水牛基因组学研究进展

水牛基因组学研究进展

摘要：基因组学包括了生物基因组的组成、结构和功能。目前大部分对于牛科动物的研究都集中在普通牛，而对水牛的基因组学研究比较少。本文综合介绍了水牛基因组的组成、演化和在分子遗传图谱方面的努力。水牛在经济上有着极其重要的地位，和牛的染色体有超高的同源性，本文详细论述了牛和水牛染色体之间的高度的同源及差异。

关键词：水牛；基因组；染色体

1.1 简介

1.1.1 分类学描述

水牛属于牛族牛科反刍目。世界上所发现的水牛主要有两种：非洲水牛和亚洲水牛。亚洲水牛起源于公元前三千年的印度/或公前五千年的中国。非洲水牛起源于非洲中部，是一种主要生活在埃塞俄比亚、索马里、赞比亚、津巴布韦、纳米比亚、博茨瓦纳、莫桑比娅、南非、肯尼亚和坦桑尼亚的野生品种。目前有大约900、000头非洲水牛，当前数目正在减少。水牛有众所周知的两个极端的类型：草原水牛（数目最多）和森林水牛（仅60000头），通常又被分成两个或三个亚种：大型黑色草原水牛或海角水牛、非洲野牛；小的微红色森林水牛；和介于中间的苏丹水牛来自西非。第四个亚种我们熟知的残留下的山脉水牛被很多官方机构鉴定出的，然而东方把森林水牛分为三个亚种：西非水牛、中非水牛、南非水牛，此外还有矮小水牛作为一个独立的组。

细胞遗传学研究显示非洲野牛有2n=52条染色体且基本的数目等于60，刚果野牛是2n=54且基本数目是60。这两个亚种杂交,尽管F1代2n=53可能因为出现不平衡的配子降低生育力，产生染色体不均等的受精卵。这些受精卵在早期的胚胎生活中死亡，就像牛罗布杂合子基因携带者。这两个物种在染色体组上的主要区别在于出现了四号和三号双臂常染色体对，同时其他染色体是近端着丝粒的，包括X和Y染色体。非洲野牛的双臂染色体对应与牛染色体着丝粒的融合易位（1；13，2；3，5；20，11；29）。

亚洲水牛有两个亚种：河水牛染色体组2n=50和FN=60，沼泽水牛染色体组2n=48和FN=58。显然这些亚种仅有一个染色体对的差异，沼泽水牛的1号染色体相当于河水牛的4号和9号染色体串联融合易位形成的。因此两个亚种间染色体臂和双臂的染色体对是保守的。两个品种杂交能产生后代，但杂种只有49条染色体生育力低下。

河水牛有5条双臂常染色体，所有剩下的都是近段着丝粒的包括X和Y染色体。河水牛的五条双臂相当于五天着丝粒融合的染色体：BBU1 (1;27-U10/U25)，BBU2(2;23-U17/U20)，BBU3(8;19-U18/U21)，BBU4(5;28-U3/U29)，BBU5(16;29-U1/U7)。双臂染色体的融合伴随着一些组成性异染色质的丢失，双臂染色体的着丝粒带有很小的C显带与所有近端着丝粒染色体的着丝粒相比，包括X在内，表现出大异染色质块。Y染色体依照变性程度的不同表现出变化的C显带形式。事实上，Y染色体好像完全异染色质化或远侧带有强的C显带。因此，C 显带技术（特别是CBA显带）把和水牛的性染色体从常染色体中区分出来还用于研究河水牛的染色体畸形。

因为河水牛的BBU4起源于牛5号染色体和28号染色体着丝粒融合，河水牛的BBU9和牛7号染色体同源，剩余的牛染色体在沼泽水牛的染色体组中出现1：BTA5(U3)，BTA28(U29)，还有BTA7（U22）。串联融合过程，BBU9的着丝粒好像被删除或失活同时核仁组织区BBU4p 的端粒消失。事实上，河水牛有六条核仁形成体染色体位于3p、4p、6、21、23和24的端粒，同时沼泽水牛有五条核仁组织染色体。然而，用相似与牛科SATⅠ和SATⅡ且包含卫星DNA的河水牛探针做荧光原位杂交，结果显示沼泽水牛1q染色体附近的区域仅有SATⅠ探针，尽管如此，近段着丝粒染色体比双臂染色体的信号密度强。这个结果通过C显带也得到证实。SATⅡ探针在所有染色体的着丝粒区有信号但在沼泽水牛1q染色体的临近末端却没有。因此，

河水牛BBU9HC的大部分和卫星DNA以及BBU4p端粒的核仁组织区在染色体串联融合易位过程中消失了，形成了沼泽水牛的1号染色体。

因为非洲水牛和亚洲水牛之间没有同源的双臂染色体，它俩之间的杂交是不可能的因为杂种的染色体组不均等。因此两个独立的种属的划定也要考虑染色体形态学。

另外一种亚洲水牛目前濒临灭绝，安诺亚低地水牛2n=48,这些水牛生活在印尼苏拉威西岛有两个亚种：低地小野牛和山脉小野牛。这个品种是世界上最小的水牛，成年个体70到100cm高，体形有山羊大小。这个物种跟亚洲河水牛很相似。事实上，小野牛染色体组中的六条双臂染色体有四条是牛同源的染色体着丝粒融合易位形成的，这很相似与亚洲水牛的情况，然而小野牛其它的双臂染色体是一种牛染色体不一样的结合。

应用了六条现代技术和G和R显带符号的标准染色体组型已经在河水牛上建立。水牛、牛、山羊和绵羊的比较遗传学标准染色体组型已经建立和牛染色体组中用的G/Q和R显带应用了相同的符号。这些结果被用于建立牛的G和R显带图，还用于判断水牛和其他牛科动物的同源性。

1.1.2 经济重要性

世界上共有168百万头水牛，其中161百万头在亚洲，3.7百万头在非洲，3.3百万在南非，50万在欧洲，40万在澳大利亚。虽然全世界的水牛数量占牛总数的1/9，跟其他家畜相比显然人类对水牛的依靠更大，特别在东南亚。因此，水牛有极大的经济重要性。此外，不同于其他驯养的牛科动物，全世界水牛的数量在过去的20年中以平均2%的速度增长，其中增加最快的是欧洲4.5%每年，印度5.3%每年，巴基斯坦4.8%每年。在意大利，从1957年到2001年水牛的数目增长了1600%。

大多数河水牛品种分布在印度巴基斯坦地区及周边地区。地中海品种发现在意大利、埃及、伊朗、土耳其、罗马尼亚、伊拉克、保加利亚、叙利亚和希腊。意大利地中海品种有一个分支，有大约30万头，主要分布在坎帕尼亚。自从公元5到7世纪从北非(埃及)引入后这些品种没有跟其他的品种杂交，而其他邻近的地中海国家的牛主要和印度摩拉水牛品种进行了杂交。

有3.345亿头水牛分布在南美，仅巴西就有3亿头。因为水牛从印度和地中海国家引入到南美，还有存在沼泽水牛的澳大利亚菲律宾，河水牛和沼泽水牛的杂交在很多南美国家存在。沼泽水牛主要有菲律宾、马来西亚、泰国、澳大利亚和中国饲养，数量有2.3亿头。在中国沼泽水牛在1950到1970年间和来自印度巴基斯坦的河水牛杂交。虽然沼泽水牛被认为只有一个品种，但春喜和中泉发现了18个品种，它们分别在中国不同的地方进化形成。然而并没有对这18个品种进行遗传学分析鉴定。

河水牛既可以奶用也可肉用。很多国家（特别是印度、巴基斯坦、埃及和尼泊尔）50%的奶供给人喝，在意大利牛奶被用于制作奶酪，主要是马苏里奶酪。不同品种的牛产奶的组分也不同蛋白变化与4.2到4.6%，脂肪在6.0到8.5%之间。有记录的最高产的水牛是摩拉水牛、尼里拉菲水牛和地中海品种（1500-2800kg/哺乳期）。然而，首先保持产奶记录的是意大利，那里的母牛大都被注册为意大利地中海品种。河水牛的产奶量比牛丰富不管在蛋白含量（4.65%）还是在脂肪含量（8.30%），这可以解释一些国家用它来做奶酪，特别是意大利。牛奶中酪蛋白的百分含量在河水牛和牛之间是不同的。α- s1在水牛中30.2%牛中38%，α-s2酪蛋白在水牛中17.6%奶牛是10.5%，β酪蛋白在水牛中33.9%而奶牛36.5%，K-酪蛋白水牛15.4%奶牛12.5%。肉用水牛的生产在很多国家很普遍且近年来意大利在增加。水牛肉的胆固醇含量比牛肉低1/3，因此被推荐为低胆固醇饮食。

1.1.3 育种目标

因为在牛奶的产量上沼泽水牛远低于河水牛，一项用沼泽水牛和河水牛杂交的计划菲律宾，中国和澳大利亚进行。然而这项计划能否成功已经被妥协了，因为杂种的染色体组2n=49

因为染色体不均衡而存在生育问题，高的产奶量还需要足够多的食物，在这些国家是非常普遍但却不现实的，特别是那些小农场。

在特殊的品种里，育种计划把重点放在产奶量的遗传改良利用后裔检测和记录产奶特征。水牛产奶量记录比例最高的在意大利有28.6%，其次是保加利亚（8.5%）伊朗（4.5%）。

意大利目前正在实施一项计划，和水牛养殖协会合作进行公牛细胞遗传学的研究以及已生殖为中心的母牛的生殖问题。20%有生殖问题的母牛是因为性染色体畸形造成的，比如X单体、X三体、性反转综合症和双性双胎不育症，并且所有母牛携带者都因为内在的生殖器官损坏而不能生育。双性双胎症是最普遍的一种，所有的病例都是单胎生的，这表明它的孪生兄弟在胚胎期就已经死亡。和双性双胎综合症相似，内生殖器官表现出不同的损害，这跟雄性细胞的百分比没有相互关系。双性双胎的不同效果是因为胚胎的结合时间不同造的，牛是2-3周，水牛是3-4周，此外还有性别的分化时间，牛是的雄性孪生兄弟为40-50天而雌性要一周以后。

1.2 分子遗传学

1.2.1 经典图谱制作的努力

关于水牛的遗传变异和系统发育的研究很少。一些支持者研究过亚洲水牛11个种群21个微卫星位点，他们描述了河水牛和沼泽水牛以及品种间等位基因存在的显著变异。有人利用27个微卫星位点研究印度8个品种间的遗传变异。这项研究在户田品种鉴别出了166个等位基因，在萨那和摩拉水牛高达194个。这项研究鉴别出有些品种是单一血统的，有的则是混合血统的。这个结果可以指导合理的育种=和保种计划对于印度水牛。

有一项分析牛科动物20个微卫星的研究来比较牛科动物的不同品种，其中包括了水牛。结果表明家牛和印度牛最先分组，接下来是大额牛和牦牛。然后北美野牛分化出来而亚洲水牛和非洲水牛是分化出来的两个最大的品种。以AFLP指纹识别为基础的系统发育学分析显示三个进化树枝的重建：非洲水牛和河水牛，公牛和瘤牛，北美野牛和欧洲野牛。线粒体D-环DNA序列分析决定80头水牛，包括19头沼泽水牛和61头河水牛，结果显示仅有一个驯化的河水牛事件，发生在印度半岛5000年前。在东南亚大陆，这些种群和野生水牛或来自中国的家养种群混种。主要组织相容性复合体多态DRB以及DRA位点在沼泽水牛和三个河水牛品种上做过研究。8个DRB等位基因在所有和水牛和沼泽水牛中发现。河水牛中2个DRA等位基因被认为是非常重要的，在哺乳动物DRA是高度保守的肽，特别在反刍动物因为它是发现的仅有的非肽结合位点。河水牛性别决定基因完全编码区域序列已经能被断定。这个序列也用于查看性反转综合症突变。

水牛白介素-12基因序列和表达分析表明水牛和牛科动物的IL12序列显著一致且和牛科免疫细胞有功能互作。印度水牛白介素-18基因的cDNA全长确定，而结果显示与牛和绵羊有相似的氨基酸序列。

1.2.2 遗传图谱和比较图谱的建设

利用体细胞杂交板和荧光原位杂交技术对基因和位点的任务已经实施。第一个遗传图谱包含了54个位点，主要是荧光原位杂交确定的。第一张遗传图，每一条水牛的染色体或染色体臂分配到至少一个牛科动物的分子标记。后来图谱改进增加到99个基因和293个位点。后来又发展到171个基因和122个位点，大部分是微卫星。293个位点中，247个是荧光原位杂交确定的。

一张高级的水牛的细胞遗传图谱如图5所示。它包括了以前的一些图和荧光原位杂交图位点：SLC26A2到BBU9q26；SMN到BBU19q13；LEP到BBU8q32；FHIT到BBU21q24；GDF8，TTN，GCC，NEB，CXCR4，MYL1，ACADL，IGFBP2，和FN1到BBU2q；MUC1到BBU6q13；TRG2到BBU8q17；UMN0301，UMN0504到BBUY。水牛上总的位点数现在为309。其中186个为I型和124个为∥型。虽然有一些染色体带还没有被标记，特别是染色体1q，3q，7，9，

12，21，和24，这些细胞遗传图谱涵盖了所有的染色体和染色体区，增加了我们队水牛基因组的认识，特别是考虑到连锁图谱的缺乏，初步的放射杂交图谱已经在近期实施。特别的，更周密的图谱将会出现，对于BBU1p，BBU2q，BBU3p，BBU6prox，BBU8dist，BBU14，BBU15prxo，BBU16，BBU18，BBU20，BBU-X，和BBU-Ydist。

为了发现保守的染色人体片段和同线型，比较图谱研究已经在水牛和其他相关物种之间开展，例如水牛和人类之间。这些研究显示了牛科动物常染色体间高水平同源。的确，牛、水牛、绵羊和山羊的所有常染色体存在相同的染色体带型和基因顺序早已发现。仅有的例外是牛科（牛和水牛）与羊（绵羊和山羊）的9号和14号染色体。的确，连锁和荧光原位杂交图分析证明，一个简单的从牛9号染色体到羊14号染色体近着丝粒片段易位/反转造成了这两条染色体的差异。牛9号染色体和人的染色体比较显示牛9号和HSA9比羊9跟HSA6q之间存在更加保守的同线型。因此，羊的染色体组型是从牛衍生出来的。

和牛的常染色体高的相似度相比之下，性染色体通过复杂的染色体中心排列产生分歧。牛的X染色体主要是三种类型中的一种：亚中间着丝粒牛型，近段着丝粒大羚羊（水牛）型，近段着丝粒绵羊（山羊）型带有小的明显的p臂。染色体显带比较证明这些染色体的大部分是保守的，BBU-X带有大块基本的异染色质而BTA-X、OAR/CHI-X没有。牛、水牛和山羊/绵羊的X染色体上基因座的顺序的更加详细的比较细胞遗传图谱表明在这些物种染色体组进化过程中复合染色体发生重排。特别的，BTA-X和BBU-X有相同的基因序列而着丝粒的位置不同。因此，着丝粒的转位（重新定位）随着组成型异染色质的消失使BTA-X不同于BBU-X。当比较牛的X染色体和羊的X染色体，发现至少有四个染色体变位其中包含一个着丝粒重新定位。

牛的Y染色体也存在相同的情况。确实，荧光原位杂交图分析比较在牛、瘤牛、水牛和羊的Y染色体上进行，结果显示存在复杂的染色体重排。特别的BTA-Y和BIN-Y因着丝粒变位或臂间倒位而相异，然而它们的末端保持着相同的基因顺序。BTA-Y和BBU-Y因臂间倒位产生差异并伴随着组成性异染色质的消失或增加，BBU-Y比BTA-Y大。OAR-Y/CHI-Y不同于BBU-Y 因为臂间倒位和较大片段的组成性异染色质的缺失，BTA-Y和BIN-Y是着丝粒的变位伴随着HC的消失。

利用人类染色体片段作探针鉴别出至少41个人类和水牛间保守的片段。详细的细胞遗传学图谱表明人类染色人体片段存在水牛上的比被分解的要多，说明水牛和人类染色体存在复杂的染色体重排并带有大的染色体保守区。例如，HSA2q和HSA1p探针包含了全部的BBU2q，大致了仅有三个人类片段。然而，在牛科动物染色体HSA2q和HSA1p做的1型位点高分辨率比较原位杂交图谱显示至少十天人类的片段，9条在HSA2q一条在HSA1p。这些复杂的染色体重排让牛科和灵长类产生差异的过程发生在大约1亿年前。

另一个重要的进化观点的参数以核仁组织区为代表，都位于驯养牛科动物5号（牛、羊、沼泽水牛）和六号（河水牛）的常染色体端粒区。考虑到牛科动物间常染色体的高度保守，我们期望找到牛科动物间相同的何人组织染色体，但是反而，由于简单的NOR易位，仅有少部分NORs和同源染色体或臂保守。特别的，仅有两个NOCs是水牛和牛共有的，同样水牛和羊也是。这四个牛科动物共有一个NOC，然而绵羊和山羊有共同的NOC，证明它们的进化亲近性。

1.3 未来的工作范围

连锁和RH图谱对于水牛基因组的发展是至关重要的。特别的重点应该放在QTL上一些在其他物种上发现的生产形状。包括连锁、RH、荧光原位杂交在内的多样的合作研究应该实施来提高我们对水牛基因组的认识。细胞遗传图谱是一个合适的切入点。水牛和牛染色体的超高同源性和即将来临的牛基因组测序将会很快增加我们对这个经济上极其重要品种的认识。

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