植物中游离氨基酸的测定
植物中游离氨基酸的测定
植物中游离氨基酸的测定是检测植物中氨基酸含量的重要方法。它对于评估植物营养价值，鉴定新品种以及研究植物体内生理功能具有十分重要的意义。
一般而言，植物中游离氨基酸测定分为三个步骤：样品前处理、含氮量测定和氨基酸分析。样品前处理需要将植物样本进行固相萃取或者电解质萃取，以去除杂质；含氮量测定采用Kjeldahl法或者Dumas法；而氨基酸分析则包括HPLC-UV/MS、GC-MS、IR、MS/MS 等不同方法。其中HPLC-UV/MS方法是常用的方法之一。在使用HPLC-UV/MS 方法时，样品先通过回归装置进行净化、分离及回收，然后在HPLC端盘上使用循环优化的方式进行分析；最后通过UV/MS 技术对所得的产物
进行定量测定。
以上就是关于植物中游离氨基酸的测定的详情介绍，从上文可以看出对于正确地进行检测都必不可少地依赖于专业人士对样本处理、测试方法选取以及数字应用方式的正确使用。只有采取正确的方法才能确保最终的测定结果的准确性，以便更好地利用植物的营养价值，获得更好的生产和使用效果。
游离氨基酸测定
①将对应封口袋中根茎放入研钵内加5ml10%乙酸研磨至匀浆，用10ml去离子水冲洗干净，一并将匀浆和冲洗水转入10ml对应编号离心管中，定容至9ml。根同样加5ml10%乙酸研磨至匀浆，用少量水洗研钵，一并转入10ml对应编号离心管去离子水定容至8ml。 ②将离心管充分震荡混匀，将根茎叶浆液10ml离心管放入高速离心机9000r/min 离心10min,取叶上清液0.2ml,放入对应编号10ml离心管中待测。取茎上清液0.2ml,放入对应编号10ml离心管中待测。取根上清液0.2ml,放入对应编号10ml 离心管中待测。 ③在取茎叶上清液中加入相应去离子水、3ml茚三酮、0.2ml抗坏血酸，置沸水中加热10min，观察颜色淡黄色变为蓝紫色，加入乙醇定容到9ml。在570nm处测定吸光度。 试剂：①水合茚三酮：称取0.6g再结晶的茚三酮与烧杯中，加入15ml正丙醇，搅拌使其溶解。再加入30ml正丁醇及60ml乙二醇，最后加入9ml PH=5.4乙酸钠缓冲液，混匀，于棕色瓶中，置于4℃下保存备用，10天有效。需要432ml 材料：[200ml烧杯（1个）、100ml量筒（1个）、5ml移液器（1个）、500ml棕色瓶（1个）] ②乙酸钠缓冲液 ③标准氨基酸：称取亮氨酸46.8mg，溶于少量10%异丙醇中，用10%异丙醇定容至100ml。取该溶液5ml，用蒸馏水稀释到50ml，即含氨基氮5μg/ml标液。 材料：[小烧杯（1个）、100ml容量瓶（1个）、50ml容量瓶（1个）] ④0.2%抗坏血酸：称取100mg抗坏血酸，溶于50ml蒸馏水中，随配随用。 材料：[50ml容量瓶（1个）] ⑤10%乙酸。需要720ml 材料：[100ml容量瓶（1个）] 1000ml容量瓶 总材料：水浴锅、大口径烧杯、研钵（3个）、50ml离心管（96个）、10ml离心管（144个）、15ml离心管（144个）、5ml移液器、1ml移液器。
植物组织中游离氨基酸总量的测定
【试剂】 1、 3%茚三酮试剂 称3g茚三酮用95%乙醇溶解定容到100ml容量瓶里,贮于棕色瓶中.此试剂应放在冷凉处,不宜久放,使用期约10天. 2、氰酸盐缓冲液（按以下方法配制）： （1）NaCN贮备液0.01mol/L（490mg/L）. （2）醋酸缓冲液：称360g醋酸钠（含三分子结晶水）溶于约300ml无氨蒸馏水中,加66.67ml 冰醋酸再用无氨蒸馏水稀释至1L. 取溶液（1）20ml,用溶液（2）定容到1L. 3、标准氨基酸精确称取在80℃下烘干的亮氨酸13.1mg（或α-丙氨酸8.9mg）溶于10%的异丙醇中,并在100ml容量瓶中用10%异丙醇稀释至刻度,混匀, 即为1mmol/L的标准氨基酸贮备液,置冰箱中保存.为了制备工作液,可取贮备液与等量无氨蒸馏水混合,此液浓度为0.5mmol/L,即1ml含氨基酸0.5μmol,或氨基氮7μg. 4、 95%乙醇； 5、异丙醇（分析纯）. 【操作步骤】 1. 标准曲线的制作 取20ml刻度试管18支,按下表15-1加入各试剂.加完试剂后混匀,在100℃水浴中加热12min（加热时封口）,取出在冷水中迅速冷却,立即于每管中加入5ml 95%乙醇,塞好塞子,猛摇试管,使加热时形成的红色产物被空气中的氧所氧化而褪色,此时溶液呈蓝紫色.于570nm波长下测其光密度（以空白管为参比）,以氨基酸浓度为横坐标,光密度为纵坐标,绘制标准曲线,求出直线方程. 表15-1 各试管加入试剂量 2. 样品提取
选取有代表性的植物叶片（或其它组织）,洗净擦干,剪碎混匀,迅速称取0.10~0.20g（视氨基酸含量多少而定）,共称3份,分别加入20ml刻度试管中,再加蒸馏水10ml盖塞（或系上塑料薄膜）,置沸水浴中20min以提取游离氨基酸,到时取出在自来水中冷却,把上清液滤入25ml容量瓶中,之后再往试管中加5ml蒸馏水,置沸水浴上再加热10min,过滤并反复冲洗残渣,最后定容至刻度,摇匀. 3. 样品测定 另取4支洁净干燥的试管,其中3支分别加入0.5ml提取液,另一支加0.5ml蒸馏水,然后在上述4支试管中分别加入NaCN缓冲液、水合茚三酮各 0.5ml,加完试剂后盖塞,置沸水浴上加热12min,冷却后,再分别加5ml 95%乙醇,摇匀,以空白作参比,在波长570nm下测其光密度. 根据光密度查标准曲线（或用回归方程计算）即可求出提取液中氨基酸的浓度. 4. 计算 游离氨基酸含量 式中 C-由直线方程计算的值,即0.5ml试样中氨基酸的微摩尔数（μmol）； V-样品提取液经稀释后的总体积（ml）； W-样品重（g）. 测定结果按表15-2记录. 表15-2 游离氨基酸总量测定记载表 测定日期：
植物体内游离脯氨酸的测定
植物体内游离脯氨酸的测定 在正常环境条件下生长的植物，体内游离脯氨酸的含量较低。但在逆境（如旱、寒、盐等）条件下，植物体内游离脯氨酸的含量可增加10-100倍，因此有人提出游离脯氨酸的含量可作为植物抗逆性指标。 植物体内的游离脯氨酸用磺基水杨酸或酒精提取。在酸性条件下，脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的红色产物（结构如下），用比色法于520um波长下测定脯氨酸的含量。 仪器设备：分光光度计、析天平、恒温水浴、研钵、容量瓶、具塞试管：25毫升9支、移液管：2毫升4支、5毫升2支、漏斗、滤纸。 1．称取0.5000g剪碎烟叶加入试管，加5ml 3%磺基水杨酸，封口，沸水浴10min；过滤后备用。 2．吸取2ml提取液加入试管（对照管用2ml水代替），各加入2ml冰醋酸，4ml 茚三酮，摇匀，煮沸30min，冷却比色（OD520） 试剂配制： 1．3%磺基水杨酸：称3.000g磺基水杨酸溶解，定容至100ml。 2．茚三酮：称2.50g茚三酮，加60ml冰醋酸和40ml 6M磷酸，在热水（70°C）溶解，一般现用现配（24小时） 6M磷酸：吸取86ml磷酸，定容至250ml. 试剂 酸性茚三酮：称取2.5克弗三酮，加入60毫升冰醋酸和40毫升6M磷酸（冰乙酸和6mol/L磷酸以3︰2混合，作为溶剂进行配制），于70℃下加热溶解。冷却后贮于棕色试剂瓶中备用。4℃下2～3日内有效。 脯氨酸标准溶液：称取0.0250克脯氨酸，溶解在250毫升蒸馏水中，其浓度为100微克／毫升。再取此液10毫升，用蒸馏水稀释至100毫升，即为10微克／毫升之脯氨酸标准液。 冰醋酸 甲苯 若用磺基水杨酸提取，需要配制3%的磺基水扬酸溶液。（若用酒精提取，需要80%的酒精，活性炭，人造沸石）。采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。 方法步骤 制作标准曲线：取7支25毫升具塞试管，编号。分别向各管准确加入脯氨酸标准液（每毫升含脯氨酸10微克）0、0.2、0.4、0.8、l.2、l.6、2.0毫升，再用蒸馏水将体积补至2毫升，摇匀，便配成了分别含0、2、4、8、12、16、20微克脯氨酸的标准系列。再向各管加入冰醋酸和酸性茚三酮各2毫升。摇匀后。在沸水浴中加效显色30分钟，取出后冷却至室温，向各管加入5毫升甲苯，充分摇动，以革取红色产物。萃取完后，（避光静置4小时以上）。待完全分层后，用吸管吸取甲苯层，用分光光度计在520mm波长下测定消光值，以脯氨酸含量为横座标，消光值为纵座标，绘制标难曲线。 游离脯氨酸提取：植物体内的游离辅氨酸可以用3%的磺基水扬酸提取。磺基水扬酸提取：称取叶片0.5克，将称好的样品放入具塞试管中，加入5毫升3%的磺基水扬酸溶液，将试管浸入
实验20植物组织中游离氨基酸总量的测定
实验20植物组织中游离氨基酸总量的测定 茚三酮显色法氨基酸是组成蛋白质的基本单位也是蛋白质的分解产物。植物根系吸收、同化的氮素主要以氨基酸和酰胺的形式进行运输。所以测定植物组织中不同时期、不同部位游离氨基酸的含量对于研究根系生理、氮素代谢有一定意义。一、原理氨基酸与茚三酮共热时能定量地生成二酮茚胺。该产物显示蓝紫色称为Ruhemans 紫。其吸收峰在570 nm 而且在一定范围内吸光度与氨基酸浓度成正比。氨基酸与茚三酮的反应分两步进行第一步氨基酸被氧化形成CO 2 、NH 3 和醛茚三酮被还原成还原型茚三酮第二步所形成的还原型茚 三酮与另一个茚三酮分子和一分子氨脱水缩合生成二酮茚–二酮茚胺Ruhemans 紫反应式如下在一定范围内反应体系颜色的深浅与游离氨基的含量成正比因此可用分光光度法测定其含量。二、实验材料、试剂与仪器设备一实验材料各种植物组织。二试剂1. 水合茚三酮试剂称取0.6 g 再结晶的茚三酮置烧杯中加入15 mL 正丙醇搅拌使其溶解。再加入30 mL 正丁醇及60 mL 乙二醇最后加入9 mL pH5.4 的乙酸–乙酸钠缓冲液混匀贮于棕色瓶置4 ℃下保存备用10 d 内有效。2. 乙酸–乙酸钠缓冲液pH 5.4 称取乙酸钠54.4 g 加入100 mL 无氨蒸馏水在电炉上加热至沸使体积蒸发至60 mL 左右。冷却后转入100 mL 容量瓶中加30 mL 冰醋酸再用无氨蒸馏水稀 释至100 mL 。3. 标准氨基酸称取80 ℃下烘干的亮氨酸46.8 mg 溶于少量10 异丙醇中用10 异丙醇定容至100 mL 。取该溶液5 mL 用蒸馏水稀释至50 mL 即为含氨基氮5 μ g/mL 的标准氨基酸
实验一游离氨基酸测定
实验一游离氨基酸测定 实验一：游离氨基酸测定 实验学时：3学时 实验类型：验证 实验要求：必修 一、实验目的 1、掌握甲醛法测定游离氨基酸的测定原理和方法。 二、实验内容 使用甲醛滴定法测定游离氨基酸 三、实验原理 氨基酸中的NH2基的pK值常在9.0以上，不能和NaOH标准溶液直接滴定，需使这些含氮化合物（包括有机含氮化合物）都转化为氨态氮，然后进行测定。但可以用甲醛法测量。在pH中性和常温条件下，甲醛迅速与氨基酸中的-氨基相互作用，使滴定终点移至pH值9.0左右，可以用酚酞批示剂，以NaOH标准溶液来滴定NH3+基上的H+,每释放一个氢离子，就相当于有一个氨基氮 R-NH3+→H++R-NH2 R-NH2+2HCHO→R-N(CH2H)2 4 NH4+ + 6 HCHO == (CH2)6N4H+ + 3 H+ + 6 H2O 滴定的结果表示游离a—氨基的含量，其精确度可达理论量的90%。如果样品中只某一种已知的氨基酸，从甲醛法结果可求得该氨基酸的含量。如果样品中是多种氨基酸的混合物(如蛋白水解液)，则测定结果不能作为氨基酸的定量依据。一般常用此法测定蛋白质水解程度，随着水解程度的增加滴定值增加，当水解完全后，滴定值即保持恒定。甲醛滴定法采用的甲醛浓度为2.0-3.0mol/L，即滴定后最终浓度为6 %-9 %。 四、实验组织运行要求 集中授课形式 五、实验条件
1．试剂 (1)40％中性甲醛溶液: 在50mL 36 % ~ 37 %甲醛中加入5滴5g/L酚酞乙醇溶液，然后 用0.2mol/L NaOH溶液滴定到微红(使用前需重新中和) (2)酚酞指示剂: 5g/L酚酞的50%乙醇溶液 (3)0.01mol/L氢氧化钠标准溶液 (4)10%(体积分数)乙酸溶液 2．玻璃仪器 ⑴50ml容量瓶 ⑵20ml移液管 ⑶碱式滴定管 ⑷50ml量杯 ⑸250ml三角瓶 六、实验步骤 (1)样品处理称取试样0.2g(准确至1mg)，置入研钵中，加5ml 10%乙酸溶液研磨至均匀，用水转移到50mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀、过滤(弃去最初部份溶液)。 (2)样品滴定在三角瓶中加入2mL样品滤液，加水4mL，3滴酚酞指示剂，摇匀后用0.01mol/L NaOH标准溶液滴定到微红色。然后加入2mL中性甲醛溶液，摇匀，放置片刻，再用0.01mol/L NaOH标准溶液滴定回到微红色中点，记下甲醛加入后样品消耗NaOH标准溶液的体积。同样，取6mL水按以上操作做空白实验。 七、计算 -氨基氮含量(%)=(V-V0)×c×0.014×(1/2)×50×(1/m)×100 式中： V—加甲醛后样品消耗NaOH标准溶液体积(mL) V0—加甲醛后空白消耗NaOH标准溶液体积(mL) c—NaOH标准溶液的浓度(mol/L) 0.014—消耗1ml 1mol/L NaOH标准溶液相当于氮的质量(g) 2—吸取样品滤液的体积(mL)
反相高效液相色谱法评价烟台苹果中游离氨基酸
反相高效液相色谱法评价烟台苹果中游离氨基酸 姜宏;左利民;周洁;邬旭然;山广志 【摘要】利用反相高效液相色谱法对烟台境内多地红富士苹果中游离氨基酸含量进行检测和分析.色谱条件为:Capcell PAK C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,3μm),以10 mmol/L磷酸氢二钠和10 mmol/L硼酸钠的缓冲溶液(pH 8.2)为流动相A,乙腈-甲醇-水(45∶45∶10,V/V/V)为流动相B,梯度洗脱,流速1.5 mL/min,外标法定量,检测波长为338 nm和262 nm.在10 ～1 000 pmol/μL浓度范围内,17种氨基酸线性关系良好(R2 ＞0.999),峰面积的精密度(RSD):1.47％～3.84％,回收率91％～111％.8种烟台红富士苹果中游离氨基酸总量为47.0 ～140.9μg/g,必需氨基酸的含量比例为6.6％～29.5％,不同产地苹果中氨基酸含量在极差0.05水平上有显著性差异,对测定值分别进行聚类分析和主成分分析,8种不同产地的苹果样品可分为3类. 【期刊名称】《烟台大学学报（自然科学与工程版）》 【年(卷),期】2014(027)002 【总页数】6页(P111-116) 【关键词】烟台苹果;游离氨基酸;主成分分析;聚类分析;反相高效液相色谱 【作者】姜宏;左利民;周洁;邬旭然;山广志 【作者单位】烟台大学化学化工学院,山东烟台264005;中国医学科学院医药生物技术研究所,北京100050;中国医学科学院医药生物技术研究所,北京100050;中国医学科学院医药生物技术研究所,北京100050;烟台大学化学化工学院,山东烟台264005;中国医学科学院医药生物技术研究所,北京100050
游离氨基酸的测定实验报告
游离氨基酸的测定实验报告 一、实验目的 本实验旨在学习游离氨基酸的测定方法，了解不同游离氨基酸在不同 条件下的反应特点，掌握游离氨基酸的测定原理和操作技能。 二、实验原理 1. 游离氨基酸的化学性质 游离氨基酸是一类含有羧基和胺基的有机化合物，具有两个官能团。 在弱碱性溶液中，它们会发生季铵盐反应，生成带正电荷的离子。在 强碱性溶液中，则会发生烷化反应，生成相应的烷基胺。 2. 游离氨基酸的测定方法 （1）二硫代乙酰荧光素法：该方法利用二硫代乙酰荧光素与游离氨基酸之间发生缩合反应并产生荧光现象来测定游离氨基酸。 （2）二元亚胺法：该方法利用二元亚胺与游离氨基酸之间发生缩合反应，并通过比色法或荧光法来测定其含量。 （3）红外光谱法：该方法利用游离氨基酸的特征吸收峰来测定其含量。（4）高效液相色谱法：该方法是目前应用最为广泛的游离氨基酸分析方法，它可以快速、准确地测定多种游离氨基酸。 三、实验步骤 1. 样品制备：将待测样品加入适量的0.1mol/L盐酸中，加热至沸腾，
使样品蛋白质水解成游离氨基酸。 2. 二硫代乙酰荧光素法测定：将样品与二硫代乙酰荧光素混合后，放 置静置5分钟后，在荧光分析仪上进行荧光强度检测。 3. 二元亚胺法测定：将样品与二元亚胺混合后，放置静置10分钟后，在紫外分光光度计上进行吸光度检测。 4. 红外光谱法测定：将样品制成KBr片后，在红外光谱仪上进行扫描 检测。 5. 高效液相色谱法测定：将样品注入高效液相色谱仪中进行分析。 四、实验结果与分析 本实验中，通过二硫代乙酰荧光素法、二元亚胺法、红外光谱法和高 效液相色谱法共计测定了5种不同游离氨基酸的含量。根据实验结果，可以发现不同游离氨基酸在不同条件下的反应特点存在差异，因此需 要选择合适的测定方法进行分析。 五、实验注意事项 1. 实验过程中需严格按照操作要求进行操作，避免误差和污染。 2. 实验结束后要彻底清洗实验器材和仪器设备，保持干净整洁。 3. 注意安全，避免接触有毒有害物质。 六、实验结论 本实验通过对不同游离氨基酸的测定方法进行比较，发现高效液相色
HPLC分析测定不同茶叶中的游离氨基酸
HPLC分析测定不同茶叶中的游离氨基酸 王富花 【摘要】The composition of free amino acids in different tea (green tea, black tea and oolong tea) is ana-lyzed. Each dried pretreated tea(0.25 g) was extracted by 10 mL pure water in a designed temperature(90℃), extraction time 20 min. then filtrated through 0.45μm cellulose membrane, pretreated by SPE column. Take 70μL samples and 10μL O-phthalaldehyde(OPA) derivatization liquid in water bath reaction at a temperature of 25 ℃, 2 minutes later were determined by high performance liquid chromatography (HPLC), chromato-graphic condition was performed on a C18 column, DAD detector, detection wavelength was 338 nm. The mobile phase A was the methanol acetonitrile water solution, and the mobile phase B was the phosphate buffer solution. The results showed that the solid phase extraction cartridges (SPE) column treatment could effectively remove the influence of chromatographic peaks of impurities, and the HPLC method could be effective for the separation and determination of 17 kinds of amino acids in different tea,the content of amino acid in green tea was higher than fermented tea, especially aspartic acid, glutamic acid, and the content of L-Theanine in three kinds of tea was significantly different.%分析检测不同茶叶(绿茶,红茶,乌龙茶)中游离氨基酸的组成.称取0.25 g的茶叶于10 mL 90℃纯净水中浸提20 min后过0.45μm纤维素膜,滤液通过固相萃取(solid phase extraction cartridges,SPE)柱预处理后得到茶汤样品.取70μL的样品与10μL的邻苯二甲醛(OPA)衍生液在25℃水浴中反应2
茶 游离氨基酸的测定
茶游离氨基酸总量测定 文件类别：作业指导书 文件编号： 撰写单位： 版本: 第 1 版 发行日期： 机密等级: □机密□一般 合计页数: 共 2 页 核准审核初审制订会审
名称茶游离氨基酸总量测定文件编号: 1 原理 氨基酸在pH8.0的条件下与茚三酮共热，形成紫色络合物，用分光光度法在特定的波长下测定其含量。 2 仪器和用具 分析天平：感量0.0001g。分光光度仪。 3 试剂和溶液 3.1 pH8.0磷酸盐缓冲液： 按《茶茶多酚测定》中3.2的规定，配制1/15M磷酸氢二钠（3.2.1）和1/15M磷酸二氢钾（3.2.2）溶液。然后取1/15M的磷酸氢二钠溶液95ml和1/15M磷酸二氢钾溶液5ml，混匀。 3.2 2%茚三酮溶液： 称取水合茚三酮（纯度不低于95%） 2g，加50ml水和80mg氯化亚锡（GB 638-78，分析纯），搅拌均匀。分次加少量水溶解，放在暗处，静置一昼夜，过滤后加水定容至100ml。 3.3 茶氨酸或谷氨酸标准液： 称取100mg茶氨酸或谷氨酸（纯度不低于99%）溶于100ml水中，作为母液。准确吸取5ml母液，加水定容至50ml作为工作液（1ml含茶氨酸或谷氨酸0.1mg）。 4 操作方法 4.1取样方法 按“茶叶原料验收规范”（文件编号…………）要求进行取样。 4.2试液制备 按《茶茶多酚测定》中4.2.1试液制备之规定，制备试液。 4.3 测定 准确吸取试液（4.2）0.5ml，注入25ml容量瓶中，加0.5ml水，0.5mlpH 8.0缓冲液（3.1）和0.5ml 2%茚三酮溶液（3.2），在沸水浴中加热15min。待冷却后加水定容至25ml。放置10min后，用10mm比色杯，在570nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度（A）。 生效日期页次1/2 页序 A 表号:R-0110-002-1A 文件标准用纸
茚三酮法植物体内游离脯氨酸含量的测定
茚三酮法植物体内游离脯氨酸含量的测定 游离脯氨酸在植物体内的积累指数与植物的抗逆性有关。因此作为衡量植物抗逆性的一项生化指标。 一、【目的】 在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量可增加10~100倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。因此，测定植物体内游离脯氨酸的含量，在一定程度上可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力，可作为植物抗逆性的一项生化指标。 二、【原理】 采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样)限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm 处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比，可以用分光光度法测定。（有的用80%酒精） 紫色 三、【仪器与用具】 分光光度计：水浴锅；漏斗；20ml大试管数支；20ml具塞刻度试管9支；5～10ml注射器或滴管。 【试剂】 1．3％磺基水杨酸水溶液；甲苯；冰乙酸 2．5%酸性茚三酮显色液：称取2.5g茚三酮，加入60ml 冰乙酸和40 ml 2mol／L磷酸(以3∶2混合)，在70度下加热溶解，冷却后贮于棕色瓶中，此液在4℃下2～3d有效。 3．脯氨酸标准溶液：准确称取25Mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg／ml。再取此液10ml，用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg／ml的脯氨酸标准液。再用蒸馏水释释成1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0μg/mL 的系列溶液。 四、【方法与步骤】 样品脯氨酸提取：取不同处理(干旱处理与对照)的剪碎混匀小麦叶片各0.3g(干样根据水分含量酌减)，分别置于20ml 具塞试管中，加入5ml 3％硝基水杨酸溶液，管口加盖玻璃塞，于沸水浴中浸提15Min。取出试管，待冷却至室温后，过滤，滤液待测。 显色取9支具塞刻度试管,编号。分别向各管加入按下表加入脯氨酸标准液（每ml 10μg）样品液和试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热30Min，冷却。向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。避光静置20min以上. 待分层后，用吸管吸取甲苯层，以1号管为对照在波长520nM下比色。 标准曲线制作 以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程或绘制标准曲线。
实验：植物体内游离脯氨酸含量的测定
实验：植物体内游离脯氨酸含量的测定 植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低温、盐碱等逆境时，游离脯氨酸便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。 【原理】 采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样)限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nM处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。 【仪器与用具】 分光光度计；水浴锅；漏斗；20ml大试管；20ml具塞刻度试管9支；5～10ml滴管。 【试剂】 1、3%磺基水杨酸水溶液：3g磺基水杨酸溶于100mL蒸馏水中 2、甲苯 3、2.5%酸性茚三酮显色液：将2.50 g 茚三酮于60 mL 冰醋酸和40 mL 6 mol/L 磷酸中，加热（70 ℃）溶解。（冰乙酸和6mol/L磷酸以3：2混合，作为溶剂配制，此液在4℃下2-3天有效） 4、脯氨酸标准液：准确称取25mg脯氨酸，蒸馏水溶解后定容到250ml，其浓度为100μg/mL。再取此液10ml，用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg/mL的脯氨酸标准液。 【方法】 1、标准曲线制作 1）取7支具塞刻度试管按下表加入各试剂。混匀后在沸水中加热40min。 2）取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管为对照在波长520nm下比色。 3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。
2、样品测定 1）脯氨酸提取取不同处理的剪碎混匀小麦叶片0.2～0.5g(干样根据水分含量酌减)，分别置于大试管中，加入5ml 3％硝基水杨酸溶液，于沸水浴中浸提10min（提取过程中要经常摇动）。 2）萃取取出试管冷却后，吸取上清液2ml于干净试管，加2ml冰乙酸和3ml显色液，于沸水浴中加热40min。取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质，静置待分层后，用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。 3）结果计算 从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量的百分数。 脯氨酸[μg／g(干或鲜样)]＝（C×V/a）/ W 式中: C:提取液中脯氨酸浓度(μg)，由标准曲线求得； V:提取液总体积(ml)； A:测定时所吸取的体积(ml)； W:样品重(g)。 【思考题】 1、植物体内游离脯氨酸测定有何意义？ 2、当改变萃取剂时，比色应做哪些改变，如何选择最适波长，如何选择最佳萃取剂？
茶叶中游离氨基酸的测定
学海无涯，书山有路 1 茶叶中游离氨基酸的测定 过程生化成分的变化 。 试验的初步结果看出 糖类物质中单糖是随氧化过程逐渐增加的分钟含量最高,。 , 淀粉和双糖却是不断儿茶素,、 减少 , 果胶指数是氧化 多酚类物质中,, , 茶多酚总量。 、 黄酮类物质 都是随氧化时间延长而递减的化产物来看茶黄素氧化步结果。 与此相反, 非水溶性茶多酚却是不断增加的 从茶多酚的氧 一 分钟已达高峰 茶红素却不断增加分钟比较合适, 根据上述多种成份的变化 以及从茶黄素与茶红素的比例来看 酶性氧化 这是结合感观审评得出的初 茶叶中游离氨基酸的测定中国农科院茶叶研究所生理生化研究室近廿年来,氨基酸的分析方法有了很大的进展, 不仅操作精、 , 而且以全程自动化出名 。 本文研究了茶叶中氨基酸的纸上层析分离法种氨基酸的关系, , 利用单向层析 双向层析法从茶叶中分离出 , 并且进行了定性及定量工作。 , 对研究茶叶中氨基酸的组成与含量及其和茶叶品质 是一件必不可少的工作
学海无涯，书山有路 2 方法如下取样品,, 一 , 用“ 的帕甲酸水 肠乙醇提取 , 然后将过滤液蒸干加水以正丁醇, 进行点样肠乙醇 。 以正丁醇,冰醋酸水, 为展谱剂进行单向层析。 帕氨水。 二 酸相和正丁醇 作展谱剂进行双向层析 用苟三酮作为显色 剂 以纯品作对照确定各种氨基酸的位置进行定量 茶咖啡碱柱层分离测定法中国农科院茶叶研究所生理生化室茶样与氧化镁共热进行予热处理游离出咖啡碱层分离,, 然后通过氧化镁一硅藻土混合床进行柱比色测定本方法的特点是设备简单。。、 分离出的咖啡碱用磷钥酸试剂在波长,。 快速 。 并且完全弃除了实验室氯仿的毒害, 本文附有咖啡碱标准品的制备 提纯和鉴定方法 茶叶儿茶素纸谱分离和定量方法研究浙江农学院茶叶系 五十年代后期茶叶中多酚类物质测定主要应用乐文太尔氧化法测定相对总含量从, 。 年六十 , 年探究纸谱分析法, , 拟订定量法 。 使用此法研究茶叶多酚类混合体的组成及定量。 。 年代以后
植物体内游离脯氨酸含量的测定
目的意义 植物在正常条件下游离脯氨酸（proline，Pro）含量很低，但在干旱、高温、低温、盐碱、水涝等逆境条件下便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性呈正相关关系。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标，测定其含量也成为抗性生理研究的重要内容之一。 本实验的目的是掌握游离脯氨酸含量的测定方法、原理及操作技术。 一、酸性茚三酮法 （一）原理 植物体内的氨基酸只有脯氨酸能与酸性茚三酮发生反应，生成稳定的红色产物。该产物在515nm 有一最大吸收高峰，其吸收值与脯氨酸的含量呈直线关系。因此，样品中的脯氨酸含量可用酸性茚三酮法测定。除脯氨酸外，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮形成红色产物，碱性氨基酸对这一反应只有轻度干扰，在同类样品的测定中可忽略不计，在不同样品的测定中可加入人造沸石排除这种干扰。 （二）实验材料、仪器与试剂 1. 实验材料：正常生长与经逆境处理的植物茎、叶、穗等器官或组织。 2. 仪器：分光光度计、分析天平、离心机、温箱、冰箱、移液管、容量瓶、剪刀、镊子、纱布、研钵、漏斗、滤纸、具塞刻度试管、量筒、培养皿等。 3. 试剂： （1）酸性茚三酮试剂：称取重结晶茚三酮放入烧杯，加冰醋酸60mL、6mol·L-1磷酸40mL 于70℃下溶解，冷却后装入棕色瓶内贮于4℃冰箱中，24h内稳定。现用现配。 （2）100μg·mL-1脯氨酸母液：精确称取脯氨酸溶于少量80％乙醇中，用蒸馏水定容至100mL。 （3）其他试剂：人造沸石、活性炭粉、冰醋酸、80％乙醇。 （三）操作步骤 1. 标准曲线制作： （1）取7个50mL容量瓶，分别放入脯氨酸母液、、、、、、，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为、、、、、、μg·mL-1。 （2）另取具塞刻度试管8只（0～7号），0号加入2mL蒸馏水，1～7号分别加入不同浓度的标准系列各2mL，再分别加入冰醋酸2mL和茚三酮试剂2mL，充分摇匀，加盖，沸水浴10～15min。以0号管溶液为空白对照，于515nm处比色，记录消光值，以消光值为纵坐标，脯氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。 2. 样品提取：称取鲜样～，放入研钵或匀浆器中，加入80％乙醇3mL和石英砂少许研成匀浆，移入具塞刻度试管中，并用80％乙醇冲洗研钵，匀浆液与洗液合并总量为10mL，加盖后沸水浴煮沸10min，再加活性炭粉末，振荡过滤（用80％乙醇冲洗滤纸与残渣3次），滤液于80～85℃水浴上蒸去乙醇，残渣用蒸馏水洗涤并定容至100mL供测定之用。 3. 样品测定：取大试管1只，加样品提取液10mL和人造沸石1g，摇动10min并滤去人造沸石。取具塞刻度试管2只，各加入上述过滤样液2mL、冰醋酸2mL、茚三酮试剂2mL，摇匀后加盖，于沸水浴中煮沸10～15min，冷却后于515nm下比色，记录OD值。 （四）结果计算 W V C A ⨯ = 式中：A为样品脯氨酸含量（μg·g-1）；C为从标准曲线上查得脯氨酸浓度（μg·mL-1）；V 为样品稀释体积（mL）；W为样品重量（g）。 【附注】 脯氨酸与茚三酮于100℃下的反应时间需严格控制，不宜过久，否则将产生沉淀。
实验一植物体内游离脯氨酸含量的测定
实验一植物体内游离脯氨酸含量的测定 文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-
实验一植物体内游离脯氨酸含量的测定 一、目的 在逆境条件下（旱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显着增加，植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。 二、原理 磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。 三、材料、仪器及试剂 1. 材料：植物叶片。 2. 仪器：分光光度计；电子分析天平；离心机；小烧杯；普通试管；移液管；注射器；恒温水浴锅；漏斗；漏斗架；滤纸；剪刀；洗耳球。 3 .试剂及配制： 2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol·L－1磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。 3％磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。 10μg·ml-1脯氨酸标准母液配制：精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100μg·ml－1脯氨酸母
实验一 植物体内游离脯氨酸含量的测定
实验一植物体内游离脯氨酸含量的测定 一、目的 在逆境条件下（旱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显著增加，植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。 二、原理 磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。 三、材料、仪器及试剂 1. 材料：植物叶片。 2. 仪器：分光光度计；电子分析天平；离心机；小烧杯；普通试管；移液管；注射器；恒温水浴锅；漏斗；漏斗架；滤纸；剪刀；洗耳球。 3 .试剂及配制： 2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol·L－1磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。 3％磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。 10μg·ml-1脯氨酸标准母液配制：精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100μg·ml－1脯氨酸母液），再吸取该溶液10 ml, 加蒸馏水稀释定容至100ml, 即为10μg·ml-1脯氨酸标准液。 冰醋酸；甲苯。 四、实验步骤 1.脯氨酸标准曲线的制作 1.1取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～12μg的脯氨酸标准液。 加入表中试剂后，置于沸水浴中加热30min。取出冷却，各试管再加入
植物体内游离脯氨酸含量的测定(精)
实验20 植物体内游离脯氨酸含量的测定 一、原理 当植物缺水时体内的脯氨酸含量增加。植株体内脯氨酸含量在—定程度上反映了植株体内的水分情况，因而可以作为植物缺水情况的参考性生理指标。 用人造沸石在 pH 1~7 范围内振荡溶液，可除去干扰的氨基酸或使不与茚三酮反应（如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等），脯氨酸与茚三酮试剂呈显色反应，其含量与颜色深浅成正相关，可用分光光度计测定。此法有专一性。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 植物叶片。 （二）试剂 • 80%乙醇。 • 人造沸石。 • 活性炭。 4 ．茚三酮试剂：将 2.50 g 茚三酮于 60 mL 冰醋酸和 40 mL 6 mol/L 磷酸中，加热（ 70 ℃）溶解。试剂至少在 24 小时内稳定。 5 ．脯氨酸标准液：准确称取 25 mg 脯氨酸溶于少量 80 % 乙醇中，再用蒸馏水定容至 250 mL ，其浓度为100 μg/mL 。再取此液 10 mL ，用蒸馏水稀释至 100 mL ，即成10 μg/mL 的脯氨酸标准液。 （三）仪器设备 分光光度计，水浴锅，移液管，容量瓶，冰醋酸，仪器药品，离心机，烧杯，研钵，试管，恒温水浴 三、实验步骤 1 ．绘制标准曲线吸取脯氨酸标准母液 0 、 0. 2 、 0.4 、 0.8 、 1.2 、 1.6 、 2.0 mL 分别放入 7 支具塞刻度试管，分别加入蒸馏水至 2.0 mL, 其脯氨酸含量分别为0 、 2.0 、 4.0 、 8.0 、 12.0 、 16.0 、20.0 μg 。分别吸取上述标准溶液 2 mL ，加冰醋酸 2 mL, 茚三酮试剂 2 mL 加入试管中，混匀后加玻璃球塞，在沸水浴中加热 15 min 。用分光光度计于波长 515 nm 下进行比色测定，以零浓度为空白对照。将测定结果以脯氨酸浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标作标准曲线。 2. 植株样品液的提取选取植株功能叶片 2 g ，用 3 mL 80 % 乙醇研磨（放少许石英砂）成浆状。用 80 % 乙醇洗研钵，将提取物和洗液置于试管中。 80 % 乙醇总量为 10 mL 。加盖置于黑暗中室温下提取 24 h ，或 80 ℃恒温水浴中提取 20 min 。
植物生理生化实验
实验一植物组织游离氨基酸含量测定—茚三酮试剂显色法 P199 原理：游离氨基酸与茚三酮共热时能定量生成二酮茚-二酮茚胺，产物呈蓝紫色，称紫。其吸收峰在570，且在一定范围内吸光度与游离氨基酸浓度成正比，因此可用分光光度法测定其含量。 ①微酸、90℃：氨基酸被氧化形成2、3和醛，茚三酮被还原成还原型茚三酮。 ②脱水：还原型茚三酮与另一分子茚三酮和一分子氨进行缩合脱水，生成二酮茚-二酮茚胺。 材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。 实验步骤： 分别取1g萌发、未萌发水稻于研钵中，加入5醋酸（使蛋白质变性，沉淀），研磨成匀浆后，用无氨蒸馏水稀释至100。用干燥滤纸过滤到三角瓶中。如下操作
置于沸水中加热15，取出用冷水迅速冷却并不时摇动，使之呈蓝紫色，用60%乙醇定容20，在570波长下测定吸光度。 样品氨基态含氮量（100g鲜重）*100 ；(0.103) ；100/2 ；1 ；1 注意事项： 1.测定前所用的玻璃仪器要干燥，所用的蒸馏水必须为无氨水； 2.样品要磨匀，用无氨蒸馏水定容，并用干燥滤纸过滤； 3.抗坏血酸易被还原；加入的量要严格控制，因为还原剂抗坏血酸会与茚三酮反应； 4.水浴锅的液面要高于试管内的液面，使其加热均匀，并在加热后几秒再塞上塞子，水浴锅温度要高于90℃，15后取出迅速冷却，再加入60%乙醇； 5.稀释后要迅速比色； 6. 谷物等蛋白质样品可用酸水解法讲蛋白质水解后，用本法测定氨基酸含
量，可计算出样品蛋白质含量； 7. 反应要在无水、有机、微酸的环境下进行。最适为4.5，是乙醇-乙酸钠缓冲液和醋酸缓和后的。 思考题： 1.茚三酮与所有氨基酸的反应产物都相同吗？为什么？ 不相同，因为有些氨基酸的结构不同，不含游离的氨基，如脯氨酸。 2.测定植物组织中游离氨基酸总量有何意义？ 可以测定植物对氮的根吸收，测定植物的病理和逆境状态和植物的营养、施肥指标等。 3.植物组织氨基酸的测定为什么要除去蛋白质？用10%乙酸出去蛋白质的原理是什么？ 因为植物组织中除了游离氨基酸外还有蛋白质，蛋白质会影响实验结果。 10%乙酸会使蛋白质变性产生沉淀而被过滤除去。 4.抗坏血酸在测定中的作用是什么？ 作用是保护还原型茚三酮，防治其被氧化。 722S型分光光度计使用：①空白，开启，透射比0%，关上，100%。②吸光度模式 实验二植物组织可溶性蛋白质含量测定—酚试剂法P188 原理：酚试剂法，结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应。 ①碱性：蛋白质肽键与铜生成紫红色蛋白质-铜络合物。