《微生物菌种选育实验》实验设计指导

微生物菌种选育

实验名称：实验一、工业微生物菌种分离

实验目的：

1、加深对发酵工程上游技术中菌种筛选的认识；

2、学会常规选种方法；

3、树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。

实验内容：

小曲中高发酵力酵母菌菌株的紫外诱变选育

实验原理：

小曲是形态较小的一种糖化发酵剂，小曲是一种活菌制剂在生产中用量较少。小曲中常见微生物有产糖化酶的细菌、霉菌；有产蛋白酶的细菌、霉菌等。其中酵母菌是一种兼性厌氧菌，在有氧的时候大量增殖，在缺乏氧气时，发酵型的酵母通过将糖类转化成为二氧化碳和乙醇来获取能量。酵母菌的生殖方式分无性繁殖和有性繁殖两大类。酵母菌是小曲主要的功能微生物之一，它主要有酒精酵母和产酯酵母等，其中酒精酵母是大曲中主要的产酒功能菌。

酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形，酵母菌无鞭毛，不能游动。大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。

采用稀释涂布培养方法培养得到单菌落酵母菌，在根据酵母菌的菌落形态观察以及生理学特征对比可以判断出酵母菌。酵母菌的分类依据主要包括形态特征与生理学特征两大方面，根据Lodder(1970)与Barnit(1991)的鉴定方法，酵母菌主要是通过形态学观察并结合一些生理学试验来进行鉴定。

实验步骤：

1、TTC培养基的配制

(1)上层培养基(A)：TTC 0．5克、葡萄糖5克、琼脂15克、蒸馏水1000ml

称取上述药品于1000ml烧杯中加蒸馏水溶解，加热至沸腾在加入琼脂，继续加入至琼脂溶化后，装入锥形瓶中在121℃灭菌20分钟。待培养基冷却到50℃时，在超净工作台下倒平板，每个平板大约15ml培养基，放置使培养基凝固。

（2）下层培养基(B)：葡葡糖10克、蛋白胨2克、KH2PO4 1g 、酵母膏1．5克MgSO4?7H2O 0.4克、琼脂30克、蒸馏水1000毫升、pH5．5~~5．7。

按（1）的方法溶解加热溶解琼脂灭菌、分装。

1、PDA培养基的配制

马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15~20克、蒸馏水1000毫升、PH~7

取无霉烂的马铃薯去皮，称取200g后切成小块加水煮沸30min后过滤，补足水分在加

入葡萄糖、琼脂加热至琼脂溶化，装入锥形瓶中在121℃灭菌20分钟。待培养基冷却到50℃时，在超净工作台下倒平板，每个平板大约15ml培养基，放置使培养基凝固。并盛装10支试管灭菌搁置斜面。

2、无菌器材的准备

无菌试管9ml蒸馏水15支、无菌移液管15支、无菌培养皿9个

3、菌悬液的制备

取1g小曲加入编码为1的盛装9ml无菌试管中摇匀，在用1ml无菌移液管取1ml编号1中液体于编号2试管中摇匀，在用1ml无菌移液管在编号2中取1ml于编号为3中摇匀，按此依次制备到10-7。

4、接种

在超净工作台下分别取0.5ml编号为4、5、6试管中的菌悬液于编号为4、5、6的TTC 培养皿下层培养基中，将徒布棒用酒精灯灼烧待其冷却后轻轻的均匀涂满平皿即可。

5、培养

待接种在培养皿内的下层培养基在30℃，培养2—3天后，取灭菌冷却在45—50℃的一定量上层培养基盖在下层培养基的菌落上。30℃，在无光条件下培养2小时后，根据菌落呈色情况挑取红色菌株转接到试管斜面上。

6、初步鉴定

(1) 菌落形态

酵母菌菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一。一定时间内，凡与TTC作用呈红色的酵母菌落，为产酒高的酿造酵母(R)，粉红色菌落(P)次之，微红色或白色菌落通常为野生酵母(W)。

(2) 个体形态

挑取小许培养皿中初步鉴定的得出的酵母菌菌落，用革兰氏染色法制片观察其个体形态。酵母菌是革兰氏阳性菌，在显微镜下观察是紫色，形态大多是球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形，无鞭毛，不能游动。

7、斜面接种培养

取在TTC培养基上呈现红色菌落的酵母菌在试管斜面划线，在37℃下培养48h后，放置冰箱中保藏。

结果及讨论

1、结果

根据其形态特征和个体形态及生理特性鉴别酵母菌，并分离保藏酵母菌。

2、讨论

讨论在实验过程中有什么不足地方，实验的科学性以及实验的可靠性。

实验目的：

1、学习发酵菌种的复筛方法；

2、从已分离到的微生物中找出具有工业应用前景的菌株。

实验内容：

通过摇瓶培养对实验一所得的菌株的生产性能进行精确的定量测定。

实验原理：

发酵力是酵母菌重要的应用特性之一。酵母在微酸性糖液中起发酵作用，其中的糖逐渐减少，乙醇及CO2则依比例而增大，CO2是气体，除溶解于醪中者外，都跑向外面，所以测定酵母的发酵力，或测糖液比重的减小，或测糖的减少，或乙醇的增加，或称培器为减轻量，以CO2的失去多少，或用NaOH等固定CO2然后称其量，或将培养器密闭，由其中压力的增大，而定发酵的强弱等。

本次实验采用测量CO2的重量法，其方法是：制好培养基，装入带有发酵栓的瓶口，加实验一保藏的菌种菌悬液5ml，称瓶重至30℃培养箱内12小时后再称瓶，减少之数，即为CO2量。

以下式计算之：F=M—M’

F——发酵力，M’——5h称的质量，M——开始的初重量

实验步骤：

1、发酵培养基的配制；

40克蔗糖，2克磷酸二氢钾，1克磷酸二氢铵，0.25克硫酸镁瘃0.2克硫酸钙溶于400ml 蒸馏水中。

2、目的菌株的摇瓶（或三角瓶固态）培养；

挑取实验一保藏的酵母菌少许于盛有9ml无菌水的试管中制备菌悬液，吸取5ml 于盛装有培养基的三角瓶中，重复做3个三角瓶。测量盛装培养基的三角瓶质量为M，将三角瓶放置37℃下恒温培养12个小时，测量三角瓶质量为M’。(不考虑水分和酒精的挥发)

3、发酵液的生理活性测定。

在发酵前测得的重量M —发酵后测得的质量M’，即大小可表示酵母菌发酵力的强弱。得到质量减少量最多的酵母菌菌株，保藏在试管斜面中。

结果及讨论

1、结果

运用测CO2 的重量法，测得发酵前和发酵后三角瓶质量之差，既可以表明该酵母菌发酵力大小的判断。

2、讨论

测量酵母发酵力方法很多，比如重量法，体积法，高糖法等。讨论本实验测量酵母发酵力运用重量法，其优点在哪里，缺点是什么？

实验目的：

学习掌握微生物紫外诱变育种的方法。

实验内容：

用紫外线对实验二所得的菌株进行诱变，观察紫外线对酵母菌的诱变效应，并对诱变后的菌株进行筛选。

实验原理：

紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型。紫外线诱变一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20~30 cm，照射时间依菌种而异，一般为1~3 min，死亡率控制在50％~80％为宜。

在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞、均匀的悬液状态。这样，一方面分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，另一方面又可避免长出不纯菌落。菌悬液是直接供诱变处理的，由出发菌株的孢子或菌体细胞与生理盐水或缓冲液制备而成，其质量将直接影响诱变效果。同时，对于细菌细胞的生理状态，要求培养至对数生长期为最好。

本实验以紫外线处理高发酵力酵母菌，通过TTC平板的显色变化，选择高发酵力的酵母菌生产菌株。

实验步骤：

1、单细胞(或单孢子) 悬液的制备；

选取实验二中发酵质量减少量最多的菌株少许，放至盛有9ml的无菌水中，摇匀。在诱变前通过摇瓶振荡预培养，这不仅使菌体分散，得到单个细胞，还可利用温度和碳源控制其同步生长，取得年轻的、生理活性一致的细胞，这样细胞对诱变剂的敏感性和DNA复制都是有利的，易于造成复制错误而增加变异率。

2、致死曲线的测定；

3、诱变处理；

将1中制的菌悬液倾于无菌培养皿中（内放一个磁力搅拌棒），置电磁力搅拌器上于超净工作台紫外灯下（距离30cm）照射0.5~1min。

4、初筛；

取0.5mL诱变后菌悬液于TTC下层培养基平板上，用涂布器涂匀，重复3次。置37 ℃暗箱培养48h。取经灭菌冷却在45—50℃的一定量上层培养基盖在下层培养基的菌落上。30℃，在无光条件下培养2小时后，根据菌落呈色情况挑取呈红色的菌落进行复筛。

5、复筛；

挑取上述初筛得到的红色菌落少许于盛装9ml无菌水的试管中，摇匀制备菌悬液。在无菌条件下，取1ml于TTC培养基平板中涂布均匀，重复3次。置37 ℃暗箱培养48h。取经灭菌冷却在45—50℃的一定量上层培养基盖在下层培养基的菌落上。30℃，在无光条件

下培养2小时后，根据菌落呈色情况挑取呈红色的菌落接种到试管斜面。

6、菌种保藏。

挑取复筛得到的高发酵力菌株接种试管斜面中，在37℃下培养48h后，将其放置冰箱保藏。

结果及讨论

1、结果

通过紫外线诱变得到高发酵力酵母菌株，根据其在TTC平板上显色深浅判断所得到菌株是否是高发酵力菌株。

2、讨论

利用紫外诱变育种，应注意哪些因素?

为什么诱变育种后要挑选在TTC培养基中颜色最深的接入斜面保藏?