TMT标记定量蛋白质组学
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TMT标记定量蛋白质组学
一、技术概述
TMT?（Tandem Mass Tag?）技术是由美国Thermo Scientific公司研发的一种多肽体外标记技术。该技术采用10种同位素的标签，标记多肽的氨基基团，经过LC-MS/MS分析，可同时比较10组不同样品中蛋白质的相对含量。
TMT技术是常用的差异蛋白质组学技术，在疾病标记物筛选、药物作用靶点、动植物抗病/抗胁迫机制、动植物发育分化机理等领域都有广泛应用。
二、技术原理
TMT试剂由三部分组成：质量报告基团、质量标准化基团和氨基反应基团。
质量报告基团有10种不同的分子量，质量标准化基团也10有种不同的分子量，与不同的报告基团搭配，能保证被标记的不同来源的同一肽段在一级质谱中具有相同的质荷比；氨基反应基团能与肽段N端及赖氨酸侧链氨基发生共价连接使肽段连上标记。
一级质谱中，任何一种TMT试剂标记的不同样品中的同一肽段表现出相同的质荷比；二级质谱中，可切割键（箭头所指）断裂释放出TMT报告离子，在质谱低质量区产生了10个TMT报告离子峰，其强度反应了该肽段在不同样品中的相对表达量信息，另外二级质谱中的肽段碎片离子峰质荷比反应了该肽段的序列信息；这些质谱原始数据经过数据库检索，可得到蛋白质的定性和相对定量信息。
三、技术优势
1.灵敏度高：低丰度蛋白也能检测出；
2. 适用范围广：几乎可对任何物种的各类蛋白质进行分离鉴定；
3. 高通量：能同时对10组样本中包含的蛋白进行鉴定及表达差异分析；
4. 高效：液相色谱与串联质谱连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。
四、技术流程
蛋白样本制备——胰酶酶解——TMT标记——肽段混合——LC-MS/MS检测——数据库检索——数据分析
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蛋白质组学研究方法选择及比较
蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型：
●二维电泳+质谱(2D/Mass Spectrometry, MS) ●表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization- time of flight, SELDI) ●同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) Protein Array or Mass Spectrometry？ 如何选择合适的研究方法？以下将从六个方面进行比较与推荐： 1.筛查蛋白组学表达差异 建议选择：RayBiotech（1000个因子的芯片）+质谱 a)不同的方法学有不同的特点：对于质谱，可以筛查到未知的蛋白，但是对于分子量大、 低丰度的蛋白质，质谱的灵敏度和准确性有一定的限制。 b)不同的方法能筛查到的目标不同：根据Proteome Analysis of Human Aqueous Humor 一文中报道，质谱筛查到的差异蛋白集中在小分子与代谢物。而用RayBiotech芯片筛查到的结果，多是集中在细胞因子、趋化、血管、生长等等。 c)质谱筛查到355个蛋白，而RayBiotech抗体芯片也筛查到328个蛋白，且用定量芯片 验证25个蛋白有差异，这些蛋白是质谱找不到的。目前RayBiotech夹心法抗体芯片已经可以检测到1000个蛋白，采用双抗夹心法，尤其是对于低丰度蛋白，有很好的灵敏度和特异性，很多的低丰度蛋白是抗体芯片可以检测出来，而质谱检测不到的，且样品不经过变性和前处理，保持天然状态的样品直接检测，对于蛋白的检测准确度高。 d)质谱的重复性一直是质谱工作者纠结的问题，不同操作者的结果，不同样品处理条件， 峰值的偏移等影响因素都会产生大的影响；RayBiotech的夹心法芯片重复性高。
蛋白质组学期末复习题
蛋白质组学相关试题及答案 解释 1． Proteome(蛋白质组)：由一个细胞或者组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质，称为蛋白质组。 2. Proteomics(蛋白质组学)：指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴学科，即研究细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定。更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能. 3. Mass Spectrometer（质谱仪）：质谱仪是一个用来测量单个分子质量的仪器，但实际上质谱仪提供的是分子的质量与电荷比（m/z or m/e）。分离和检测不同同位素的仪器。即根据带电粒子在电磁场中能够偏转的原理，按物质原子、分子或分子碎片的质量差异进行分离和检测物质组成的一类仪器。质谱仪最重要的应用是分离同位素并测定它们的原子质量及相对丰度。 4. Proteome sample holographic preparation（蛋白组样品的全息制备）：（1）keep protein information （2）adapted to separation and identification methods （3）different samples,different extraction. 蛋白质样品制备是蛋白质组研究的第一步，也是最关键的一步。因为这一步会影响蛋白质产量、生物学活性、结构完整性。因此要用最小的力量使细胞达到最大破坏程度同时保持蛋白质的完整性。原则是，保持蛋白质的所有信息；选择合适的分离和鉴定方法；对于不同的样品要用不同的提取方法。 5. Post translational modification(蛋白质翻译后修饰) 肽链合成的结束，并不一定意味着具有正常生理功能的蛋白质分子已经生成。已知很多蛋白质在肽链合成后还需经过一定的加工（processing）或修饰，由几条肽链构成的蛋白质和带有辅基的蛋白质，其各个亚单位必须互相聚合才能成为完整的蛋白质分子。 6. De novo sequencing(从头测序) 从头测序为蛋白质组研究提供了一种不用借助于任何蛋白质序列数据库信息，直接解读串联质谱数据的方法。其基本算法主要由4个部分组成：质谱图的构建、
定量蛋白质组学的方法有哪些 (2).doc
定量蛋白质组学的方法有哪些？ 1背景和意义 从生命活动的直接执行者——蛋白质的角度研究生命现象和规律（特别是疾病防治和病 理研究）已成为研究生命科学的主要手段。而这些研究往往离不开对细胞、组织或器官中含有蛋白质种类和表达量的研究。对处不同时期、不同条件下蛋白质表达水平变化的研究，识别功能模块和路径，监控疾病的生物标志物，这些研究都需要对蛋白质进行鉴定和定量。生物质谱技术的出现和不断成熟为蛋白质差异表达分析提供了更可靠、动态范围更广的研究手段。基于质谱技术，科学家们不断开发出新的定量蛋白质组学方法，来了解细胞、组织或生物体的整体蛋白质动力学。 2方法学介绍 目前较主流的定量蛋白质组学方法有 5 种，分别是Label-free 、 iTRAQ 、 SILAC 、 MRM(MRM HR) 、和 SWATH 。简述如下： 2.1Label-free Label-free 定量，即非标记的定量蛋白质组学，不需要对比较样本做特定标记处理，只 需要比较特定肽段 /蛋白在不同样品间的色谱质谱响应信号便可得到样品间蛋白表达量的变 化，通常用于分析大规模蛋白鉴定和定量时所产生的质谱数据。 Label-free 操作简单，可以做任意样本的总蛋白质差异定量，但对实验操作的稳定性、 重复性要求较高，准确性也较标记定量差。因此，Label-free 技术适合于大样本量的定量比较，以及对无法用标记定量实现的实验设计。 2.2 iTRAQ iTRAQ 定量是目前定量蛋白质组学应用很广泛的技术，该技术的核心原理是多肽标记 和定量，将多肽的含量转化为 114、115、116 和 117 同位素的含量 (或 113、114、115、116、117、118、119 和121 的 8 标记 )，从而简化了定量的复杂性，最终通过多肽定量值回归到蛋 白的定量值，从而最终测定出不同样本之间蛋白质的差异。 iTRAQ定量不依赖样本，可检测出较低丰度蛋白，胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外 蛋白等，且定量准确，可同时对8 个样本进行分析，并可同时得出鉴定和定量的结果，特别 适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析。金开瑞质谱平台应用 iTRAQ 定量技术，可鉴定多达 6000 种蛋白（以人 HepG2 为例），重复样品间的蛋白表达量 相关性可达到0.95 以上。 2.3SILAC SILAC 定量的基本原理是分别用天然同位素(轻型 )或稳定同位素(中性或重型 )标记的必 需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞经 5-6 个倍增周期后，稳定同位素标记的氨基 酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋 白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定，根据一级质谱图中两个同位素型肽段的面积 比较进行相对定量，属于体内代谢标记法。 SILAC 属于体内标记技术，更接近样品真实状态，标记效率高达100% ，且标记效果稳 1
微生物蛋白质组学的定量分析
微生物蛋白质组学的定量分析 王敬强 殷剑宁 刘斯奇3 (中国科学院遗传与发育生物学研究所基因组信息学中心,北京101300) 摘要 越来越多的微生物基因组序列数据为系统地研究基因的调节和功能创造了有利条件.由于蛋白质是具有生物功能的分子,蛋白质组学在微生物基因组的功能研究中异军突起、蓬勃发展.微生物蛋白质组学的基本原则是,用比较研究来阐明和理解不同微生物之间或不同生长条件下基因的表达水平.显而易见,定量分析技术是比较蛋白质组学中急需发展的核心技术.对蛋白质组学定量分析技术在微生物蛋白质组研究中的进展进行了综述. 关键词 微生物,蛋白质组学,定量分析 学科分类号 Q51 在基因组研究热潮的推动下,蛋白质组学正在从一个符号变成一门蓬勃发展的严肃学科.但是,它所面临的技术瓶颈区域却日益尖锐地摆在研究者面前[1].因此实现蛋白质组学的技术革命是学科是否健康发展的基本前提. 大规模基因组序列测定的目的在于精确地了解某一生物体的基因结构以及基因数量.蛋白质组的分析则着重于阐明某一生物体的某一组织或某一细胞,甚至是某一细胞器在某一时间点上基因表达的水平.因而,在基因组已经确定的前提下,蛋白质组分析所关心的问题是基因表达量的“有与无”或“多与少”[2].蛋白质组表达差异分析的主要问题是如何合理地比较蛋白质组之间的差别,即如何分析不同细胞或不同时刻之间各种蛋白质表达的相对丰度.因此建立一套稳定的参照系统和一套普通适合的测定度量是非常关键的.由此可见,定量测定是蛋白质组分析的一个核心技术问题. 分子生物学和基因组学的发展均以简单生物系统作为突破口,蛋白质组研究也概莫能外.微生物体作为一种理想的生物材料,已被广泛地应用于这些研究中[3].对研究蛋白质组的分析技术而言,微生物具有以下突出的特点:a1微生物的基因组比较小,基因和细胞器结构相对简单,并且蛋白质修饰水平较为低下,因此微生物细胞蛋白质组所含的蛋白质数量比其他高级生物系统要少得多.b1微生物的培养条件可以严格地控制,因此可以在设计的实验条件下,观察微生物蛋白质组表达水平的变化;c1在微生物研究领域中,细胞学、分子生物学和基因组学已经积累了丰富的数据,这些构成了蛋白质组研究的坚实基础;d1微生物的实验周期短,取材简单、便宜.这些都是开发分析技术的理想条件. 蛋白质组定量的概念是试图准确地测定蛋白质组间相对含量的差别,而不在于测定其绝对浓度.根据蛋白质组分析的手段,定量方法可大致分为电泳定量法和色谱定量法;根据处理蛋白质方法不同,又可分为体外标记法(labeling i n vit ro)和体内标记法(labeling i n vivo). 1 体外标记的电泳定量法 这种定量法一般采用不同的蛋白质显色剂,将电泳分离的蛋白质染成可被肉眼或机器识别的斑点,然后运用图像分析软件定量比较斑点的吸光度差别. 111 直接染色比较法 虽然双向电泳(two2dimensional electrophoresis, 2DE)并非一种理想的定量分析系统,但是它可以直观地反映蛋白质表达的差异.考马斯亮蓝染色法和银染法是两个普遍使用的染色方法.考马斯亮蓝染色的敏感性较差(约100ng),银染的敏感性虽然较高(1～10ng),但它的浓度动力学范围较窄.因此这两种方法不适合于相对严格的定量分析比较.目前公认的理想方法是荧光染色,最常用的是Molecular Probe公司生产的SyPro Ruby.这种试剂在敏感性(100fmol)和动力学方面(103)都基本可以满足蛋白质组定量分析的要求[4].传统的以双向电泳(2DE)为基础的差异蛋白组分析分为 3通讯联系人. Tel:010*********,E2mail:siqiliu@https://www.360docs.net/doc/f41640603.html, 收稿日期:2002212210,接受日期:2003201228
比较蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术
进展评述 比较蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术 刘新1,2 应万涛1,2 钱小红1,23 (1军事医学科学院放射与辐射医学研究所 北京 100850;2北京蛋白质组研究中心 北京 102206) 摘 要 比较蛋白质组学是指在蛋白质组学水平上研究正常和病理情况下细胞或组织中蛋白质表达变化,以期发现具有重要功能的生物标识物,为疾病的早期诊断提供依据。近年来它正成为蛋白质组学研究的热点和发展趋势。比较蛋白质组学的研究方法和策略有多种,本文就最近几年来稳定同位素标记技术(体内代谢标记技术和体外化学标记技术)在比较蛋白质组学研究中的进展进行综述。 关键词 比较蛋白质组学 稳定同位素标记 体内代谢标记 体外化学标记 Application of Stable Isotope Labeling in Comparative Proteomics Liu X in1,2,Y ing Wantao1,2,Qian X iaohong1,23 (1Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing100850; 2Beijing Proteome Research Center,Beijing102206) Abstract C omparative proteomics is the research of protein expression changing between normal and pathological cell or tissue on the proteome level.P otential biomarkers w ould be discovered from the research by comparative proteomics, which will be helpful to the diagnosis and therapy of diseases.In the recent years,it has been becoming the hot spot of the proteomics research and many strategies used in comparative proteomics have been developed.During those approaches,the strategies based on stable is otopic labeling coupled with mass spectrometry have been extensively used and lots of success ful applications have been reported.In contrast to the traditional radioactive is otope labeling method,stable is otope labeling technique was not radioactive and the operation is simple.Metabolic labeling in viv o and chemical labeling in vitro are tw o parts of stable is otope labeling technique,which both have various advantages and disadvantages.This paper reviewed the progress of stable is otope labeling technique in comparative proteomics. K ey w ords C omparative proteomics,S table is otope labeling,Metabolic labeling in viv o,Chemical labeling in vitro 随着人类基因组精确图谱的公布,基因组功能的阐明已经成为生命科学研究中一项极重要的任务[1]。蛋白质是基因的最终产物同时也是基因功能的最终执行体,因而人类基因的表达及其功能有待于在蛋白水平上揭示。蛋白质组学的研究目的是分离和鉴定组织或细胞中的所有蛋白质。生物体在生长发育过程中,基因组是相对稳定的,而蛋白表达是高度动态变化的,并且具有严格调控的时间和空间特异性[2]。为了研究生物体在不同状态下表达的所有蛋白质的动态变化,比较蛋白质组学应运而生,即在蛋白组学水平上,研究在正常生理和病理状态,或受到不同的外部环境刺激下,或在突变等因素影响下,蛋白质表达的变化情况,以期发现生物体内关键的调控分子及与疾病相关的蛋白质标志物,最终为疾病的防诊治、新型疫苗的研发等提供理论依据。 为了研究蛋白质表达的动态变化,基因表达检测技术,如微阵列法[3]、DNA(脱氧核糖核酸)芯片法[4]等曾被广泛使用。这些方法虽然能够实现对mRNA(信使核糖核酸)进行定性和定量分析,但 刘新 男,27岁,博士生,现从事比较蛋白质组学研究。 3联系人,E2mail:qianxh1@https://www.360docs.net/doc/f41640603.html, 国家自然科学基金(20505019、20505018)、国家重点基础研究发展规划项目(2004C B518707)和北京市科技计划重大项目(H030230280190)资助项目 2006207220收稿,2006209221接受
非靶向蛋白组学定量技术
非靶向蛋白组学定量技术: SILAC, iTRAQ, TMT 定量蛋白组学的研究意义 人类基因组完整图谱于2003年正式公布，这标志着生命科学的里程碑性事件——人类基因组计划的顺利完成，生命科学研究也进入了后基因组时代。这一计划的初始目的是在基因层面研究人类疾病机制，设计基因药物，进行精准医疗。但是时隔十多年年过去了，效果远没预期的理想。其中主要原因可能是，我们现有的研究工作和背景知识不足以将庞杂的基因组数据直接同人类疾病联系起来。而蛋白组学能更直观的将基因与疾病联系起来，逐渐成为研究热点之一。定量蛋白组学是将某一基因组或者某一复杂体系表达的全部蛋白质进行鉴定和精准定量的学科，是蛋白组学研究的重要分支。 基于质谱的蛋白质定量 20实际80年代中期出现了MALDI（基质辅助激光解吸附电离）和ESI（电喷雾电离）两种软电离方法，可以将蛋白质或者多肽离子化，从而引入质谱仪种进行定性和定量分析，从此生物质谱技术成为蛋白组学最重要的分析工具之一。
图1. 生物质谱仪器。 利用生物质谱技术，主要有两种蛋白组学研究策略： Top-down strategy：Top-down（自上而下法）通常的做法是，先利用二维凝胶电泳分离蛋白，再将完整蛋白直接离子化后引入质谱分析，借助生信分析工具和蛋白数据库进行数据比对，从而实现对蛋白的鉴定。 Bottom-up strategy：Bottom-up（自下而上法）通常的做法是，先将样品用酶进行处理，多维色谱分离后引入质谱分析，再借助生信分析工具和蛋白数据库进行数据比对，最后实现对蛋白的鉴定。 蛋白定量分为相对定量和绝对定量，由于电泳技术具有重复性差等缺点，而多维色谱能将样品酶解物稳定分离，因此蛋白的绝对定量多采用自下而上的方法。虽然绝对定量似乎更为理想，但是绝对定量更为复杂和昂贵，而相对定量在很多时候就能满足科研需求，因此，相对定量更为常用。利于质谱技术，可根据特定质谱峰的信号强度来确定蛋白质含量，主要的方法又分为非靶向定量蛋白组学（标记定量和非标记定量）和靶向定量蛋
正确理解定量蛋白质组学
正确理解定量蛋白质组学 上期分享的蛋白组学内容，是不是有些小伙伴还绕在云里雾里呀？这次，小编用实例说话，帮您梳理清楚。 Label-free定量 Label-free定量，顾名思义就是不需要对比较样本做特定标记处理，只需要比较特定肽段/蛋白在不同样品间的色谱质谱响应信号便可得到样品间蛋白表达量的变化，通常用于分析大规模蛋白鉴定和定量时所产生的质谱数据。 Label-free技术又可分为基于谱图数（Spectra Count，简称SC）和基于肽段母离子强度（或色谱离子流的峰面积即XIC）两种方法，后者更准确，使用更广泛。 技术特点 无需标记，操作简单； 不受比较样品数限制； 对实验操作稳定性、重复性要求高； 准确性较标记定量差； 要求至少做三次技术重复或生物重复。 适用范围 适合大样本量的定量比较； 对无法用标记定量实现的实验设计，易用label-free技术； 经典案例 题目：Label-free global serumproteomic profiling reveals novel celecoxib-modulated proteins infamilial adenomatous polyposis patients（利用Label-free定量技术进行家族性腺瘤息肉病患者血清的全蛋白质组分析，寻找Celecoxib调控蛋白） 期刊：Cancer genomics proteomics 主要技术：Label-free定量 文章摘要：Celecoxib是一种环氧合酶选择性抑制剂，能够对患有预防家族性腺瘤性息肉病（FAP)和散发性大肠癌的病人进行防治。为了识别其具体的作用机制，本文采用多维色谱分离方法结合电喷雾串联质谱，使用Label-free定量技术，比较经Celecoxib 处理前、后血清样品的蛋白质组表达量差异。发现了83个可能为Celecoxib响应的表达量显著差异蛋白。通过Western blotting方法，在FAP病人和结肠直肠癌细胞系中进一步确认了一些Celecoxib调控蛋白，为进一步进行Celecoxib作用机制的大规模临床试验奠定了基础。
定量蛋白质组学操作步骤
定量蛋白质组学操作步骤 1试剂配制 裂解缓冲液：8M 尿素，PBS缓冲体系, pH8左右, 1 mM PMSF, 1 mM蛋白酶抑制剂cocktail BCA试剂盒用于测定蛋白浓度，平行测定三次 胰蛋白酶（1 μg/μL，Promega质谱级） 二硫苏糖醇（1M，用超纯水配制），碘乙酰胺（1M，用超纯水配制），三氟乙酸，乙腈 注意： 裂解缓冲液必须要有缓冲体系（PBS或者Tris-HCl），防止蛋白聚沉； 8M尿素配制好后，避免长时间放置于室温，可存放在-20°或者现配先用。 2 蛋白提取 （1）向细胞或者研磨好的组织中加入裂解缓冲液，PMSF用时现加，充分混匀；（2）超声裂解细胞及核酸，至溶液没有粘稠感，比较澄清； （3）于4°条件下以12000 rpm离心20-30 min，取上清； （4）用BCA试剂盒测定蛋白浓度，适当稀释蛋白，使得测定的浓度在标准曲线的线性范围之内，最终原始蛋白浓度应该在1 mg/mL以上； （5）取100-200 μg蛋白用于溶液内酶解。 3 溶液内酶解 （1）将100-200 μg蛋白的体积，用含8M尿素的PBS将浓度调至1 mg/mL，即最终体积在100 μL-200 μL； （2）加入一定量的二硫苏糖醇，终浓度为5 mM，室温放置1 h； （3）加入一定量的碘乙酰胺，终浓度为12.5 mM，避光室温放置30 min以上；（4）将样品从黑暗环境中取出，室温不避光放置5-10 min，终止碘乙酰胺的反应； （5）缓慢的向样品中注入5倍体积的PBS，将尿素浓度稀释至1.5 M以下；（6）按照蛋白：胰蛋白酶=100:1的比例，加入胰蛋白酶酶，混匀后放置于37°，12-16 h； （7）2000×g离心，10 min，取上清； （8）加入0.4%的TFA，将pH调至2以下； （9）用Sep-Pak柱子（Waters）除盐； （10）干燥除盐后的样品。 注意： 蛋白浓度不宜过大，否则后续处理中蛋白容易聚沉； 一定要用含8M尿素的PBS调节蛋白浓度，并且该缓冲液中不用加入任何蛋白酶抑制剂，否则容易影响胰蛋白酶的酶解效率； 二硫苏糖醇和碘乙酰胺的浓度不宜过大，加入的二硫苏糖醇和碘乙酰胺的体积应该不会样品的最终体积； 加入胰蛋白酶前的稀释步骤，一定要缓慢加入PBS，否则容易沉淀，并且，在稀释时，有少许沉淀，不用离心，经过过夜的酶解，胰蛋白酶会将沉淀酶解成肽段；如果在稀释后有沉淀并且高速离心，会导致蛋白量受损，而且胰蛋白酶无法将这
labelfree-非标定量法分析技术方法
labelfree-非标定量法分析技术方法 非标定量法[Labelfree]是近年来重要的质谱定量方法，通过比较质谱分析次数或质谱峰强度，分析不同来源样品蛋白的数量变化。蛋白质非标记定量技术（Label Free）是通过液质联用技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析，无需使用昂贵的稳定同位素标签做内部标准，只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据，比较不同样品中相应肽段的信号强度，从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。 非标定量法( Label-free) 是通过比较质谱分析次数或质谱峰强度，分析不同来源样品蛋白的数量变化，认为肽段在质谱中被捕获检测的频率与其在混合物中的丰度成正相关，因此蛋白质被质谱检测的计数反映了蛋白质的丰度，通过适当的数学公式可以将质谱检测计数与蛋白质的量联系起来,从而对蛋白质进行定量。按照其原理主要分为两种，第一种spectrum counts 类的非标记方法，发展比较早，已经形成多种定量算法，但是主要的原理都是以MS2的鉴定结果为定量基础，各种方法的差别在于后期算法在大规模数据上的修正。第二种非标记定量的原理是以MS1为基础，计算每个肽段的信号强度在LC-MS上的积分。 目前，已经有一系列配套的非标记定量分析软件，其中包括的GE公司开发的DeCyder MSTM 商业化软件，领先的蛋白质组学定性定量算法MaxQuant。运用这些软件，对液相色谱串联质谱数据非标记定量分析是将质谱数据由谱峰形式转化为直观的类似双向凝胶的图谱，谱图上每一个点代表一个肽段，而不是蛋白质；再比较的不同样本上相应肽段的强度，从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。实践证明其具有很好的定量准确性和可信性，现在已经逐渐成为蛋白质组学领域内的标准解决方案。 基于SILAC和iTRAQ的定量蛋白组学研究技术都是首先标记蛋白然后利用质谱进行分析；尽管提供的蛋白定量信息量巨大，但是标记试剂比较昂贵，每一个样品的成本较大，因此比较适合在整个蛋白组水平上对蛋白的表达变化进行定量的分析；对于相对简单的蛋白混合物，比如说co-IP的样品来说，投入产出比比较低；对于某些翻译后修饰方式的蛋白组学研究来说，比如泛素化研究，本身泛素化就是发生在赖氨酸上侧链上，对于泛素化肽段的富集是利用针对赖氨酸侧链上残留的两个甘氨酸（gly-gly）的抗体来实现的，但是iTRAQ试剂的标记会对此富集过程产生很大的影响，因此就不能使用iTRAQ标记技术对组织样品的泛素化修饰进行组学水平上的分析。 Label Free定量分析技术就是基于此实验需求建立起来的定量蛋白组学技术。同一个肽段在质谱分析过程中离子化效率相同，质谱峰的面积就直接代表了该肽段量的多少，因此可以直接通过比较同一肽段质谱峰面积的方法直接得到该肽段所代表的蛋白的相对定量信息。 来源：百泰派克生物
基于MS或MS的数据非依赖法非标记定量蛋白质组学蛋白质互作分析(二)
基于MS/MS的数据非依赖法非标记定量蛋白质组学蛋白质互作分析（二） 本期接着上期内容，继续给大家介绍基于MS/MS的数据非依赖法非标记定量蛋白质组学蛋白质互作分析。 随着混合技术的发展，SRM测量在蛋白质组学中的使用更为广泛。混合技术可以从SRM信号中获取高质量的MS/MS光谱。混合质谱扫描方法的结合提供了以高置信度进行测量的能力，能够对大量蛋白质进行定量分析。这些研究都表明，SRM 提供的测量结果在一系列样本和较长时间内都是一致且精确的。在采用SRM作为稳健量化方法的关键步骤中，CPTAC对SRM分析进行了多站点验证，介绍了基于SRM的检测方法的原则和框架，并强调了在许多设施的多种仪器上运行稳健的多路复用蛋白检测的可能性，还确定了SRM方法的一些关键问题，即需要进行前期分析验证和迭代。例如，100蛋白分析的方法开发可能需要12个月以上的时间来识别正确的转换并确认分析的有效性，以确保SRM信号中没有“隐藏”干扰（图例）。 图例. SRM测量示意图。SRM选定监控的碎片离子由代表0.7AMU分离窗口的阴影框表示。高分辨率的片段离子在这些框中显示，以表示每个提取窗口中的真实离子群。左边和右边的窗口表示不受干扰的片段离子，中间的窗口表示受干扰的离子。在这种情况下，峰极有可能被卷积，导致方差比其他离子更高。 想要SRM在更多的定量蛋白质组学研究中得到应用，那么缩短分析时间就变得至关重要， SRM的快速测量能够监测足够多的肽来，能覆盖多达200种蛋白质的网络。在蛋白质互作分析中，SRM方法最适合于当相同诱饵（或一小群诱饵）和相互作用需要在多个条件下反复分析的情况。例如，Bisson等人开发了一种以关键信号支架蛋白GRB2为中心的SRM分析方法，然后将其用于分析添加生长因子后的相互作用动力学。这种SRM方法还可以在添加治疗药物和/或跨细胞系或患者样本后分析相互作用。
质谱技术在蛋白质组学研究中的应用
第35卷 第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) Journa l o fN anji n g Forestry Un i v ersity (Natural Sc ience Ed ition) V o.l 35,N o .1Jan .,2011 htt p ://www.n l dxb .com [do :i 10.3969/.j issn .1000-2006.2011.01.024] 收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10KJ B220002) 作者简介:甄艳(1976)),副教授,博士。*施季森(通信作者),教授。E-m ai:l js h @i n jfu .edu .cn 。 引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄 艳,施季森 * (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏 南京 210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 Application of m ass spectro m etry i n proteo m ics studies Z HEN Yan ,SH I Jisen * (K ey Labo ra t o ry o f F orest G eneti cs and B i o techno l ogy M i n istry o f Educati on , N an ji ng Forestry U n i versity ,N an ji ng 210037,Chi na) Abstrac t :W ith the rap i d develop m ent o f pro teo m i cs ,m ass spec trom etry i s m aturi ng to be a po w erfu l too l and core tech -nology fo r proteo m ics st udies dur i ng the recen t years .The super i or ity o fm ass spectrom etry lies i n providi ng the through -pu t and the m olecu lar infor m ati on ,w hich no other techno logy can be m a tched i n proteom ics .In th i s rev ie w,w e m ade a g lance on the outli ne o fm ass spectrome try -based proteo m ics .A nd then w e addressed on t he advances o f data ana l y si s o f m ass spec trom etry -based proteom ics ,quantitati ve m ass spectro m etry -based pro teom i cs ,post -translati onal m odificati ons based m ass spectrom etry ,targeted proteo m ics and functiona l proteo m ics based -mass spectrome try .K ey word s :m ass spectrome try;proteo m ics ; quantitative pro teom i cs ; post -trans l ation m odifica ti on ; targ eted pro - teo m i cs ;f uncti ona l proteom ics 蛋白质组学(Pr o teo m ics)是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。 目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(electro spray ion izati o n,ESI )和基质辅助激光解析离子化(m a -tri x assisted laser desorpti o n i o nization ,MALD I)的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(ion trap ,I T),飞行时间(ti m e of fli g h,t TOF),串联飞行时间(TOF -TOF),四级杆/飞行时间(quadr upo le /TOF hybrids),离子阱/轨道阱(I T /orbitrap hybri d )和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /Four i e r transfor m ioncyclotron resonance m ass spectro m eters hybr i d s ,I T /FT M S),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化
磷酸化蛋白质组学常用分析和定量方法
蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来. 1.1 免疫亲和色谱 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。因此，目前采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较 少。 1.2 固相金属亲和色谱（IMAC） 固相金属亲和色谱（immobilized metal affinity chromatography, IMAC）是一项较为成熟的磷酸化多肽分离富集技术。它是利用磷酸基团与固相化的Fe3+、Ga2+和Cu2+等金属离子的高亲和力来富集磷酸肽。目前发展的高通量磷酸化蛋白质组分析途径主要采用IMAC亲和色谱-反相液相色谱-串联质谱-数据库检索联用的方法。Ficarro等人最先将IMAC富集技术应用到细胞系大规模磷酸化蛋白质组学的分析中，并从啤酒酵母中鉴定出了216个磷酸化肽段和383个磷酸化位点。该方法的优点在于对每个可溶磷酸肽，不管其长度如何，都有富集作用，而且IMAC柱洗脱下的样品可直接用于RP-HPLC分析，但有可能丢失一些与IMAC柱结合能力较弱的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱的磷酸肽。另外，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段与固相金属离子也有结合能力，也可能被富集。为了解决IMAC柱的非特异性吸附的问题，可以采用对羧基进行酯化反应以及改变洗脱液的体系等方法来提高IMAC 柱的特异性。此外，自动化IMAC- capillary RP HPLC-ESI MS/MS技术平台的研究开发，使磷酸肽的富集、反相分离和质谱检测都能自动在线进行，为IMAC在蛋白质组学中的高通量应用开辟了道路。 1.3 TiO2色谱 近期金属氧化物亲和富集技术得到了人们极大的关注。2004年，Pinkse等人将二氧化钛（TiO2）技术引进磷酸化蛋白质组学领域，利用TiO2与磷酸肽上磷酸基团的亲和能力实现对磷酸肽的相对富集，并建立了通过TiO2作为预分离的2D-NanoLCESI-MS/MS 技术平台。虽然该技术在对磷酸化肽段富集时的选择性和灵敏度方面都优于IMAC技术，但仍然存在非特异性吸附等问题。后来，人们又利用纳米材料比表面积大的特点，对TiO2纳米级材料进行了开发
蛋白质组学中绝对定量技术研究新进展--09.07.04
蛋白质组学中绝对定量技术研究新进展 林虹君1蔡耘1钱小红1，2 (1蛋白质组国家重点实验室，北京蛋白质组研究中心，军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 102206；3北京理工大学，北京 100081) 摘要：进入后基因组时代以来，蛋白质组学得到了长足的发展，也攻克了很多技术难关。但如何在规模化程度上实现蛋白质的绝对定量，一直是蛋白质组学研究中亟待解决的技术难题。将外源凝集素、抗体和镧系元素螯合形成聚合物，然后利用IC P-MS技术进行分析，可以实现蛋白的绝对定量。本文综述了近年来蛋白质组学中绝对定量技术研究的新进展。 关键词：蛋白质组学；IC P-MS；绝对定量；凝集素；抗体 中图分类号：Q 5 蛋白质组学作为功能基因组学的重要支柱，是当今生命科学领域的前沿，是基础研究与应用研究、生命科学与医药产业及生物经济的纽带和桥梁。随着研究不断深入，人们发现不同浓度和类别的蛋白可能预示着某种疾病的发生，比如：肝癌、白血病等。因此，蛋白质定量逐渐成为人们研究的热点，尤其是在规模化程度上的绝对定量更是当前蛋白质组学发展的核心。通过多年的研究发现，利用外源凝集素、抗体与ICP-MS技术联用，可以有效解决这一难题,也使多年来一直困扰人们的蛋白质绝对定量向前迈了一大步。 1. 现有定量方法存在的不足 目前蛋白定量方法主要有：稳定同位素体内标记的SILA C法、同位素亲和标签的ICAT法、放射免疫测定技术-RIA以及酶连接免疫吸附剂测定方法-ELISA等，这些方法在一定程度上发挥了重要作用，同时也存在一些不足。 稳定同位素体内标记法（SILAC）[1]是分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞经5-6个倍增周期后，稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸，不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定。由于相同肽段的不同同位素标记形式的质量变化依赖于氮原子数目，因此，对未知蛋白质难以进行定量。该方法仅适用于细胞培养模式，不能用于组织或体液中蛋白质的定量分析；对于动物模型的标记，由于成本太大，也难以实现。 同位素亲和标签法（ICAT）是利用ICAT试剂特异性地标记含有巯基的肽段，然后通过生物素亲合，提取含有巯基的肽段，在大大简化分析体系的同时，实现了蛋白定量。该方法的缺点是：标记分子易于碎裂、氘标与氢标肽段在色谱行为上有差异、不能共洗脱等。 放射性免疫测定方法(RIA) [2]早在1960年就建立起来了，该方法首先用放射性核素标记抗原或抗体，然后与被测的抗体或抗原结合，形成抗原-抗体复合物。由于该方法灵敏度受方法本身工作原理的限制，对体内某些含量特别低的物质尚不能测定；同时放射免疫分析是竞争性的反应，被测物和标准物都不能全部参与反应，测得的值是相对量而非绝对量；另外该方法存在放射性污染等问题。因此在近来的研究中，其应用受到了一定的限制。 为了弥补RIA方法存在的不足，酶连接免疫吸附剂测定方法(ELISA)应运而生，并逐渐取代了RIA。ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合而发展起来的一种敏感性很高的试验技术。该方法没有放射性污染、操作方便以及可实现自动化等，现已成为生命科学领域的重要方法。但ELISA也存在一定的局限性：其背景与抚育时间有关、显色淡、灵敏度偏低、重复性不佳、出现白板以及阳性对照不显色等。 正是存在以上问题，使得现有定量方法都没能解决真正意义上的绝对定量，大都只是在定性或半定量上发挥一定的作用。因此，要满足目前迫切需要的低浓度、高通量[3]和快速准确定量的要求还有不小的差距。因此，寻找一种低成本、快速、无污染、适用于痕量检测[4]的新方法是蛋白质组学绝对定量亟待解决的问题。 2. ICP-MS技术的原理及特点 ICP-MS（Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry）是将电感耦合等离子体ICP和质谱MS有机结合起来的一种新的分析技术。ICP-MS仪器分为三个主要部分：（1）电感耦合等离子体（样品引入系统[5]；离子源），（2）质谱仪（离子透镜系统；四级杆离子过滤器；检测器），（3）接口（采样锥；截取锥）。 ICP-MS分析基本原理：被分析样品通常以气溶胶形式引入氩气流等离子体中心区，等离子体的高温使样品去溶剂化、汽化解离和电离，正离子在真空系统内被拉出并按照其质荷比分离，元素的同位素离子给出的信号与该元素在样品中的浓度成线性关系，据此可对该元素进行准确定量。 ICP-MS具有以下特点[6]：（1）灵敏度高，（2）背景计数低，检出限低（ppt～ppq），适用于痕量元素[7，8]的分析,这正是蛋白定量中所迫切需要的，(3)干扰少（天然同位素共有210条谱线），(4)极宽的线性动态范围，可达10个数量级以上线性范围，(5)分析元素范围宽，速度快，在元素周期表中除碳、氢、氧等极少数元素外，大多数元素都能用ICP-MS进行测定，（6）