等问题，脂肪酶的研究进展及工业应用与蛋白酶、淀粉酶相比要慢得多，窄得多。因此在微生物产脂肪酶方面还有很大的研究空间，本实验主要就是通过对微生物的培养，筛选出产脂肪酶活力高的细菌。 3.微生物产脂肪酶的用途
产酶海洋微生物的筛选
产酶海洋微生物的筛选 前言：浩瀚的海洋是地球生命的摇篮，它覆盖着地球表面积的71%，海水总体积占地球总水量的97%。全球80％以上的物种蕴藏于海洋中，由于独特的生存环境（如高压、高渗、高温、低温等复杂多变的生态环境）及海洋生物物种间的生态作用远比陆生物种复杂和广泛，因此赋予海洋生物均活性远比陆生生物要强，尤其重要的是有些海洋生物活性物质的结构与陆生生物化合物不同，表现出独特的活性，作为产酶资源就具有了突出的特点和优势。人们从海洋环境中已经分离的到各种极端酶，如嗜冷酶、嗜热酶、嗜压酶、嗜盐酶等，由于具有广泛的适应性，在生物技术和工业应用中已担任了重要的角色。 1 材料与方法 1.1样品采集 从连云港海域采集 1.2培养基 1.2.1细菌培养基 蛋白胨5g，酵母粉1g，琼脂20g 陈海水1000ml，pH 7.4-7.6 1.2.1.1细菌富集培养基 将1.2.1的细菌培养基去掉琼脂 1.2.1.2产淀粉酶细菌筛选培养基（初筛） 将1.2.1的细菌培养基加入2%的可溶性淀粉 1.2.1.3产右旋糖酐酶的细菌筛选培养基（初筛） 将1.2.1的细菌培养基加入1%的右旋糖酐 1.2.1.4产淀粉酶发酵培养基（复筛） 将1.2.1.2的培养基去掉琼脂 1.2.2放线菌培养基 可溶性淀粉20g，NaCl 0.5g，MgSO4?H2O 0.5 g, KNO3 1 g，K2HPO4 0.5g，FeSO4 0.01 g，琼脂20 g ，陈海水1000mL，pH7.4～7.6。 注：在制备平板时培养基融化后加入：重铬酸钾80mg?/L 1.2.3真菌培养基 马铃薯去皮，取200g切成小块，加50%陈海水煮沸30min，4-6层纱布过滤，加20g葡萄糖，琼脂20g，溶化后再用陈海水定容至1000mL ，pH7.2～7.4。注：在制备平板时培养基融化冷却至60℃后加入：青霉素50mg?/L，链霉素50mg?/L 1.3菌株筛选方法 将样品分别放入四类微生物富集培养基中，25℃，180rpm, 培养48h。然后将富集培养基10倍递增稀释，取适宜稀释倍数的培养液涂布于3种培养基琼脂平板中，25℃培养（培养时间由菌生长情况而定）。将培养出的菌落进行分离培养，将纯的单菌落进行斜面保藏。 1.4产酶菌株的筛选 将菌株分别点种到产酶筛选培养基中，25℃，培养72h。于淀粉酶筛选平板
1293462556几丁质酶
几丁质酶(chitinase)是以几丁质(chitin)为作用底物的水解酶。几丁质又称甲壳素或甲壳质,存在于节肢动物、线虫和软体动物的体壁、真菌细胞壁(除卵菌)和一些藻类等生物的细胞壁中。在昆虫中,几丁质是围食膜及体壁的主要组成成分之一,通过几丁质酶对其有规律地降解以保证昆虫正常生长发育。如果编码该酶的基因在不适当的时候表达或该表达时未表达,都会对昆虫造成伤害。由于植物中不含几丁质,因此在植物害虫防治中,昆虫几丁质是几丁质酶的一个极具吸引力的作用靶标。 一、昆虫几丁质酶生物化学与生理作用 昆虫几丁质酶存在于中肠、蜕皮腺及某些昆虫的毒腺中,是一种糖蛋白,可以水解昆虫体壁和中肠中的几丁质,酶切位点通常随机发生在链中间的任何一个部位,其最终产物是可溶低分子量的GlcNAC寡聚物。昆虫蜕皮时约有90%的几丁质被降解,几丁质酶和几丁质之间的作用是一种动态过程,包括经过几丁质结合区(CBD)的吸附过程、水解过程、解吸附作用及活性催化区在作用底物表面的配置过程。昆虫几丁质酶除能降解几丁质外,还担负许多重要生理功能,如昆虫肠道组织中的几丁质酶具有分解肠内和围食膜的几丁质和消化作用。昆虫几丁质酶分泌到肠道中,以无活性酶原形式存在,在需要时被胰蛋白酶激活而降解围食膜。蜕皮腺中的几丁质酶可以调节昆虫在生长发育中周期性蜕皮并合成新表皮。毒腺中的几丁质酶有助于毒腺物质在取食对象的组织中扩散渗透。 二、昆虫几丁质酶分子特征 1993年,编码昆虫几丁质酶的cDNA序列首次从烟草天蛾Manduca sexta中克隆出来。目前已克隆得到烟草天蛾、家蚕Bombyx mori和美国白蛾Hyphantria cunea等十几种昆虫的几丁质酶cDNA序列。这些克隆的基因主要集中在鳞翅目昆虫中,双翅目、鞘翅目和膜翅目仅有少数几丁质酶基因被克隆的报道。昆虫几丁质酶分子量在40~85kDa之间,比植物几丁质酶(25~40kDa)和细菌几丁质酶(20~60kDa)大。酶活性范围为pH4~8,等电点在5~7之间,大都属于18家族几丁质酶。昆虫几丁质酶为多结构域蛋白,一般都包含信号肽区、一个或多个N-端催化区、富含丝氨酸和苏氨酸(S/T)的糖基化位点区(linker区)、一个或多个fibronectin-like区和C-端富含半胱氨酸(Cys)的几丁质结合区(CBD)。但不同昆虫的几丁质酶,其多区结构有所不同,如一种寄生蜂Chelonus sp.的几丁质酶大小为52kDa,有一个富含丝氨酸和苏氨酸的区域,但缺少C-端富含半胱氨酸的区域。这些结构域构成上的变化以及氨基酸序列的不同导致了昆虫几丁质酶在最适pH、催化活性、对几丁质的亲合力及稳定性方面的差异。昆虫几丁质酶的多个结构区独自发挥功能,互不影响,其中N-端催化区序列具有保守性,决定酶的催化活性。连接N-端催化区和几丁质结合区的linker区,是经过O-位高度糖基化修饰,而催化区只是适度的N-位糖基化修饰,linker区使几丁质酶易于分泌到细胞外,并且在有蛋白水解酶存在的情况下,保持几丁质酶的稳定性。几丁质结合区(CBD)基本功能是使几丁质酶结合不溶性的底物并提高降解效率。具有多个CDB区时,能增强昆虫几丁质酶对大分子不溶底物的结合能力及作用活性,提高催化区在水解不溶性底物时的催化效率,linker区也可能影响碳水化合物结合区的功能。昆虫几丁质酶的CBD约为65个氨基酸,且不同的昆虫几丁质酶CBD序列有高度的相似性,其中6个Cys最为保守,存在于所有昆虫几丁质酶的CBD中。研究表明, 几丁质酶的活性仅与活性催化区有关,而昆虫几丁质酶与体壁和中肠几丁质的相互作用依赖于几丁质结合区和活性催化区同等、共同的作用。昆虫几丁质酶中有几个重要的氨基酸残基保守位点:W145,D144,E146和D142。W145维持几丁质酶催化区域结构,对酶的催化活性产生重要影响。如以甘氨酸替代则活性完全丧失,但是W145对几丁质酶与几丁质之间的结合并不是必需的。E146在水解中起酸碱催化剂的作用,D144维持一种电离平衡,D142影响几丁质酶最适pH值,该位点的突变可使几丁质酶最适PH由碱性变为酸性。三、昆虫几丁质酶基因的体内表达 昆虫几丁质酶的表达受蜕皮激素的诱导,而保幼激素抑制其表达。研究表明,在没有几丁
产几丁质酶酵母菌的筛选与鉴定
第35卷第8期东 北 林 业 大 学 学 报Vol.35No.8 2007年8月JOURNAL OF NORT HE AST F ORESTRY UN I V ERSI TY Aug.2007 产几丁质酶酵母菌的筛选与鉴定1) 惠丰立 冯金荣 杨柯金 文祯中 (南阳师范学院,南阳,473061) 摘 要 从番茄果实表面筛选到1株产几丁质酶酵母菌株CY-6,该菌株产生的几丁质酶对番茄镰刀菌果腐 病菌(Fusarium oxysporum)有较强的抗菌活性并具有较广的抗菌谱。形态及生理生化特征测定结果表明:菌株CY- 6与伊萨酵母属(Issatchenkia)中的陆生伊萨酵母(I.terricola)种的特征基本一致;测定了该菌株的26S r DNA D1/ D2区域序列并根据26S r DNA构建了系统发育树;在系统发育树中,菌株CY-6与陆生伊萨酵母形成一个类群, 序列同源性高达99.6%。因此,将菌株CY-6鉴定为陆生伊萨酵母。 关键词 菌株CY-6;几丁质酶;26S r DNA;系统发育 分类号 S476 Screen i n g and I den ti f i ca ti on of Ch iti n a se2Produc i n g Y ea st/Hui Fengli,Feng J inr ong,Yang Kejin,W en Zhenzhong (College of L ife Science and Technol ogy,Nanyang Nor mal University,Nanyang473061,P.R.China)//Journal of Northeast Forestry University.-2007,35(8).-66～67,70 A chitinase2pr oducing yeast is olate CY26was screened fr o m the surface of t o mat o fruits.The chitinase pr oduced by strain CY26could str ongly inhibit the gr o wth of Fusariu m oxysporu m and exhibited inhibiti on against a wide2range of p lant pathogenic fungi.Mor phol ogical,physi ol ogical and bi oche mical characteristics of strain CY26sho wed that the characteristics of strain CY26 were essentially consistent with those of Issatchenkia terricola.The analysis of26S r DNA D1/D2do main sequence fr o m strain CY26suggested that strain CY26was clustered t ogether with I.terricola in the phyl ogenetic tree,and the sequence identity be2 t w een strain CY26and I.terricola was99.6%.The result indicates that strain CY26bel ongs t o I.terricola. Key words Yeast CY26;Chitinase;26S r DNA;Phyl ogenetic analysis 果蔬采后的病害主要由病原真菌引起[1]。长期以来,使用化学合成杀菌剂一直是控制果蔬采后病害发生的主要手段之一,但是随着人类对食品安全、环境保护和克服有害生物抗性等问题的日益重视,化学杀菌剂的使用正受到越来越严格的限制[2-3]。因此,研究和开发控制果蔬采后病害的新方法,对于降低腐损率、控制农残量、确保食用安全和提高产品国际竞争力具有十分重要的意义。 几丁质酶(Chitinase,Ec.3.2.14)被普遍认为是一种与重寄生、抗病防卫反应有关的酶类,许多拮抗菌通过产生几丁质酶来降解病原菌细胞壁[4]。因此,几丁质酶产生菌在果蔬采后病害防治方面有巨大的应用潜力。近年来,酵母菌分泌的胞外几丁质酶在果蔬采后病害生物防治中的作用已引起人们的重视。范青等人[5]利用膜毕赤酵母(Pichia m e m branefaciens Hansen)和季也蒙假丝酵母(Candida guillier m ondii)防治桃采后的真菌病害,发现这2种酵母菌产生的几丁质酶对桃软腐病菌(Rhizopus stolonifer(Ehrenb:Fr)Vuill)孢子萌发有明显的抑制作用。本研究从番茄果实表面分离筛选到1株产几丁质酶酵母菌株CY-6,该菌株产生的几丁质酶对番茄镰刀菌果腐病菌(Fusarium oxysporum)有较强抑制作用,并对其进行了形态、生理生化鉴定及基于26S r DNA序列的系统发育分析。 1 材料与方法 菌株CY-6是从番茄果实表面分离得到;番茄镰刀菌果腐病菌(Fusarium oxysporum)及其供试病原菌由本实验室分离保存。 1)河南省自然科学基金项目(0411032300)。 第一作者简介:惠丰立,男,1965年7月生,南阳师范学院生命科学与技术学院,教授。 收稿日期:2006年10月17日。 责任编辑:潘 华。 固体几丁质培养基:胶状几丁质15.0g、酵母粉5.0g、(NH 4 ) 2 S O41.0g、M gS O4?5H2O0.3g、KH2P O41.36g、H2O 1L,pH为4.5;液体几丁质培养基:固体几丁质培养基不加琼 脂;P DA培养基:马铃薯200g、葡萄糖15g、琼脂13g、H 2 O1mL。 菌株的分离筛选:从市场上购买新鲜的苹果、梨、桃、番茄等水果样品,分别取果皮组织5g,加入45mL液体几丁质培养基中,28℃180r/m in振荡培养48h。取0.1mL稀释一定倍数的稀释液均匀涂于固体几丁质平板上,28℃培养6d后,挑取具有明显透明圈的菌株纯化,置于4℃保存。将初筛菌株接种于50mL液体几丁质培养基中,28℃180r/m in摇瓶发酵72h后,测定发酵液几丁质酶活力。 几丁质酶活性测定:参照Ant oni o和Masarus方法[6-7]。1mL胶体几丁质与稀释的1mL酶液放于50℃水浴保温1h,上清液中的还原糖按DNS法测定。一个酶活力单位定义为每小时释放相当于100μg N-乙酰氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量。 酶抗菌活性测定:采用打孔法[8]。将供试病原菌接种于直径为9.0cm的P DA平板上,28℃培养2～4d,在菌苔周围1.0cm处打3个孔(d=0.5cm),孔中加入50μL质量浓度分别为100、200mg/L的几丁质酶,对照以等量的无菌水代替,继续培养2～3d,观察抑菌情况。 形态和培养特征:参照微生物学实验手册[9]对菌株CY-6进行形态和培养特征观察。 生理生化特征:参照微生物学实验手册和酵母菌的特征与鉴定手册[9-10],对菌株CY-6进行糖发酵、碳源同化、氮源同化、无维生素培养基生长等生理生化鉴定。 26S r DNA序列分析:参照白逢彦等方法[11]提取菌株CY-6基因组DNA,用引物NL1(5’-GCA T AT C AA T AA GCG G AGG AA AAG-3’)和NL4(5’-GGT CCG TGT TTC AAG
微生物脂肪酶应用及研究进展
微生物脂肪酶应用及研究进展 摘要微生物脂肪酶主要来源于真菌和细菌，它是一类能够催化酯的水解反应以及在非水相体系中催化脂肪酸和醇类发生酯化反应的酶类。因其具有高底物专一性、区域选择性和对映选择性，而被广泛应用。本文主要论述了脂肪酶的结构、脂肪酶的理化性质以及脂肪酶在食品行业、医药工业、纺织和化工工业方面的应用，并对其未来的发展进行了展望。 关键词脂肪酶，酯化，应用，研究进展 Progress in research and application of microbial lipase Abstract Microbial lipases are mainly derived from fungi and bacteria, it is a kind of can catalyze hydrolysis of ester and enzyme catalyzed esterification of fatty acids and alcohols in non aqueous system. Because of its high substrate selectivity, regioselectivity and enantioselectivity, and is widely used. This paper mainly discusses the structure, properties and application of lipase in food industry, medicine, industry, and the future of its development was prospected. Key words lipase, esterification, application, research progress of 脂肪酶( EC 3.1.1.3) 又称三酰基甘油酰基水解酶，广泛存在于动植物和微生物体内。脂肪酶不仅可水解三脂酰甘油生成二脂酰甘油和脂肪酸（其中的二脂酰甘油可进一步被水解为一脂酰甘油、甘油和游离脂肪酸），并且能催化水解反应的逆反应——酯化反应(张数政，1984)。目前脂肪酶生产主要有提取法和微生物发酵法。由于微生物脂肪酶种类多，作用温度及范围比动植物脂肪酶广、底物专一性高，并且便于工业生产和获得较高纯度的酶制剂，因此微生物脂肪酶已成为工业生产脂肪酶的主要来源，关于脂肪酶在工业应用的研究也越来
几丁质酶活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法
几丁质酶活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 货号：BC0820 规格：50T/24S 产品内容： 提取液：液体80mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体40mL×1瓶，4℃保存，使用前摇匀。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。 标准品：粉剂×1瓶。5mg N-乙酰氨基葡萄糖，4℃保存。临用前加入2.27mL蒸馏水配成10μmol/mL 的标准溶液。 产品说明： 几丁质酶主要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨)，以及真菌类的细胞壁中。而几丁质酶(EC3.2.1.14)可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的作用，成为抗真菌病害的研究热点。 几丁质酶水解几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖，进一步与3,5-二硝基水杨酸产生棕红色化合物，在540nm 处有特征吸收峰，吸收值增加速率反映了几丁质酶的活性。 自备实验用品及仪器： 天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取 1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.15g组织，加入1.5mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后10000pm，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。 2.真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议750万细胞加入1.5mL 第1页，共3页
提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min）；然后12000rpm，4℃，离心20min，取上清置于冰上待检。 3.培养液：直接测定。 二、测定操作表： 1、可见分光光度计预热30min。波长调至540nm，蒸馏水调零。 2、将标准溶液稀释为4、 3、2.5、2、1μmol/mL的标准溶液备用。 3、在EP管中分别加入： 试剂名称测定管对照管标准管空白管 样品（mL）0.50.5--标准溶液（mL）--0.5- 蒸馏水（mL）---0.5 试剂一（mL）0.5-0.50.5 混匀，37℃水浴1h，沸水浴5min。 试剂一（mL）-0.5-- 8000rpm常温离心10min，分别取上清液0.8mL于新的EP管中。 试剂二（mL）0.20.20.20.2 混匀，沸水浴反应10min，立即置于冰上至室温。测定每管在540nm下的吸光度，记为A测定管、A 对照管、A标准管、A空白管。计算ΔA测定=A测定管-A对照管，ΔA标准=A标准管-A空白管。 三、计算公式 1、标准曲线的绘制： 以ΔA标准为y轴，标准溶液浓度为x轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b。将ΔA测定带入标准方程中，得到x（μmol/mL） 2、几丁质酶活的计算： （1）按照样本重量计算 酶活性定义：37℃下，每g组织每小时分解几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。 几丁质酶活性（U/g鲜重）=x×V样÷（V样÷V样总×W）÷T=1.5×x÷W。 第2页，共3页