三种重要木质素降解酶研究进展

收稿日期:2003-02-09

作者简介:王海磊(1978-),男,硕士;李宗义(1942-),男,教授,河南师范大学生命科学学院,研究方向:环境微生物学。基金项目:河南省科技攻关项目(001200217)

文章编号:1008-9632(2003)05-0009-03

三种重要木质素降解酶研究进展

王海磊,李宗义

(河南师范大学生命科学学院,新乡 453002)

摘 要:就三种重要木质素降解酶:LiP 、MnP 和漆酶在自然界的分布,化学组成、结构特征、降解机制、分子生物学等进行综述,并探讨了其作用协同性。

关键词:木质素过氧化物酶;锰过氧化物酶;漆酶;中图分类号:Q936文献标识码:A

木质素是造纸工业排放黑液C OD 和色度形成的主要原因,其结构是由甲氧基取代的对-羟基肉桂酸聚合而成的异质多晶三维多聚体,分子间多为稳定的醚键、C-C 键,是目前公认的微生物难降解芳香化合物之一。自1934年Boruff 和B uswell 首次发现能降解木质素的微生物种群,人们对木质素的生物降解进行了大量研究,1983年和1984年发现了木质素过氧化物酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP),由日本吉田首次在生漆中发现的漆酶(Laccase),也始终引起着人们的关注。这三种酶被公认为是木质素重要的降解酶。本文就三种木质素降解酶的最新研究进展进行综述,尝试为造纸废水的生物降解提供一些参考。1 木质素过氧化物酶(LiP)1 1 分布及种类

LiP 是第一个从黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysospo rium )发现的木质素降解酶,在木质素降解中起关键性作用。LiP 的产生菌在自然界分布相当广泛,许多腐朽木材的白腐菌、褐腐菌都可以产生LiP,主要产生菌见表1。

表1 Li P 的主要产生菌

属名菌种名

Trametes T.gibbosa ,T.versicolor

Phlebia P.bre vispora ,P.radiata ,P.oc hrace o fulva,P.t reme llosa ,P.adusta

Coriolus C.consors , C.hi rsutus

Others

Bj e rkande ra adusta ,Chrysonilia sito phila,Chrysospo rium pruinosum,Coriolopsis occ identalis,Phe llinus pini,Pol yporus ostrei formis,Phanerochaete chrysos porium ,Strepto myce s viridosporu ,Pleurotus ostreatus ,Junghuhunia se parabalima ,Fomes lignosus

1 2 结构及特点

LiP 代表一系列含Fe 3+、卟啉环(IX)和血红素附基的同工酶,由不同微生物产生的酶的种类和理化性质各不相同。LiP 是一种带有糖基的胞外血红蛋白,

晶体结构已有报道,确定血红素(heme)埋在蛋白质内,可连接至少一个VA 。木质素大分子不能接近该酶的活性中心,其结合位点是一段有序的糖残基,位于接近活性中心通道表面的裂缝中。光谱学研究表明LiP 有五种氧化状态,自然状态LiP 含有高自旋Fe 3+,被H 2O 2氧化两个电子后形成LiP (氧带铁卟啉环自由基含 +Fe 4+),LiP 经单电子还原形成LiP !(氧带铁卟啉环含Fe 4+),再经一次单电子还原,回到自然状态,His 82在活性中心通道表面的裂缝的开口处,Trp 170在酶蛋白表面,其电子传递可能有两个不同的途

径:底物-His 82-Ala 83-Asn 84-His 47

-Heme 或底物-Trp 170-Leu 171-He me [1]。

LiP 的特点是能氧化富含电子的酚型或非酚型芳香化合物,在通过电子传递体攻击木质素时,它能从苯酚或非酚类的苯环上夺取一个电子,将其氧化成自由基,继而以链式反应产生许多不同的自由基,导致木质素分子中主要键断裂。此过程需要H 2O 2的驱动,反应如下:

LiP+H 2O 2?LiP +H 2O LiP +SH 2?SH +LiP !LiP !+SH 2?SH +LiP 2SH +2木质素?2木质素自由基+2SH 2

其中,SH 2为专一电子传递体。H 2O 2可由白腐菌胞内H 2O 2产生酶系产生,且其胞内还存在过氧化物水解酶,保证其不会受到毒害。1 3 降解木质素机制

木质素分子间主要键型是 -O-4, -O-4模式复合物中有A,B 两个苯环,均可被LiP 氧化。LiP 催化 -O-4模型物的主要反应是C -C 断裂形成VA 和2-甲氧基苯酚。另一个重要的分支反应是C -氧化产物的形成,结果表明:C -氧化产物是酚型C -氧合

芳香化合物时,可由漆酶催化,酚氧化酶介导的氧化反应降解;当C -氧化产物是非酚型C -氧合芳香化合物时,由于其非各种氧化酶的底物,氧化降解非常困难。VA是LiP的诱导剂,还可以保护LiP不受H2O2的损害。对VA的氧化目前认为主要是由LiP催化,过氧化氢离子和H2O同时参与芳香环的开裂。开环产物可被进一步代谢CO2。整个反应中生成的甲氧基酚衍生物,由LiP和漆酶共同氧化,形成醌,在纤维二糖/醌还原酶系、芳香环开裂酶系的协同作用下,生成酚,最后形成环开裂产物,进入Kerb循环,或者纤维二糖酸内脂的形式进入磷酸戊糖途径,最终代谢为C O2。而非酚型的芳香醛酸,由于其氧化还原电位太高,需先被芳香醛酸还原酶还原成相应的醇,然后才能被LiP氧化成开环产物或醌。在木质素的模式复合物中,已被深入研究的还有 -1型,LiP氧化其它键型如 -5、 -O-4模式复合物,产物尚未被证实。

1 4 基因结构及表达

在分子生物学领域,研究较多的是P. chrysos porium、Trametes versicolor、Bjerkandera adusta等。在P.chrysos porium中已经克隆出至少7个相近的LiP 基因家族,定名为LiPA-LiPJ,同源性很高。核型分析表明,异源真核菌株约含10个染色体,而LiP基因至少被分布在两个染色体上[2]。

LiP序列排列紧密且高度保守,氨基酸相似性53% ~98%,每个LiP基因编码一个由343~345个氨基酸组成的成熟蛋白质,分子量约36360~36607Da。N端有一个21个氨基酸的信号肽,且有6或7个氨基酸的前体肽。已测序的LiP基因均含有8或9个内含子,大小49~78bp,5#端非编码区包含一个TATA框(-66~-81bp)和一个C AAT框(-107~-228bp)的调节序列。在基因表达方面,其转录明显受到C,N水平的影响, LiP的同工酶种类和数目随培养条件变化而改变,至少有五种:H1、H2、H6、H8、H10。其分子量大小、等电点、光谱特性、稳定性均有差别,N端氨基酸序列也不相同。非限制性N源条件下,H8是主要的同工酶,其cDNA序列被命名为ML-1,H2的表达也稍占优势,但H6的表达较限制性N源条件下大大下降。在异源表达上,已得到许多重组LiP,但重组LiP的功能有所改变,如催化能力改变,不再受Mn2+抑制等[3]。

2 锰过氧化物酶(MnP)

2 1 分布及种类

MnP与LiP一样,都是代表一系列带有糖基的胞外过氧化物酶,因二者都含有血红素,又称血红素过氧化物酶。MnP的主要产生菌见表2,主要是一些白腐真菌,多属担子菌亚门,无隔担子菌亚纲,无褶菌目的多孔菌科。

2 2 结构及特点

MnP的晶体结构中包括17%的中性糖类和大量酸性氨基酸,血红素上仅有一个Mn2+的结合位点,MnP 能将其氧化,消耗一分子的H2O2,产生两分子的Mn3+。Mn3+从MnP上脱离后,如果没有合适的螯合物与其结合,保证其稳定性,其可以在溶液中发生反应,生成MnO2。在木质素降解过程中,MnO2可保护LiP免受H2O2的损伤。而在LiP-MnP组合酶体系中,高浓度的Mn2+或Mn3+,加上合适的螯合物,会导致LiP的抑制, MnP的诱导。可见,Mn对LiP和MnP都具有重要的作用,且作用大小与猛离子的浓度及添加时间有关。

MnP的特点是只能氧化酚型木质素。氧化苯酚的过程中,MnP和H2O2的启动下,氧化Mn2+为Mn3+,然后,Mn3+氧化苯酚生成苯氧残基。这与LiP氧化苯酚的方式有明显不同。

表2 MnP的主要产生菌

属名菌种名

Pleurotus P.sapi dus,P.erynigii,P.pulmonarius P.sajor_caju

Phlebia P.b rev is pora,P.radiata

Panus P.tigrinus,P.conc hatus

Ganoderma G.lucidum,G.vale siacum

Tramete s T.gibbosa,T.ve rsicolor,T.villosa,T.cingulata

Others Ceriporiopsis subve rmispora,Coriolopsis pol yzona,Lent inula

e dode s,Daedaleo psis con fragosa,Dichomitus squale ns,

Pyc ro porus c innabarinus,Gri fola frondosa,Rigi doporus

lignosus,Phaneroc hae te chrysosporium,ste re um hirsutum,

c yathus stercore us,Pe re nniporia me dulla_panis

2 3 作用机制

MnP降解木质素的作用机制尚不清晰,目前认为是一个循环催化过程见图1,AH代表酚型底物。随着研究的逐渐深入,它在木质素降解过程中的作用越来

越受到重视。

图1 MnP的循环催化过程

2 4 基因结构及表达

从P.chrysosporium的胞外液中分离出至少六种MnP的同工酶,均由多基因编码。通过全部RNA的反转录PCR,能得到MnP的三个不同基因的mRNA: MnP1、MnP2、MnP3。静置培养条件下,MnP2是主要的MnP表达基因,而搅拌培养时,MnP1是主要的表达基因,MnP3的表达较稳定。MnP基因有6或7个内含子, N端有21或24个氨基酸的信号肽,但无前体肽。活性位点附近的序列非常保守,MnP的5 非编码区包括1个TATAA单元(-81bp)及3个反向的CCAAT单元。启动区包括大量热休克元件和序列,这些元件与哺乳动物金属硫蛋白基因中的金属调节元件相同[4~5]。

在基因表达方面,MnP的产生明显依赖Mn2+浓度、培养基、热休克、C和N源变化,且调节是在转录水平上。菌株P.chrysosporium OGC101MnP1编码一个357个氨基酸的成熟蛋白,内含子6个,大小57~72bp。

3 漆酶

3 1 分布及种类

1883年漆酶被首次发现,一百多年来,人们通过大量研究发现漆酶广泛存在于多种植物和菌类的分泌物中。在真菌中,漆酶大多分布在担子菌(Basidim ycetes)、多孔菌(Polyporus)、柄孢壳菌(Podospora)等中。此外,一些动物肾脏和血清中也发现了漆酶,近来,人们发现一些细菌也能产生漆酶[6],如生脂固氮螺菌(Azos pirillum lipo ferum)。漆酶的主要高产白腐真菌王佳玲等曾作过统计[7]。

3 2 结构与特点

漆酶的分子量在64~390kD之间,除Podos p o ra anserina产生的一种漆酶是四聚体外,其它漆酶一般是单一多肽,由约500个氨基酸组成。不同种类的漆酶含铜数并不相同。一般含有四个铜离子,根据光谱和磁性特征可分为三类: 型Cu2+一个,单电子受体,顺磁性,蓝色,614nm处有特征吸收蜂;!型C u2+一个,单电子受体,顺磁性,非蓝色,无特征,吸收光谱;?型Cu24+两个,双电子受体,反磁性,是偶合的离子对(C u2+-C u2+),330nm处有宽的吸收带。漆酶的三维结构尚不清晰,但已证实铜离子位于酶的活性部位,在催化氧化过程中起决定性作用。

漆酶是单电子氧化还原酶,据统计它催化氧化的底物达250多个,最重要的是酚及其衍生物,约占其底物总数的一半。此外漆酶还能催化芳胺、羧酸及其衍生物,甾体激素和其它非酚类底物,如抗坏血酸等。

3 3 作用机制

漆酶是一类以O2为电子受体的蛋白酶,对其作用机理,目前研究较透彻的是其催化多酚化物如氢醌,此过程须经过四次单电子传递。首先,底物氢醌向漆酶转移一个电子,生成半醌-氧自由基中间体。而后,两分子半醌生成一分子氢醌和一分子苯醌,氧自由基中间体还能转变成碳自由基中间体,它们可以相互结合或相互偶连,故在菌体内,漆酶与其它氧化木质素酶系协同降解木质素。而在体外实验中,木质素单体在Laccase/O2条件下会发生聚合反应。O2存在条件下,还原态漆酶被氧化,O2被还原成水,此过程是通过四个铜离子协同传递电子和价态变化来实现的:

Cu2+Cu2+Cu24+

2e

底物

Cu+Cu+Cu24+

分子内电子转移

Cu2+Cu2+Cu22+

2e

底物

Cu+Cu+Cu2+2H+O2

H2O快

Cu2+Cu2+(Cu2O)3+

2H+

H2O慢

Cu2+Cu2+Cu24+

3 4 基因结构及表达

漆酶是由一个结构相近的基因家族编码,许多真菌的漆酶基因已被克隆和测序,如Agaricus bis porus、Neurospora crassa。从Co prinus cinerens中克隆出3个漆酶基因Lcc1、Lcc2和Lcc3。其中Lcc1含7个内含子,大小为54~70bp,成熟蛋白约521个氨基酸,有三个潜在的N-连接糖基化位点,C端有23个氨基酸的延伸序列,富含Arg和Lys,其酶蛋白成熟至少需剔除信号肽、前体肽和C端延伸区。Lcc2和Lcc3均有13个内含子,表达出的成熟蛋白氨基酸同源性80%。Lcc3和Lcc1的氨基酸同源性58%,Lcc2和Lcc1的氨基酸同源性59%,而Lcc3与Aspergillus nidulan漆酶的氨基酸同源性只有18%。因此,异源真菌漆酶之间的氨基酸同源性较低,但在铜结合区具有较高保守性[8~9]。

在异源表达上,曲霉是一个很好选择,A.oryaze TATAa mylase和Pichia pasti系统已成功表达若干不同来源的漆酶,Lcc1在米曲霉中表达成功,90%以上的转化体表现出漆酶活性[10],目前,已有许多漆酶基因在酵母菌等真核生物中表达。

4 三种木质素降解酶协同作用

对上述三种酶的研究主要集中在液体培养方式上,结果显示采用静置培养,深层培养利于酶的产生。已证明,木质素降解酶活性受C源、N源、微量元素、诱导物、培养温度和pH值等因素影响。而P. cinnabarinus的漆酶产量却不受一些小分子芳香化合物的诱导[11]。

确定单一一种酶在木质素降解中的功能非常困难,因为每一种白腐菌所产生的都不是一种木质素降解酶,如Laccase和MnP单独存在都不能很好的降解木质素,而两种酶同时存在时,木质素却能得到很好降解,表明两种酶具有协同作用。有趣的是当体系中一些条件变化时,体系中的两种或几种木质素降解酶会发生相互抑制现象,如液体培养条件下,Mn2+浓度增加会导致LiP活力大大降低,而MnP和Laccase的活力却相应增加,这启示我们这种协同作用可能存在正负两种机制。不同白腐菌木质素降解酶系的组成大不相同,可分为四类:LiP-MnP,如P.chrysos porium;LiP_ MnP_Laccase,如Trametes gibbosa;MnP_Laccase,如Lentinula edodes;LiP_Laccase,如Pleurotus ostreatus。最新研究表明,不同降解酶系成分之间的比例将直接影响木质素降解效果[2]。各种酶系具体如何分工协作降解木质素,尚不清楚,将是今后研究的一个热点。

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Shedding virus and rapid propagation of Solanum muricatum Ait.

LAN Wei1,LIANG jun2

(1.Department of biology,Fuyang Normal College,Fuyang,236032,China; 2.Department of biology,Anhui Education colle ge,Hefei,230061,China)

Abstract:Aseptic satus ste m apex of the Solamum muricatum Ait were cultured.The shedding virus seedlings could be obtained after five generations of high_temperature treated plus ste m apex delamination.The aseptic seedlings were cultured in MS+6-B A1.0mg/L+NAA0.1mg/L+2,4_D0.10mg/L media.The light green-yellow calli c ould differentiate into buds. After trans fering calliwith buds to MS+6-B A1.0mg/L+IAA0.05mg/L cultural media,the calli differentiate into rosette buds which could proliferate better.The cluster of buds grew roots easily in1/2MS+NAA0.1mg/L+PP3330.2mg/L cultural media. At last the tube plants of Solanum muricatum Ait.could be obtained

Key words:Solanum muricatum Ait.;Shedding virus;rapid propagation

(上接11页)

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Three important enzymes for lignin degradation

WANG Hai_lei,LI Zong_yi

(Henan Normal University,C ollege of life science,XinXiang453002,China)

Abstract:Three important enzymes for lignin degradation were reviewed.These enzymes were lignin peroxidase,Mn_ dependent peroxidase and laccase,whose distribution in nature,chemical composition,structur properties,molecular biology and cooperation among them were discussed.

Key words:Lignin peroxidase,Mn_dependent peroxidase,Laccase