手性固定相色谱法在药物研究中的应用

手性固定相色谱法在药物研究中的应用

药科学院李骏药物化学2111340003

摘要：本文综述了蛋白质类、手性聚合物类、环糊精类、大环抗生素类、Pirkle 型、手性冠醚类、配体交换型和其他型，共8类手性固定相的应用进展，并展望高效液相色谱手性固定相的发展前景。

关键词：手性色谱；手性固定相；手性分离

Application of Chiral Stationary Phase Chromatography in

Pharmaceutical Research

Abstract: This article is intended to foresee the outlook for the development of the chiral stationary phase in chromatography by introducing the development of such chiral stationary phases as protein, chiral polymers, cyclodextrin, macrocyclic antibiotics, Pirkle-type, chiral crown ethers, ligand exchange, and others. Keywords: chiral chromatography; the chiral stationary phase; the chiral separation

手性药物在药物中占有很大的比例，据报道，天然或半合成药物几乎都有手性，其中98%以上为光学活性物；全合成药物的40%为手性药物，而且目前常用的700多种药物有一半至少含有一个手性中心，其中90%为外消旋体。[1、2]利用色谱技术对手性药物进行分离，是新药研究与分析化学中的重要领域。色谱分离药物对映体分为间接法和直接法。[3]而手性固定相法(CSP)属于后者，是直接法的其中一种方式。常用的手性固定相可分为如下大类：(1)蛋白质类手性固定相；(2)手性聚合物类手性固定相；(3)环糊精类手性固定相；(4)大环抗生素类手性固定相；(5)Pirkle型手性固定相；(6)冠醚类手性固定相；(7)配体交换型手性固定相；(8)其他手性固定相。本文综述了近年来手性固定相色谱分离手性药物的方法，以及其研究的新进展。

1 手性固定相手性识别的基本原理

各种不同的手性固定相具有不同的分离模式，从理论上讲，不管选择何种固定相，分离何种对映体，手性分离或手性识别都必须同时有三个相互作用点，这些作用中至少有一个依赖立体化学。该原理1952年首次由Dalgliesh提出，称“三

点作用原理”，用图1可以说明。

图1

将手性材料固定在硅胶表面，其中含有A、B、C三个作用点，与溶质的一个对映体相应的三个点A'、B'、C'作用，而与另一对映体则无C-C'作用力。如果C-C'作用力不等于C-D'作用力，则该外消旋体就有可能被拆分。“三点作用”的作用力可以是氢键、偶极作用、范德华力、包合作用以及立体阻碍等。

2 各种手性固定相的最新进展

2.1 蛋白质类手性固定相（protein CSP)

蛋白质是一类由手性亚基团(L-氨基酸)组成的高分子聚合物，具有天然的对映体选择性，可识别药物对映体在蛋白质结合位点而达到手性分离，用于拆分对映体的蛋白质的配基有牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)、糖蛋白如α1-酸性糖蛋白、卵粘蛋白和溶菌酶等，其中α1-酸性糖蛋白(AGP)在目前应用较广[4]，该类柱稳定性好，柱效高，对许多药物对映体有良好的立体选择性。此类型固定相可直接分离如氨基酸及其衍生物、酸类、胺类、β-氨基醇类、香豆素类等多种药物对映体等。[5]

不同的蛋白质在手性拆分中的应用中往往表现出手性拆分特异性，即某种蛋白质只对某一类结构的对映体具备拆分效果。例如，纤维素酶型手性固定相只拆分碱性及不带电荷的对映体，人血清键合型手性固定相只对弱酸性和中性对映体具备分离能力。

蛋白质类手性固定相的应用范围较广，流动相在绝大多数情况下是含有低浓度的有机溶剂的缓冲液，当蛋白质手性固定相的柱效很好时，与蛋白质的亲和力差别很小的对映体都可得到良好的分离，另外，蛋白质类CSP通过色谱参数的

测定可推断蛋白质与药物相互作用的信息[6]，但若使用不当，蛋白质易变质和载样量低是其缺点。

有研究表明[7]，对于人血清键合相手性固定相(HSA)，相比使用甲基丙烯酸甘油脂(GMA)或二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)作载体，使用硅胶整体柱(silica monoliths)可以获得更好的分离效果。这主要是因为硅胶整体柱，使接触的表面积增加了1.3至2.2倍，从而加大分离效率。另外，Wang等人[8]，通过使用牛血清键合型手性固定相(BSA)，用HPLC在反向模式下，对12种不同的手性物质进行分离，运用热力学方法，阐明BSA的分离机制主要是焓驱动的过程。

2000年至今，很多新的蛋白质键合型手性固定相被开发，应用到液相色谱手性拆分中去[9、10]，然而在手性拆分特异性、稳定性和柱负载等方面仍待提高，因此蛋白质键合型手性固定相有向其它的分离模式发展的趋势[11]。尽管如此，在高效液相色谱手性分离中，它依然在手性分离理论与应用研究方面具有特殊意义。

2.2 手性聚合物(纤维素和淀粉衍生物)类手性固定相(chiral polymer CSP)

纤维素和直链淀粉类多糖是极为丰富的天然手性高分子，其本身具有手性识别能力，但不能作为实际使用的固定相,因为天然纤维素分离能力不高，溶解性差，所以应用受到限制。然而它们的衍生物，如它们的有机酸酯，作为色谱固定相却具有较高的手性识别能力，能拆分大量的对映体。例如纤维素三醋酸酯(Chiralcel OA)、纤维素三苯甲酸酯(Chiralcel OB)和纤维素三苯基氨基甲酸酯(Chiralcel OC)等。此类固定相的手性识别主要来自酯的部位与被拆分物之间形成氢键或偶极—偶极作用，或通过被拆分物分子进入纤维素网状腔，导致腔内立体环境的改变而实现。此类固定相对膦酸酯、醇、酯、酰胺、氰类化合物有良好的拆分作用。[12、13]

2012年，周颖[14]在Chiralcel OJ、Chiralcel OD、Chiralpak AD、Chiralpak AS 四种不同的手性固定相上，以正己烷-异丙醇为流动相，对15种药典收载的手性药物进行拆分实验，考察有机添加剂的比例、醇置换剂的比例及温度对分离的影响。结果表明，对映体的色谱保留和分离度可以通过改变流动相中醇类置换剂的浓度、有机酸性改性剂和浓度、柱温等因素调节。

同年，曲若萌[15]通过在淀粉分子链的空腔中，插入具有刚性的碳纳米管，再与苯基类异氰酸酯充分反应，得到淀粉包含碳纳米管的衍生物(MWNTs/ADMPC)，作为HPLC用手性固定相。选取10种不同的手性物质进行分离，发现MWNTs的加入极大地提高对部分含有苯环类的对映体的分离效果，并且由于MWNTs优异的耐溶剂性能，同时提高手性固定相的稳定性和一定程度上提高了淀粉衍生物的刚性，从而优化了市面商品柱其柔顺分子链结构和较差的抗溶剂性能，为其商品化成为可能。

2.3 环糊精类手性固定相(cyclodextrins CSP)

环糊精(cyclodextrin，CD)是由D -吡喃葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键连接而成的环状分子，具有疏水空腔和腔外亲水的羟基结构。其疏水空腔能与许多有机客体分子发生包载作用(inclusion)，加之葡萄糖分子上具有多个手性碳原子，此双重作用使得CD具有良好的手性识别能力。除此之外，CD具有无紫外吸收，价格便宜，易于衍生化等优势，所以被广泛应用于液相色谱手性固定相。[16] 对于目前一些新型衍生化的环糊精键合固定相，大多是进行化学修饰，改变其空腔尺寸和形状，并且引入取代基，使CD与手性分析物之间产生新的π-π、偶极-偶极、氢键和离子对等作用，从而可以有效提高CD的手性分离能力。较为常见的CD衍生物，主要有乙酰基、甲苯酰基、甲苯氨甲酰基、萘乙基氨甲酰基等衍生化CD键合相。

Wang等人[17]通过简单的自由基共聚法将含有咪唑基和季铵基的正电CD分别连接到硅胶基质上，制备了两种新型的阳离子β-CD CSP，并成功应用于HPLC 手性分离。结果表明，由于咪唑基与分析物形成的强的氢键作用，使含有咪唑基的β-CD固定相有更强的手性分离效果。另外，CD空腔的包合作用，静电作用及离子交换作用都会促进手性分离。

李来生等人[18]通过click反应合成对硝基异氰酸苯酯衍生化β-环糊精键合SBA-15硅胶手性固定相(NPCSP)，在极性条件下对三种β-受体阻滞剂药物进行手性分离。考察对此三种药物的分离结果，并对其机理进行解释，发现环糊精空腔的疏水作用、对硝基氨基甲酸苯酯与手性化合物的氢键作用和π-π作用，以及

空间位阻作用是分离的主要原因，说明这类物质与衍生化β-CD疏水空腔相匹配。对日后β-受体阻滞剂类药物的拆分提供了基础。

2.4 大环抗生素类手性固定相(macrocyclic antibiotics CSP)

以大环抗生素类化合物作为手性固定相是由Armstrong在1994年首先提出的，是目前最新和发展最快的一类手性固定相，包括Chirobiotic V，Chirobiotic T，Chirobiotic TAG和Chirobiotic R四种。此类固定相具有非常广泛的对映体选择性，应用范围广。由于其结构中含有多肽，糖类和其它可离子化基团，因此在不同的洗脱模式下会表现出不同的对映体选择性。此类固定相综合了蛋白质、环糊精等手性固定相所具有的特点，提供了手性识别所需要的相似作用类型。目前，用于对映体分离的大环抗生素根据其结果特定分为糖肽类、柄状霉菌素类、多肽与氨基糖苷类三大类。这些物质分子含有多个不对称中心，可与被分离物质产生多种作用，如包合作用，偶极-偶极叠加作用、π-π电荷转移相互作用等。在这些物质分子中，除了疏水部分外，通常还有亲水基和可离子化的基团，因此具有良好的水溶性。[19]张丹丹等人[20]用替考拉宁手性固定相(Chirobiotic T)，对克伦特罗对映体进行分离，最大分离度达3.75，并对阐明分离机制是克伦特罗对映体与固定相之间的离子相互作用。

2012年，Carla Fernandes等人[21]，合成了7种山酮素手性衍生物，分别用Chirobiotic V，Chirobiotic T，Chirobiotic TAG和Chirobiotic R四种手性柱在正相或极性有机相中进行成功分离，并通过计算机对接的方式，首次对此类手性物质的分离进行解释，并且能较好的预测色谱的分离，成功率达92%。为日后山酮素的分离建立方法，同时对使用计算机辅助预测化合物分离的方法有所启示。

2.5 Pirkle型手性固定相(brush-type CSP)

在手性液相色谱领域，Pirkle型手性固定相是目前使用量最大，适用面最广的一类重要的手性固定相。这类CSP的特点是：一般通过一定的间隔臂，连接一个单分子层的手性分子到硅胶基质上而制得，所以也被称为“刷型”或“束型”CSP。在该类CSP上的对映体分离通常通过以下几种作用而发生：(1)被分离溶质与CSP芳环的π-受体和π-授体之间的π-π作用；(2)CSP上的仲胺、羰基基团

与溶质的酸性质子、羟基、氨基之间的氢键作用；(3)偶极-偶极作用；(4)大体积非极性基团靠近CSP手性中心而产生的空间立体效应。[22]

其特有的优点是：(1)较高的色谱性能，基质上键合手性分子的密度大，可承受较大的进样量却不改变固定相的性能；(2)经久耐用，共价键的存在使得娃胶上的键合物不易流失、可承受过载的样品量、可用强溶剂作为洗脱剂、可适用于超临界流体色谱以及柱子可完全再生等；(3)较宽的线性范围，从分析到制备都可以使用；(4)被分离手性对映体的流出顺序可以颠倒；(5)较广泛的溶剂适用性，正相、反相色谱都适用。正是由于上述优势，使得Pirkle型CSP在手性对映体的拆分中占有了极其重要的地位。[23]

Haibo Wu等人[24]通过合成四种不同的氮杂环键合到硅胶相中，制备出四种手性刷型固定相，在正向色谱条件下，对54种不同的化合物进行考察，结果表明连有芳胺甲酸酯结构的对化合物的分离更有效，这可能与此结构为固定相提供了更多的手性结合位点有关。杨淑超等人[25]在国内外首次尝试利用较强的π-π作用和立体阻碍的基团，将金属有机化合物二茂铁和生物素引入手性固定相，发现N-二茂铁甲酰基-L-丙氨酸CSP具有很好的反相色谱性能，高疏水作用、强π-π作用、大的空间位阻和氢键作用，更有效的对化合物进行拆分，为日后的应用前景奠定基础。

2.6 手性冠醚类手性固定相(chiral grown ether CSP)

冠醚类似环糊精，是本身具有手性的低聚糖。根据插入到冠醚中的手性单元，可以将手性冠醚主要分为，以有机酸为基体的手性冠醚、插入联萘单体的手性冠醚、从糖类化合物出发的手性冠醚和以有机醇为手性源的手性冠醚。[26]冠醚类手性固定相主要用于一些含有能够质子化的伯胺官能团的手性化合物分离，尤其是氨基酸及其衍生物对映体的拆分。一般都是使用酸性流动相，使氨基发生质子化，与冠醚发生配合作用，从而进行手性拆分，常用冠醚是“18-冠-6”。[20]韩国化学家Wonjae Lee等人[27]，通过合成一种新的键合相手性冠醚固定相(图2)，克服容量因子随着甲醇的含量降低而降低的变化趋势，使手性冠醚固定相可用于更广的溶剂体系，有利于扩大该类固定相在疏水性物质分析中的应用。

图2

随后Zhang等人[28]，在Wonjae Lee等人研究的启发下，通过应用两种冠醚类手性固定相Crown ether-NH和N-CH3（图3、4），对五种β2-受体激动剂和六种β-受体阻断剂药物对映体进行拆分研究，成功拆分了这两类具有仲胺结构化合物，实现首次对仲胺结构的化合物在冠醚类固定相的拆分，扩展了此类手性固定相的应用范围，为具有仲胺结构的芳香化合物对映体的分离提供了一种新的有效的途径。

图3 图4

2.7 配体交换型手性固定相(ligand exchange CSP)

此类固定相是利用配体交换的分离机制而制成的固定相，通过手性选择剂、中心金属离子与被分离溶质形成的多元配合物热力学稳定性的差异和动力学的可逆性来对手性物质实现分离。这类固定相多用于氨基酸或者肽类的拆分。在手性配体交换色谱(CLEC) 中，中心金属离子配位的能力在很大程度上决定了配合

物稳定性的高低。常使用的金属离子有Cu2+、Ni2+、Co2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Cd2+等。其中Cu2+配合物通常是最稳定的，在CLEC中被广泛采用。用于CLEC 的手性选择剂包括：光学活性氨基酸、哌可酸、呱啶酸、麻黄碱、酒石酸等，而以光学活性氨基酸或哌可酸作为手性配体的涂渍或键合手性固定相的制备是手性配体交换色谱法发展的主流，目前已有十几种商品化的CLEC-CSPs。[29、30] 手性配体交换固定相分离的溶质主要有游离氨基酸、羟基酸、丙醇胺等。在药物研究中，该类固定相已成功对尼莫地平、普萘洛尔、维拉帕米和异丙嗪等药物进行了手性分离[31]。而在2013年，韩国科学家Jin Joo Ha等人[32]，通过键合N-[(R)-2-羟基-1-苯乙基]-N-十一烷基氨基乙酸钠到硅胶表面，制备新的手性配体交换固定相（图5），对噢美拉唑、泮托拉唑、兰索拉唑和雷贝拉唑四种质子泵抑制剂的消旋体成功的进行了拆分，分离度(R)分别达到2.53，2.55，1.93和2.01。

图5

Shi等[33]，为减少了在硅胶表明的残余硅醇基，首次使用二甲基氯硅烷作封端试剂，然后通过硅氢化反应，用烯丙基缩水甘油醚和烯烃对硅胶表面进行修饰，最后引入L-脯氨酸作为手性选择剂。通过上述方法对三种配体交换型手性固定相进行合成(CSP1、CSP2、CSP3，见图6)，并在以Cu(Ac)2水溶液为流动相下，对14种氨基酸和2种羟基酸进行手性分离。结果表明，合成的此类固定相，进行了疏水化的修饰和残余硅醇基的屏蔽，能有效的提高分离效率和柱效。

图6

2.8 其他手性固定相

2.8.1核酸类手性固定相

2005年法国的Agnes Brumbt等人在论文[34]中报道了利用RNA的片段做手性固定相的消息，经过研究发现，手性拆分效果较好。2006年法国的Ravelet C 等人[35]在论文中介绍了DNA和RNA的片段做手性固定相的研究情况。

2.8.2寡糖手性固定相

2009年，赵峰等人[36]将葡萄糖、麦芽糖、纤维二糖、棉子糖、乳糖的对甲基苯甲酸酯经过3-异氰酸丙基三乙氧基硅烷键合到硅胶上作为高效液相色谱的手性固定相，以V(正己烷)∶V(异丙醇)=90∶10为流动相，对16种外消旋体化合物进行了拆分，其中有五种外消旋体化合物拆分成功，并且这些手性固定相之间还具有好的手性识别互补性。在高效液相色谱中寡糖有望成为一类新型的手性固定相。

3 前景与展望

随着社会生活水平的提高和药学的发展，人们对药物质量的要求越来越高。由于手性药物各对映体存在药效学、药动学和毒理学方面的差异，因此，现在许多国家都提倡手性药物以单纯对映体形式上市，以减少治疗总剂量和药物间相互

作用，消除无活性对映体的毒性。手性药物的拆分仍然是当前药物研发的热点，色谱法是当前手性药物拆分的主要手段，它为手性新药合成的研发提供了有效的分析手段，也可解决药物以纯异构体供药的难题，因而具有广阔的开发应用前景。对于未来，发展多种多样、成本低廉、制备简单、效果优良、重现性好的手性固定相，并使之商品化，是手性固定相发展的一条重要道路，并且通过计算机对接技术的引入，有助于揭示手性固定相的分离机制，对日后深入研究外消旋体的几何形状、固定相的手性空间等因素对固定相拆分能力的影响进行更全面的总结。

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