紫外-可见吸收光谱法.

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第十二章 紫外-可见吸收光谱法

【知识目标】

1．掌握：紫外-可见吸收光谱的产生及其特性，影响紫外-可见吸收光谱的因素。

2．熟悉：紫外-可见吸收光谱与分子结构的关系，电子跃迁类型和吸收带；定性分析方法，混合组分定量方法。

3．了解：电磁辐射和电磁波谱；光谱分析法的分类。

【能力目标】

1．识记：电磁辐射和电磁波谱，光谱分析法的分类；溶剂极性对紫外-可见吸收光谱的影响；仪器的类型；定性分析和纯度检查方法。

2．理解：紫外-可见吸收光谱的产生，电子跃迁类型和吸收带；仪器测量误差。

3．应用：测量条件的选择；定性分析方法和纯度检查，混合组分定量测定方法。

研究物质在紫外-可见光区（200 nm ～760 nm ）分子吸收光谱的分析方法，称为紫外-可见吸收光谱法（ultraviolet -visible absorption spectroscopy ，UV -vis ）。它广泛用于无机和有机物质的定性和定量分析，在药物、食品中应用也较多。

第一节 光谱分析法概述

一、电磁辐射和电磁波谱

表12-1 电磁波谱范围表

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电磁辐射又称电磁波，是以巨大速度通过空间、不需要以任何物质作为传播媒介的一种能量。电磁辐射具有波粒二象性，即波动性和粒子性。

将电磁辐射按波长的长短顺序排列起来，称为电磁波谱。表12-1列出了各电磁波谱区的名称、波长范围、相应的能级跃迁类型及对应的光谱类型。

二、光谱分析法的分类

光学分析法分为非光谱法与光谱法。

非光谱法是指不以光波长为特征讯号，仅利用物质与电磁辐射的相互作用，测量电磁辐射的反射、折射、干涉、衍射和偏振等性质变化的分析方法。主要分析方法包括折射法、旋光法、比浊法、X射线衍射法等。

光谱法是基于电磁辐射能量与物质作用时，测定由物质内部发生量子化的能级之间跃迁而产生吸收、发射或散射的波长和强度，进行定性、定量和结构分析的方法。光谱法可分为吸收光谱法、发射光谱法等。

由气态原子或离子的外层电子在不同能级间跃迁而产生的光谱，称为原子光谱（atomic spectrum）。由分子外层电子跃迁或分子内部振动转动能级跃迁而产生的光谱，称为分子光谱（molecular spectrum）。

（一）吸收光谱法

利用物质的特征吸收光谱进行分析的方法，称为吸收光谱法（absorption spectroscopy）。根据吸收光谱所在光谱区不同，吸收光谱法可分为X射线吸收光谱法、原子吸收光谱法、紫外 可见吸收光谱法、红外吸收光谱法和核磁共振波谱法等。本章主要讨论紫外-可见吸收光谱法。

（二）发射光谱法

通过测量物质的特征发射光谱进行分析的方法，称为发射光谱法（emission spectroscopy）。根据发射光谱所在光谱区和激发方式不同，发射光谱法可分为γ射线光谱法、X射线荧光光谱法、原子发射光谱法、原子荧光光谱法、分子荧光光谱法和分子磷光光谱法等。

第二节紫外-可见吸收光谱与分子结构的关系

紫外-可见吸收光谱法是基于分子外层价电子跃迁产生的吸收光谱进行分析的方法。它属于分子吸收光谱。分子在紫外-可见区的吸收与其电子结构相关。

一、紫外-可见吸收光谱的产生和电子跃迁

（一）紫外-可见吸收光谱的产生

分子具有电子能级、振动能级和转动能级，这些能级都是量子化。在每一电子能级上有许多间距较小的振动能级，在每一振动能级上又有许多更小的转动能级。若用ΔE电子、

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ΔE振、ΔE转分别表示电子能级、振动能级、转动能级差，有ΔE电子>ΔE振>ΔE转，如图12-1所示。

图中S代表电子能级，ν代表振动能级，r代表转动能级，下标0、1、2、···代表相应能级的基态、第一激发态、第二激发态、···。

分子吸收外来电磁辐射后，它的能量变化ΔE为其振动能量变化ΔE振、转动能量变化ΔE转以及电子能量变化ΔE电子的总和，即

=++

E E E E

????

分子振电子

转

（12-1）

当用波长为λ（或频率ν）的电磁照射分子，该分子的较高能级与较低能级之差ΔE恰好等于该电磁波能量hν时，即有

21hc

E E E hv

λ

?=?-?==（12-2）则该波长（或频率）的光被该物质选择性地吸收，价电子从基态跃迁到激发态。此时，在微观上表现为分子由较低能级跃迁到较高能级。在宏观上则为体现物质吸收光。

图12-1 双原子分子能级示意图

若用连续的电磁辐射按波长大小顺序分别照射分子，记录物质分子对电磁辐射的吸收。

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物质分子对辐射吸收程度随波长变化的关系，称为分子吸收曲线，又称分子吸收光谱。

分子中电子能级间能差约为1～20 eV（相应的波长为1.25μm～60nm）。因此，由电子能级跃迁产生的吸收光谱，称为称为紫外-可见吸收光谱，又称为电子光谱（electronic spectrum）。

在电子能级跃迁过程中，还会伴随有振动能级和转动能级的跃迁，因而产生的一系列谱线连成的谱带。因此，紫外-可见吸收光谱实际上是电子-振动-转动光谱。

（二）电子跃迁类型

紫外-可见吸收光谱是分子中价电子能级的跃迁产生的，因此，这种吸收光谱决定于分子中价电子分布和结合情况。在有机化合物中有三种不同性质的价电子：形成单键的σ电子、形成双键的π电子和未参与成键的孤对电子n电子（或p电子）。

根据分子轨道理论，这三种电子的能级顺序为：

σ < π< n < π*< σ*

σ、π表示成键分子轨道，σ*、π*表示反键分子轨道，n表示非键分子轨道。

当外层价电子吸收紫外光或可见光后，就从基态向激发态（反键轨道）跃迁。分子中的价电子跃迁方式与键的性质有关，即与化合物的结构有关。电子跃迁（electron transition）主要类型有：σ→σ*、n→σ*、π→π*、n→π*。如图12-2所示。

各种电子跃迁所需能量ΔΕ大小顺序为：σ→σ* > n→σ* > π→π* > n→π*

图12-2 电子能级及电子跃迁示意图

1．σ→σ*跃迁

由单键构成的化合物，如饱和碳氢化合物，由于只有σ电子，只能发生σ→σ*跃迁。σ→σ*跃迁所需能量在所有跃迁类型中最大，所吸收的辐射波长最短，其吸收发生在远紫外区，波长小于200 nm。有机饱和烃中C—C键属于这类跃迁，例如，甲烷的最大吸收波长λmax在125 nm，乙烷的最大吸收波长λmax为135 nm。由于仅能产生σ→σ*跃迁的物质在200 nm以上波长没有吸收，故它们在紫外-可见吸收光谱法中常用作溶剂。

2．n→σ*跃迁

含有未共用电子对的杂原子（N、S、O、P和卤素原子等）的饱和有机化合物，都含有n电子，因此都可发生这种跃迁。实现这类跃迁所需要的能量较高，但比σ→σ*跃迁所需能量小，n→σ*跃迁比σ→σ*跃迁所引起的吸收峰波长长，为150～250 nm，大部分在远紫外区和

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近紫外区。例如，CH3OH的吸收峰为183 nm，CH3NH2的吸收峰为213 nm。由n→σ*跃迁产生的吸收峰多为弱吸收峰，它们的摩尔吸光系数（εmax）一般在100～300范围内，因而在紫外区有时不易观察到。

3．π→π*跃迁（K带）

含有π电子基团的不饱和烃、共轭烯烃和芳香烃类等有机物可发生此类跃迁。π→π*跃迁所需能量比σ→σ*跃迁小，与n→σ*跃迁差不多，吸收峰一般处于近紫外光区，在200nm 附近，其特征是摩尔吸光系数大，一般εmax为104以上，属强吸收带。如乙烯（蒸气）的最大吸收波长λmax为162 nm。

若有共轭体系，π→π*跃迁所需能量减少，波长向长波方向移动，相当于200 nm～700 nm 的紫外-可见光区。

4．n→π*跃迁（R带）

含有杂原子双键（如C=O，—N=O，C=S，—N=N—等）的不饱和有机化合物可发生这种跃迁。实现这种跃迁所需能量最小，因此其最大吸收波长一般出现在近紫外光区（200 nm～400 nm）。由n→π*跃迁产生的吸收带（R带）的特点是εmax小，一般为10～100。摩尔吸光系数的差别显著，是区别π→π*跃迁和n→π*跃迁的方法之一。例如，乙醛分子中羰基n→π*跃迁所产生的吸收带为290 nm，εmax只有17。

5．电荷迁移跃迁

所谓电荷迁移跃迁(charge transfer transition)是指用电磁辐射照射化合物时，电子从给予体向接受体相应的轨道上跃迁。所以，电荷迁移跃迁实质是内氧化-还原过程。所得到的吸收光谱称为电荷迁移吸收光谱。电荷迁移产生的吸收带指的是许多无机物（如碱金属卤化物）和某些由两类有机化合物混合而得的分子配合物。例如，某些取代芳烃可产生这种分子内电荷迁移跃迁吸收带。其特点是这种跃迁谱带较宽，吸收强度较大，εmax可大于104。

6．配位场跃迁

配位场跃迁包括d-d跃迁和f-f跃迁。元素周期表中第四、五周期的过渡金属元素分别含有3d和4d轨道，镧系和锕系元素分别含有4f和5f轨道。在配体存在下，过渡元素的五个能量相等的d轨道和镧系元素七个能量相等的f轨道分别，分裂成几组能量不等的d轨道和f轨道。当它们的离子吸收光后，低能态的d电子或f电子可以分别跃迁至高能态的d或f轨道，这两类跃迁分别称为d-d跃迁和f-f跃迁。由于这两类跃迁必须在配体的配位场作用下才可能发生，因此又称为配位场跃迁（ligand field transition）。

这种d-d跃迁所需能量较小，只需能量较小的可见光就可实现这一跃迁，它们的吸收峰多在可见光区，强度较弱（εmax = 0.1～100）。f-f跃迁带在紫外-可见光区。

图12-3比较形象地表示出这几种常见吸收光谱在光谱区中的位置和大致强度。横坐标是波长，纵坐标是吸光强度（用摩尔吸光系数lgεmax表示）。由图可知，π→π*跃迁引起的吸收谱带的吸光强度最大，电荷转移吸收光谱的次之，而配位场吸收谱带最小。

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图12-3产生紫外可见吸收光谱的几种电子跃迁示意图

在紫外和可见光谱区范围内，有机化合物的吸收带主要由σ→σ*、π→π*、n→σ*、n→π*及电荷迁移跃迁产生。无机化合物的吸收带主要由电荷迁移和配位场跃迁（即d-d跃迁和f-f 跃迁）产生，电子跃迁的类型与分子结构及其存在的基团有密切联系。因此，可以根据分子结构来推测可能产生的电子跃迁。例如，饱和烃只有σ→σ*跃迁，烯烃有σ→σ*跃迁、也有π→π*跃迁，脂肪族醚则有σ→σ*跃迁和n→σ*跃迁。

（三）常用术语

1．生色团（发色团）

生色团（chromophore）是指有机化合物分子中含有能产生π→π*、n→π*跃迁的，并且能在紫外-可见光范围内产生吸收的基团。例如，羰基、硝基、苯环等。

2．助色团

助色团（auxochrome）是指带有非键电子对的基团（如—OH、—OR、—NHR、—SH、—Cl、—Br等），它们本身不吸收紫外-可见光。但是当它们与生色团相连时，会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并且增加其吸光度。对应的跃迁类型是n→σ*跃迁。

3．红移与蓝移（紫移）

由取代基或溶剂效应引起的使吸收峰向长波方向移动，称为红移（red shift），又称长移。使吸收向短波长方向移动，称为蓝移（blue shift），又称紫移（或短移）。吸收强度即摩尔吸光系数ε增大或减小的现象，分别称为增色效应（hyperchromicity）或减色效应（hypochromic effect），如图12-4所示。

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图12-4 红移、蓝移、增色、减色效应示意图

（四）吸收带

吸收带是指吸收峰在紫外-可见光谱中的波带位置。根据电子及分子轨道的种类可将紫外光谱的吸收带分为四种类型，在解析光谱时，可以从这些吸收带的类型推测有机化合物的分子结构。

1．R 吸收带

由化合物n→π*跃迁而产生的吸收带。它是含杂原子的不饱和基团，

如 、—N =O 、—NO 2、—N =N —等发色团产生的吸收带。其特点是能量最小，处于长波方向，吸收峰位于200～400 nm 之间，为弱吸收强度，一般摩尔吸光系数ε小于100。

2．K 吸收带

由共轭双键中的π→π*跃迁产生的吸收带，是共轭分子的特征吸收带。可据此判断化合物中共轭结构，是紫外光谱中应用最多的吸收带。其特点是跃迁所需的能量较R 带大，一般λmax 位于210～250 nm ，为强吸收（ε>104）。随着共轭体系的增长，K 带吸收向长波方向移动（红移）。

3．B 吸收带（苯吸收带）

由苯环本身振动及闭合环状共轭双键π→π* 跃迁而产生的吸收带，是芳香族（包括杂环芳香族）的主要特征吸收带。其特点是为弱吸收带（230～270nm)，具有精细结构，摩尔吸光系数ε约为200。常用来识别芳香族化合物，如图12-5所示。但溶剂的极性、酸碱性等对精细结构的影响较大。在极性溶剂中测定，或苯环上有取代基时，精细结构消失。

图12-5 苯在乙醇中的紫外吸收光谱

4．E 吸收带

由苯环结构中环状共轭体系的π→π*跃迁产生的，分为E 1（185 nm ）和E 2（204 nm ）吸收带。可以分别看成乙烯和共轭烯烃的吸收带。也是芳香结构化合物的特征谱带。吸收强度E 1为ε＞104，E 2约为ε＞103，均属强带吸收。

E 带主要用于研究取代苯的结构。当苯环上有助色团（如—C1、—OH 等）取代时，E 2出现红移，但一般在210 nm 左右；当有生色团取代并与苯环共轭时，则E 带常与K 带合并，有B 和K 两种吸收带。取代苯中，E 2带和B 带研究最为广泛，而E 1带在远紫外区，较少研究。

二、影响紫外-可见吸收光谱的因素

O C

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（一）溶剂效应

由溶剂的极性强弱引起紫外-可见吸收光谱的吸收峰波长发生移动，吸收强度和吸收曲线形状发生改变的现象，称为溶剂效应。

1．溶剂极性对紫外吸收光谱的影响

（1）溶剂极性对最大吸收峰波长的影响

改变溶剂的极性会引起吸收带的最大吸收波长λmax发生变化，表12-2列出了亚异丙酮在不同极性溶剂中吸收波长的变化情况。当溶剂极性增大时，由π→π*跃迁产生的吸收带发生红移，而由n→π*跃迁产生的吸收带则发生蓝移。因此，在测定紫外吸收光谱曲线时，应注明在何种溶剂中测定。

表12-2 溶剂对亚异丙酮吸收带的影响

吸收带正己烷乙腈氯仿甲醇水波长位移

π→π*

230 234 238 237 243 红移λmax（nm）

n→π*

329 314 315 309 305 蓝移λmax（nm）

溶剂极性改变使吸收带位移的原因，一般认为是极性溶剂对n、π、π*轨道的溶剂化作用不同所引起的。图12-6（a）是π→π*跃迁和n→π*跃迁的能级受溶剂极性影响所发生变化的示意图。分子吸收光能后，成键轨道上的电子会跃迁至反键轨道形成激发态。一般情况下分子的激发态极性大于基态。溶剂极性越大，分子与溶剂的静电作用越强，使激发态稳定，能量降低。即π*轨道能量降低大于p轨道能量降低，因此波长红移。而产生n→π*跃迁的n电子由于与极性溶剂形成氢键，基态n轨道能量降低大，n→π*跃迁能量增大，吸收带蓝移。极性溶剂极性越大，位移幅度也越大。因此，可以利用溶剂效应来鉴别这两种跃迁引起的吸收谱带。

（a）溶剂极性对π→π*和n→π*跃迁能量的影响（b）苯酚的B吸收带（1.在庚烷溶液中 2.在乙醇溶液中）

图12-6溶剂效应

（2）溶剂极性对吸收光谱精细结构的影响

当溶剂从非极性变为极性时，常会导致化合物精细结构完全消失，吸收峰减少，并使吸收曲线趋于平滑，成为一条宽而低的吸收带。图12-6（b）说明溶剂极性对苯环精细结构的影响。

2．溶剂的选择

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化合物吸收光谱的特性与所用的溶剂有密切关系，在进行紫外光谱分析时,必须正确选用溶剂。选择溶剂的原则：

（1）溶剂应能很好地溶解被测试样，溶剂对溶质应该是惰性的。即所配成溶液应具有良好的化学和光化学稳定性。

（2）在溶解度允许情况下，应尽量选择极性较小的溶剂。

（3）溶剂在试样的吸收光谱区应无明显吸收。

表12-3列出紫外吸收光谱中常用溶剂，同时给出了各种溶剂使用的最短波长极限。所选溶剂必须在大于最低波长极限的范围内使用。

表12-3 紫外吸收光谱分析常用溶剂

溶剂可使用的最短波长极限（nm）溶剂可使用的最短波长极限（nm）水200 乙酸250 正庚烷200 甲酸255

环己烷200 乙酸乙酯255

甲醇210 四氯化碳265

乙醇210 苯280

乙醚215 石油醚297

氯仿245 吡啶305 二氯乙烷245 丙酮330

需要注意的是光谱分析用溶剂应当是高纯度的，至少是分析纯，必要时应预先检查溶剂中是否含有杂质，以免得出错误结论。

（二）pH的影响

无论是在紫外或可见光区，溶液pH变化常引起被测物质的化学变化，从而影响其吸收光谱。例如，苯胺在中性条件λmax为230 nm，次吸收峰为280 nm，ε分别为8600和1400，但苯胺在酸性介质中会形成苯胺阳离子，其吸收峰分别为203 nm和254 nm，与苯的λmax 几乎相同。这是由于苯胺阳离子不带有孤对电子对，即不存在n→π*共轭，导致吸收峰蓝移，吸光度减小。利用苯胺成盐前后的变化可确定分子中是否有N取代苯胺存在。

由此可见，在测定不同pH下易发生变化的化合物时，一定要控制溶液pH值。

（三）温度的影响

在室温范围内，温度对吸收光谱的影响不大。但在低温时，由于分子的热运动减慢，分子的碰撞频率降低，邻近分子间的能量交换减少，产生红移，吸收峰变得比较尖锐，吸收强度有所增大。但有些显色反应在室温下进行缓慢，需要加热才能完成，这时分子的热运动加快，邻近分子的碰撞频率增加，谱带变宽，使谱带精细结构消失。因此，应根据反应性质选择合适温度条件。

第三节紫外-可见分光光度计

紫外-可见分光光度计的类型很多，就其基本原理、仪器结构与第十章分光光度计相似，由辐射光源、单色器、吸收池、检测器、信号处理及显示系统五部分组成。图12-7是双光束紫外-可见分光光度计的结构示意图。

一、主要部件的性能与作用

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1．辐射光源

辐射光源的作用是提供激发能，使待测分子产生吸收。对光源的要求：在较宽的波长范围内，能够提供足够强的连续光谱；有良好的稳定性、较长的使用寿命；辐射能量随波长无明显变化。

常用的光源有热辐射光源和气体放电光源。热辐射光源用于可见光区，如钨灯和卤钨灯，使用的波长范围在320～2500 nm。气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯，可在160～375 nm范围内产生连续光源。

图12-7 双光束紫外-可见分光光度计的结构示意图

2．单色器

单色器的作用是使光源发出的光变成所需波长的单色光。通常由入射狭缝、准直镜、色散元件、聚焦透镜和出射狭缝构成，如图12-8所示。入射狭缝用于限制杂散光进入单色器，准直镜将入射光束变为平行光束后进入色散元件。色散元件将复合光分解成单色光，然后通过聚焦透镜将平行光聚焦于出射狭缝。出射狭缝用于限制谱带宽度。常用的色散元件是光栅（raster）和棱镜（prism）。单色器的性能直接影响入射光的单色性，从而也影响到测量的灵敏度、选择性及校准曲线的线性关系等。

（a）光栅单色器（b）棱镜单色器

图12-8 光栅和棱镜单色器构成图

3．吸收池

又称比色皿，是用来盛放被测试样的。按制作材料可分为石英吸收池和玻璃吸收池。前者适用于紫外 可见光区，后者只适用于可见光区。吸收池厚度在0.1～10 cm之间，常用的吸收池厚度为1 cm，根据被测试样的浓度和吸收情况来选择合适的吸收池。

使用吸收池时，应先用溶剂洗涤吸收池，然后再用被测试样溶液冲洗3次。拿取吸收池时，应拿吸收池毛玻璃的两面，不要触摸透光面。吸收池外沾有液体时，应小心地用擦镜纸或脱脂棉擦净，保证其透光面上没有斑痕。避免测定含强酸或强碱的溶液。

4．检测器

又称光电转换器（photolectric transducer），它的功能是检测透过吸收池的光信号，并将光信号转变成可测量的电信号。常用的有光电池、光电管或光电倍增管，后者较前

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者更灵敏，它具有响应速度快、放大倍数高、频率响应范围广的优点，特别适用于检测较弱的辐射。近年来还使用光导摄像管或光电二极管阵列作检测器，具有快速扫描功能。

5．信号处理及显示系统

它的作用是放大电信号，并以适当方式显示或记录下来。由于透过试样后的光很弱，所以射到光电管产生的光电流很小，因此需要放大才能测量出来，放大后的信号可直接输入记录式电位计。常用的信号处理及显示系统有检流计、数字显示仪、微型计算机等。

二、紫外-可见分光光度计类型

紫外-可见分光光度计，可分为单光束分光光度计、双光束分光光度计和双波长分光光度计。

1．单光束分光光度计

经单色器分光后的一束平行单色光，轮流通过参比溶液和试样溶液，以进行吸光度的测定。这种简易型分光光度计结构简单，操作方便，易于维修，适用于测定特定波长的吸收，进行定量分析。其原理如图12-9（a）。

图12-9 三种类型分光光度计原理图

2．双光束紫外-可见分光光度计

双光束仪器中，从光源发出的光经单色器分光后，再经旋转折光器分成两束，交替通过参比池和试样池，测得的是透过试样溶液和参比溶液的光信号强度之比。双光束仪器克服了单光束仪器由于光源不稳引起的误差，并且可以对全波段进行扫描。其原理如图12-9（b）。

3．双波长紫外-可见分光光度计

该仪器既可用作双波长分光光度计，又可用作双光束仪器。其原理如图12-9（c）。由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得到两个不同波长的单色光λ1和λ2，由斩光器并束，使其在同一光路交替通过同一吸收池，由光电倍增管检测信号，得到的信号

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是两波长处吸光度之差ΔA。双波长仪器的主要特点：

（1）不需参比液，克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高、选择性高。

（2）对混浊试样进行测定时，可消除背景吸收。

（3）适当选择波长，简化混合组分同时测定过程。

（4）可测定导数光谱（derivative spectrum）。

三、分光光度计的校正

为保证测量的精密度和准确度，紫外-可见分光光度计要定期进行波长校正和吸光度校正。一般用镨铷玻璃或钬玻璃校正分光光度计的波长标尺，前者用于可见光区，后者对紫外和可见光区都适用。用K2CrO4标准溶液来校正吸光度标度。

第四节应用和典型工作任务

紫外-可见吸收光谱法不仅可用于有机化合物的定性分析和结构分析,而且可以进行定量分析及测定某些化合物的物理化学常数等，在药学领域中主要用于有机化合物的分析和药物杂质限量检测等。

一、定性分析

（一）定性鉴别

在有机化合物的定性鉴别及结构分析方面，由于有机化合物紫外吸收光谱，反映的是结构中生色团和助色团的特性，不完全反映整个分子特性，使该法的应用有一定的局限性。但是紫外-可见吸收光谱对于判别有机化合物中生色团和助色团的种类、位置及其数目，区别饱和与不饱和有机化合物，尤其是鉴定共轭体系，推断未知物骨架结构等有其独特的优点。

化合物紫外-可见吸收光谱的形状、吸收峰数目、强度、位置等，是定性分析的主要依据，而最大吸收波长λmax及相应的εmax是定性分析的最主要参数。进行定性分析的主要步骤：1．将试样尽可能提纯，以除去干扰杂质。

2．选择合适的溶剂，将试样制成适宜浓度的溶液，使吸光度在0.2～0.8范围内。

3．采用比较法

（1）与标准物质或纯物质吸收光谱比较在相同测量条件下，分别测定试样与标准品的吸收光谱图，并进行比较，对该化合物作初步定性鉴定。

（2）与标准谱图或光谱数据比较λmax和εmax是定性鉴别的主要光谱数据，或与标准谱图及文献核对。可将预定结构计算值与实测值进行比较。

4．应用其他化学、红外、质谱和核磁等分析方法进行对照和验证，最后作出该化合物定性鉴定的正确结论。

根据有机化合物的紫外-可见吸收光谱，可以推测化合物所含的官能团。

（1）若化合物在210～250 nm范围有强吸收带（ε≥10–4L·mol–1·cm–1），这是K吸收带的特征，则该化合物可能是含有共轭双键的化合物。

（2）如在260～300 nm有吸收峰，ε较大，则表明该化合物可能有3～5个共轭双键。

（3）若化合物在250～300 nm有弱吸收（ε=10～100），且增加溶剂极性会蓝移，说明

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可能有羰基存在。在250～300 nm有中强度吸收（ε=1000～10000），伴有振动精细结构，表示有苯环的特征等。

（4）如果一个化合物在200～800 nm范围内没有吸收谱带，表明该化合物不存在双键或环状共轭体系，可能是一个只含单键的饱和化合物，如直链烷烃或环烷烃以及脂肪族饱和胺、醇、醚和烷基氟或烷基氯等。

对于有机化合物的定性分析，通常将未知试样的紫外吸收光谱图同标准试样的光谱图进行比较，当浓度和溶剂等条件相同时，若两者图谱相同（包括曲线形状、吸收峰数目、λmax 及εmax等），则说明两者是同一化合物。

若无标准物，可与该化合物的标准光谱图进行比较。常见光谱图“The sadtler standard spectra ultraviolet”共收集46000种化合物。

（二）纯度检查

1．杂质检查

若某一化合物在紫外-可见光区没有明显吸收峰，而其杂质有较强的吸收峰，可通过试样紫外 可见吸收光谱图，检出该化合物中是否含有杂质。例如，甲醇中含有杂质苯，可根据苯在λmax=256 nm处有B吸收带，而甲醇在此波长处无吸收来确定。

如果某化合物在紫外-可见光区有较强吸收，还可用摩尔吸光系数ε来检查其纯度。例如，菲的氯仿溶液在296 nm处有强吸收，菲ε值为12600，lgε= 4.10。若用某种方法精制的菲，用紫外-可见分光光度计测得lgε值比标准菲低10%，这说明精制品的菲含量只有90%，其余很可能是蒽等杂质。

2．杂质限量检查

药物中的杂质常需制定一个允许其存在的限度。一般有以下几种方式表示：

（1）利用杂质与药物在紫外-可见光区的吸收差异，选用适当波长进行测定。在药物无吸收而杂质有最大吸收波长处测定吸收度，规定测得的吸收度不得超过某一限值。

（2）利用不同波长处吸收度的比值来控制杂质含量。如药物和杂质的光谱有重叠，利用它们在不同波长处吸收度比值（Aλ1/Aλ2）差异来检查杂质。

（3）药物在紫外-可见光区有明显吸收，而杂质吸收很弱，可以根据吸收度大小限制杂质含量。如规定供试品吸收度的上下限幅度，可在一定程度上控制产品纯度。

例12-1 《中国药典》（2010版二部）对青霉素钠的杂质限量规定如下：

【检查】吸光度取本品，加水制成每1mL中约含1.80 mg的溶液，照紫外-可见吸收光谱法（附录ⅣA）测定，在280nm与325nm波长处，其吸光度均不得大于0.10；在264nm 最大吸收波长处测定，其吸光度应为0.80～0.88。

在264nm处规定吸收度值是控制青霉素钠的含量；在280nm与325nm处规定吸收度值是控制降解产物杂质限量。

二、混合组分定量分析

根据吸光度具有加和性特点，利用紫外-可见吸收光谱法在同一试样中可以同时测定两个或两个以上组分。当溶液中有两种或多种组分共存时，可根据各组分吸收光谱相互重叠的程度，采取不同测定方法。这里只讨论两组分的定量分析。

（一）紫外-可见吸收光谱法测定双组分混合物

假设要测定试样中两个组分A、B，如果分别绘制A、B两纯物质的吸收光谱，有三种情况，如图12-10所示。

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图12-10 双组分吸收光谱

1．（a ）情况表明两组分互不干扰，可用测定单组分的方法，在λ1、λ2处分别测定A 、B 两组分的浓度。

2．（b ）情况表明A 组分对B 组分的测定有干扰，而B 组分对A 组分的测定无干扰，则可以在λ1处单独测定A 组分，求得A 组分的浓度c A 。然后在λ2处测定混合物的吸光度2

A+B A λ及A 、

B 纯物质的2A λε和2B λε值。根据吸光度的加和性，可得方程 22222

A+B A B A B A B =+=+A A A Lc Lc λλλλλεε 设吸收池厚度L 为1cm ，解方程得

222A+B A A

B B -=A c c λλλεε (12-3)

3．（c ）情况表明两组分彼此互相干扰，两组分在最大吸收波长处互相有吸收。这时可根据测定目的要求和光谱重叠情况，采取以下方法。

（1）解线性方程法

对于（c ）情况两组分混合物，在A 和B 的最大吸收波长λ1、λ2处分别测定混合物的吸光度1A+B λA 及2A+B λA ，而且同时测定A 、B 纯物质的1A λε、1B λε、2A λε及2

B λε。根据吸光度的加和性，可得方程组

1

11A+B A B A B =+A Lc Lc λλλεε （12-4） 222

A+B A B A B =+A Lc Lc λλλεε （12-5） 设吸收池厚度L 为1cm ，解（12-4）、（12-5）线性方程组得

211

22112A+B B A+B B A A B A B -=-A A c λλλλλλλλεεεεεε （12-6）

2

1122112A+B A A+B A B B A B A -=-A A c λλλλλλλλεεεεεε （12-7）

式（13-6）（13-7）中浓度c 的单位依据所用的吸光系数而定，如用比吸光系数1%1cm E ，则c 为

分析化学教研室 百分浓度。

（2）等吸收双波长消去法

双波长分光光度计检测的是试样溶液对两波长光λ1、λ2吸收后的吸光度差。 如果试样中含有A 、B 两组分，若要测定B 组分，A 组分有干扰。为了能消除A 组分的干扰，首先选择待测组分B 的最大吸收波长λ1为测量波长，然后用作图法选择参比波长λ2。

图12-11 等吸收双波长消去法示意图

如图12-11所示，在λ1处作横坐标的垂直线，交于组分A 吸收曲线一点P ，再从这点作一条平行横坐标的直线，交于组分A 吸收曲线另一点Q ，该点所对应的波长成为参比波长λ2。

组分A 在λ1和λ2处是等吸收点，12A A λλ=A A 。

由吸光度的加和性可知，混合试样在λ1和λ2处的吸光度可表示为

111

A+B A B λλλA A A =+，222A+B A B λλλA A A =+ 由于双波长分光光度计的输出信号为ΔA

12112212

A+B A+B A B A B B B λλλλλλλλ?=-=+--=-A A A A A A A A A 12

B B λλB ()?=-A Lc εε (12-8) 由此可知，仪器输出的信号ΔA 与干扰组分A 无关，只正比于待测组分B 浓度，即消除了A 对B 的干扰。

采用等吸收点法测定，在波长选择时有两个原则：

（1）干扰组分在这两个波长处应具有相同的吸光度，即吸光度之差只与一个组分的浓度有关，而与另一个组分无关。

（2）待测组分在这两个波长处的吸光度差值应足够大，以保证测定由较高的灵敏度。

三、典型工作任务

紫外-可见分光光度计价格不昂贵、仪器比较普及、操作简单方便，所以，紫外-可见吸收光谱法已成为药物分析应用最广泛的方法，是很多国家药典收载首选的药物分析方法。下列介绍紫外-可见分光光度法测定复方制剂含量的工作任务，供学生实验和训练。

【学习方法指导】

紫外-可见吸收光谱法有关基本概念和理论基础以及定性和定量的方法和吸光光度法是一致的。学习时应结合前面学习吸光光度法有关知识，在掌握紫外-可见吸收光谱法基本原理和基本概念的基础上，理出一条主线，即教材的知识脉络，抓住以下几个重点：1．明确紫外-可见吸收光谱的产生原理及其特性。弄清化合物分子结构和紫外吸收光谱的关系。吸收光谱的形状及吸收峰所在位置可作为化合物定性的依据，从而理解应用紫外吸收光谱在有机化合物进行定性分析方法。

2．光谱定量分析的基础是朗伯-比尔定律，是紫外-可见吸收光谱法的基本原理。以吸

收峰的强度作为定量的依据，可进行物质混合组分定量测定和纯度的检查。