测序级胰蛋白酶,质谱方法——肽图分析
还原肽图样品处理（HPLC/UPLC/MAS）
(1)将样品用超纯水稀释到4-5g/L，涡旋混匀，然后用6M盐酸胍，0.1mol/L Tris,Ph8.3溶液
或6M盐酸胍，0.1M碳酸氢铵（AMBIC）(pH约为8.0)将样品稀释至2mg/ml,涡旋混匀。
（盐酸胍终浓度3-3.8M）
(2)取稀释好的样品500ml于EP管中，加入0.5MDTT溶液5ml，涡流混匀，37℃水浴锅中
水浴1.5-2.5h。（DTT终浓度5mM）
(3)水浴完成后加入0.5M IAM溶液13ul，室温避光反应45min。（IAM终浓度为13mM）
(4)取烷基化后的样品400ul加入到3KDa超滤离心管中，4℃，12000rpm，离心99min。
(5)离心完成后，在超滤管中加入0.1M碳酸氢铵溶液150ul，4℃，12000rpm，离心60min。
(6)离心完成后，将过滤部分反转于新的外管中，4℃，4000rpm，离心3min。
(7)用0.1M碳酸氢铵溶液洗膜，每次用180ul，洗两次，每次都将洗液转移到外管中。
(8)将上一步中的样品用移液枪轻轻吹打混匀，取100ul于EP管中，加入1ul0.1M氯化钙
溶液。（氯化钙终浓度1mM）
(9)再加入胰酶溶液8ul，涡流混匀几秒钟，将样品置于37℃水浴锅中水浴酶切5、15h；（胰
酶：蛋白-1:50）
(10)酶解结束后，立即用1%FA样品=1:1体积比混合，终止反应。（FA终浓度0.5%）pH<5
(11)10000rpm,低温离心5min，取上清液为后续分析样品。
Note：
1）实验步骤中离心99min和离心60min后，超滤管中的剩余液体的体积在20ul-40ul左右，过多或过少都可能是膜出了问题。
2）实验过程中每一步水浴都要将EP管用封口膜封好，以免EP管中进入其他液体。
3）使用完毕的超滤管要用纯净水洗净，用20%的酒精保存。
备注：非还原（也可考虑Ides切）：变性1:20切12h后终止，一针进样（低：1-3ug；高：10ug）。
再加1:50，切12h后终止，一针进样（低：1-3ug；高：10ug）。
液相条件
（1）色谱柱选择：ACQUTTY UPLC C18BEH300,1.7um，2.1*150mm
（2）柱温推荐：60-65℃
（3）进样量：1-5ug
（4）流动相：
A：0.1%FA的纯水
B：0.1%FA的ACN
肽图数据分析：
软件分析计算完结后，加滤镜：（1）by%greater：+-10%；
（2）Mass error（Da）：5ppm-10ppm
1、胰酶的最适pH为8-8.4，pH>7有活性，50mM醋酸中稳定性好。
2、盐酸胍3-4M即可使蛋白变性。（文献）
3、0.05M AMBIC pH约为7.8（文献）
0.1M AMBIC pH约为8.0（实验）
4、0.1M AMBIC加入0.05%FA pH变为7.16，加入0.5%FA pH变为4.35左右。（预实验）
0.1M AMBICpH8.33加入0.1V的50mM乙酸，7.93，约下降0.4。
再加0.1V，7.59，约下降0.3。再加0.1V，7.3，约下降0.3。
可以此评估加入胰酶后的反应pH。
肽图试剂配制
（1）6M盐酸胍，0.1mol/L Tris,Ph8.3溶液(4℃存放一个月，用前测试pH)称取盐酸胍14.325g，Tris-base0.3g，用容量瓶超纯水定容到25ml，用盐酸调Ph8.3。
（2）0.5M二硫苏糖醇溶液（DTT）
称取DTT0.15g，用2ml超纯水溶解
(3)0.5M碘乙酰胺溶液（IAM）(避光配制，prepare fersh)
称取IAM0.1g,用1ml超纯水溶解，称取时关闭日光灯，称取操作尽可能快，配好以后EP管要用锡箔纸包好。
（4）0.1M碳酸氢铵溶液（AMBIC）(用前测pH)
称取碳酸氢铵0.32g，用40ml超纯水溶解（pH；7.87-7.9），溶解越久，pH越高，两个月后pH>8.5不可用。
（6）0.5μg/μl胰酶溶液（EP管分装—80℃保存，用时拿出）
在盛有20μg胰蛋白酶的小瓶中加入40μl重悬缓冲液（50mM乙酸），用枪吹打均匀。
50mM乙酸可以自己配置:母液17M取15μl溶于5ml水中，混匀即可。
备注：盐酸胍溶液、碳酸氢铵溶液、氯化钙溶液配置完成后要用0.22μm水系膜过滤。
质谱及综合谱图解析
质谱及综合谱图解析 1、在质谱中，一个化合物的M+和(M+2)+峰强度几乎相等，预示着它含有哪种元素( ) A. N B. O C. Br D. Cl 1、已知某化合物的化学式为C4H8O。现已测得它的各种谱图如下，试确证其结构。
2、未知物为无色液体，沸点144℃，其四谱数据如下： 质谱： m/z M的含量% 114(M) 100 115(M+1) 7.7 116(M+2) 0.46 可能分子式：Beynon表 分子式M+1 M+2 C4H10O2 6.72 0.59 C6H14N27.47 0.24 C7H14O 7.83 0.47 C7H2N38.36 0.37 紫外光谱： EtOH λmax/nm εmax/L?mol-1?cm-1 275 12 红外和核磁：
3、某化合物，分子式C10H14O，能溶于NaOH，不能溶于NaHCO3，能使溴水褪色，该化合物的IR和1H NMR如下： IR：3250 cm-1有宽峰，830 cm-1有吸收 1H NMR：δ1.3(s，9H)，δ4.9(s，1H)，δ7.0(m，4H) 4、某化合物，分子式为C8H10O，质谱得到m/z122(M+)，IR在3600~3200 cm-1有强的宽峰，在3000 cm-1和750~700 cm-1处也有强的吸收，1H NMR显示：δ2.5(s，1H)，δ2.7(t，2H)，δ3.7(t，2H)，δ7.5(m，5H)，请推测其结构。 5、分子式为C9H10O的化合物有如下信号： 1H NMR：δ2.0(s，3H)，δ3.75(s，2H)，δ7.2(s，5H) IR：3100，3000，1720，740，700 cm-1和其他峰 试推断结构。
综合谱图解析
1、某未知物分子式为C5H12O，它的质谱、红外光谱以及核磁共振谱如图，它的紫外吸收光谱在200 nm以上没有吸收，试确定该化合物结构。 1 : 2 : 9 [解] 从分子式C5H12O，求得不饱和度为零，故未知物应为饱和脂肪族化合物。 未知物的红外光谱是在CCl4溶液中测定的，样品的CCl4稀溶液的红外光谱在3640cm-1处有1尖峰，这是游离O H基的特征吸收峰。样品的CCl4浓溶液在3360cm-1处有1宽峰，但当溶液稀释后复又消失，说明存在着分子间氢键。未知物核磁共振谱中δ4. 1处的宽峰，经重水交换后消失。上述事实确定，未知物分
子中存在着羟基。 未知物核磁共振谱中δ0.9处的单峰，积分值相当3个质子，可看成是连在同一碳原子上的3个甲基。δ3.2处的单峰，积分值相当2个质子，对应1个亚甲基，看来该次甲基在分子中位于特丁基和羟基之间。 质谱中从分子离子峰失去质量31（－CH 2OH ）部分而形成基峰m/e57的事实为上述看法提供了证据，因此，未知物的结构是 C CH 3 H 3C CH 3 CH 2OH 根据这一结构式，未知物质谱中的主要碎片离子得到了如下解释。 C CH 3 H 3C CH 3 CH 2OH +. C + CH 3 CH 3 H 3C CH 2 OH +m/e31m/e88 m/e57 -2H -CH 3 -CH 3-H CH 3 C CH 2 + m/e29 m/e73 m/e41 2、某未知物，它的质谱、红外光谱以及核磁共振谱如图，它的紫外吸收光谱在210nm 以上没有吸收，确定此未知物。
2 2 6 3 [解] 在未知物的质谱图中最高质荷比131处有1个丰度很小的峰，应为分子离子峰，即未知物的分子量为131。由于分子量为奇数，所以未知物分子含奇数个氮原子。根据未知物的光谱数据亚无伯或仲胺、腈、酞胺、硝基化合物或杂芳环化合物的特征，可假定氮原子以叔胺形式存在。 红外光谱中在1748 cm -1处有一强羰基吸收带，在1235 cm -1附近有1典型的宽强C －O －C 伸缩振动吸收带，可见未知物分子中含有酯基。1040 cm -1处的吸收带则进一步指出未知物可能是伯醇乙酸酯。 核磁共振谱中δ1.95处的单峰(3H ），相当1个甲基。从它的化学位移来看，很可能与羰基相邻。对于这一点，质谱中，m/e43的碎片离子(CH 3C=O)提供了有力的证据。在核磁共振谱中有2个等面积(2H)的三重峰，并且它们的裂距相等，相当于AA ’XX'系统。有理由认为它们是2个相连的亚甲－CH 2－CH 2，其中去屏蔽较大的亚甲基与酯基上的氧原子相连。 至此，可知未知物具有下述的部分结构： CH 2 CH 2 O C O CH 3 从分子量减去这一部分，剩下的质量数是44，仅足以组成1个最简单的叔胺基 CH 3CH 3 N ，正好核磁共振谱中δ2. 20处的单峰(6H )，相当于2个连到氮原子 上的甲基。因此，未知物的结构为 CH 2 CH 2 O C O CH 3 CH 3CH 3 N 此外，质谱中的基峰m /e 58是胺的特征碎片离子峰，它是由氮原子的β位上的碳碳键断裂而生成的。结合其它光谱信息，可定出这个碎片为 CH 2 CH 3CH 3 N 3、待鉴定的化合物（I ）和（II ）它们的分子式均为C 8H 12O 4。它们的质谱、红外光谱和核磁共振谱见图。也测定了它们的紫外吸收光谱数据：(I)λmax 223nm ，