生物饵料培养实验指导教学版

实验一光合细菌、单胞藻的形态观察及计数

一、实验目的

观察光合细菌和单胞藻的形态，同时掌握用血球计数板法测光合细菌和单细胞藻密度的方法。

二、实验内容

1 观察光合细菌、单胞藻的形态；

2 用血球计数板法测定光合细菌和单细胞藻密度。

三、实验材料

单胞藻，光合细菌

四、实验仪器、设备

光学显微镜，血球计数板，载玻片，血盖片，盖玻片，擦镜纸，纱布，计数器，胶头滴管。

五、试剂

鲁哥氏碘液。

六、实验原理

血球计数板构造血球计数板是用一块比普通载玻片厚的载玻片特制而成。板的中部有两个被凹沟包围的近方形平面，再向外左右各有一个处于凹沟之中的狭长的长方形平面，前者比后者低0.1mm。在近方形平面的中央划线为一具准确面积的大小方格，在其中可以分为九个大方格，每一大方格的面积是1mm2。在四角及中央的大格又可分为16个中格。在中央的大格每一中格又分为25个小格，共400个格（也有一种计数板是25中格×16小格的，总数也是400格）。当加盖玻片后，每一大格即形成体积为0.1mm3的空间。

血球计数板构造图

七、实验步骤

㈠光合细菌和单胞藻形态观察：取1滴藻液或菌液滴在载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下进行观察其形态。由于光合细菌个体较小，必须在油镜下观察。

㈡计数：

1准备工作

容器准备定量前先清洗一个容积为30-100ml的容器，例如50ml烧杯取样。由于光合细菌和藻类细胞在培养液中的分布是不均匀的，尤其是具有运动能力的种类更明显。所以在取样前必须进行摇动，摇动后，立即取样。

样品固定如果样品细胞具有运动能力，必须加1-2滴碘液杀死后才能计数。

样品稀释如果细胞的浓度太大，计数困难，则必须把样品稀释到适宜的浓度。取已知体积的样品加入到已知体积的过滤海水中，从而达到一定的稀释倍数。例如取1ml藻液，加入到9ml海水中，藻密度就稀释到10倍。如果所测样品细胞具运动能力，可在稀释海水中事先加入鲁哥氏液，从而在稀释的同时完成固定。

2藻密度的测定

取清洁血球计数板，平放在实验台上，然后盖上清洁血盖片。摇动样品瓶，使细胞分布均匀，摇动后，立即用一支干的微吸管吸取藻液，迅速把吸管口放到计数板上的盖玻片边缘处，轻压橡皮头使水样流入计数板内。注意控制水样流入量，不能过多，过多则流到沟内，也不能过少，应充满划线方格及其周边部分，还应该注意不能有气泡，如果不合格，应重做。然后，稍停一分钟，待水样细胞沉降到玻片表面后，在显微镜下计数。

藻类细胞的计数，一般使用低倍镜或中倍镜，可计数任何对角两个大格，把大格中的16个中格逐一计数，每个样品需重复计数2次，然后取其平均值。

按下列公式计算每毫升藻液内所含的藻类细胞数：

1ml水体藻类细胞=计算平均值×10000×藻液稀释倍数

例：取1毫升小球藻藻液，加9毫升过滤海水稀释，在血球计数板上计算一大格的平均值为88个藻细胞

则1毫升藻液中小球藻的细胞数=88*10000*10=8800000

2光合细菌密度的测定：

光合细菌的计数，必须使用油镜才能观察清楚。可计数中央大格的四个角的中格，每个中格有25 个小格，逐一计数。四个中格相加共计数100个小格。计数出菌细胞总数后，按下列公式计算出每毫升菌液的菌细胞数。

每毫升菌液的菌细胞数=计数100个小格的菌细胞数×4×10000×稀释倍数

例如吸取待测的光合细菌菌液1ml，加水19ml稀释，计数100个小格的菌细胞数为320，则每毫升菌液的光和细菌数为：

320×4×10000×20=2.56亿

八、实验报告要求

要求绘出单胞藻和光合细菌的形态图，并测出一种单胞藻和一种光合细菌的密度。单胞藻或光合细菌各取样两次，每个样品测2个重复，取平均值。

九、实验注意事项

1 在计数前要仔细观察细胞形态，避免在计数时将杂质当作细胞，造成数据偏差；

2 不要将菌液或藻液滴到盖片以上。

十、思考题

1 应如何提高测定的准确性？

2 应如何合理缩短测定时间？

实验二单胞藻的培养

一、实验目的

掌握实验室培养单胞藻的各项技能。

二、实验内容

1 海水的消毒；

2 营养盐母液的配制与消毒；

3 培养容器的准备与消毒；

4 营养盐添加与接种；

5 培养日常管理。

三、实验材料

单胞藻，自然海水。

四、实验仪器、设备

高压蒸汽灭菌锅，光照培养箱，电子天平，电炉，三角烧瓶，细口瓶，移液管，吸球，皮筋，报纸。

五、试剂

NaNO3，NaH2PO4，ZnSO4，MnCl2，CuSO4，FeC6H5O7，Na2MoO4，CoCl2，Na2EDTA，维生素B1，维生素B12。六、实验原理

本实验综合运用微生物学知识，特别是消毒和无菌操作的理论和技术要领，以及单胞藻营养需求和生态学有关知识，在排除或抑制其他微小生物的前提下将单种单胞藻培养于理化条件和营养条件适宜的培养基。

七、实验步骤

㈠培养基的配制：

1 营养盐母液的配制：

营养盐母液是预先配制的高浓度的营养盐水溶液，经灭菌处理后可按体积加入培养基海水中。使用母液的方便之处在于：在配制单胞藻培养基时，只要预先知道母液中营养盐的浓度（在配制母液时准确称量营养盐的量和蒸馏水的量即可知道营养盐在母液中的准确浓度），定体积的移取母液加入培养基中就能实现营养盐的定量加入，而无须每次都用天平称量营养盐的质量。

母液应按照方便定量加入的原则，根据培养基配方配制。

例如盐藻培养基（见《生物饵料培养学》P76，加以改动：不采用原配方的Fe盐用量，并加入f2微量元素和f2维生素）母液的配制：

NaNO3：称取100g NaNO3溶解于1000ml蒸馏水。

KH2PO4：称取50g KH2PO4溶解于1000ml蒸馏水。

f2微量元素：按照《生物饵料培养学》P84所列用量称量各种药品，混合溶解于1000ml蒸馏水。

f2维生素：按照《生物饵料培养学》P84所列用量加入到盛有灭菌蒸馏水的细口瓶中。

将配制好的母液倒入细口瓶，在瓶口塞上纸条，旋紧后高压蒸汽灭菌。瓶口塞纸条是为了在灭菌时使内外气体能够流通，同时防止母液沸腾时将瓶塞顶掉而导致母液流失。

由于f2维生素母液不能加热灭菌，因此其配制方法有所不同。先取一定体积的蒸馏水倒入细口瓶中。灭菌后在无菌操作台上加入维生素针剂，摇匀待用。

2 海水的消毒：煮沸，冷却待用。一般使用三角烧瓶，倒入定体积的海水后，用报纸或牛皮纸包口，或用培养皿盖盖住瓶口。如用纸包口，不要先扎上皮筋，以免沸腾时蒸汽难以排出。加入海水不可过满，否则沸腾后海水会冲出瓶口。加热时间不宜过长，开始沸腾后片刻即可停止加热，以免破坏海水中原有的营养成分。

3 移液管的消毒：使用移液管来定量移取母液，而移液管在使用前要预先灭菌。可使用报纸或牛皮纸将移液管包好灭菌。移液管一次灭菌后只能使用一次，不能重复使用以免污染。灭菌后移液管不要放在潮湿的地方，如果去掉外包纸张后不可随意放于桌面上，或用手触碰抓握移液管中下部。

4 培养基配制：

按照培养液配方的用量，用灭菌移液管向消毒海水中加入营养盐母液。摇匀后待用。例如盐藻的培养，可按照《生物饵料培养学》P76盐藻培养液配方加入营养盐。使用移液管时要避免管尖附近部位触碰到其他物品，如果发生触碰应将移液管在酒精灯上灼烧消毒，冷却后再使用。如果由于手指触碰等原因污染了母液细口瓶的瓶塞，也要灼烧消毒。培养基必须现用现配，否则营养盐发生化学反应使培养基出现沉淀。

㈡接种：

1 培养容器消毒：预先将培养容器进行消毒。可以使用三角烧瓶或细口瓶。用报纸包口，扎上皮筋后高压蒸汽灭菌。

2接种：先将配好的培养基海水倒入培养容器中，然后将藻种倒入盛有培养基的培养容器内，使其微见藻色。手持包口纸时要避免触及与瓶口接触的内表面，放置包口纸时要倒立放在实验台上，使内表面朝上。

㈢培养：

1 培养条件：

营养单胞藻是一类能进行放氧光合作用的单细胞生物，所需营养物质可分为三类：大量元素，如C、H、O、N、P、S、Fe等；微量元素，如Cu、Zn、Mn、Co等；辅助生长因子，如V B1等。其中有些大量元素在海水中含量丰富或可以从空气中获得而不需要额外添加，因此实际需要添加的大量元素是N和P。微量元素虽然在天然海水中有一定含量但不能满足高密度培养的需要，还需要在培养基中额外添加。而维

生素等辅助生长因子和微量元素一样也需要额外添加。因此在培养基配制时要考虑到单胞藻的营养需求，添加足够和全面的营养元素。这是单胞藻培养正常进行的基础。

光照一定强度的光照是单胞藻生长和生存所必须的。不同的种类对光照需求有所不同，具体设定可参考《生物饵料培养学》P42-56。如果不是特殊的实验要求，一般采用全天光照。

温度适宜的温度能使单胞藻保持旺盛的光合作用和代谢作用，从而加快生长速度，因此保持一定的培养温度是十分必要的。培养过程中最好具有控温设备，从而保持恒温。不同的藻类适温范围不同，具体设定可参考《生物饵料培养学》P42-56。一般采用两个温度：20℃，用于低温种类；25℃，用于高温种。CO2是光合作用所必须的。小瓶培养可以通过振摇补充，容器较大时可考虑充气补充。振摇或充气还有使藻细胞均匀分布，和防止培养液表面形成菌膜的作用。振摇时要注意不可用力过猛使藻液溅到包口纸上。而充气培养要预先对充气管（石）进行消毒，在将管（石）放入培养容器过程中要避免二次污染。

2 方法：可以将接种后的培养容器放在光照培养箱中培养，保持全天光照，每天振摇1次。1周以后观察培养结果。

八、实验报告要求

记录操作过程，同时对实验结果进行总结。

九、实验注意事项

在实验过程中应严格执行无菌操作。

十、思考题

应从几方面入手，提高单胞藻的培养效果？

实验三单胞藻的分离

一、实验目的

掌握水滴法分离单胞藻的方法。

二、实验内容

练习水滴法分离单胞藻的操作。

三、实验材料

单胞藻。

四、实验仪器、设备

离心机，振荡器，光照培养箱，高压蒸汽灭菌锅，显微镜，电炉，酒精喷灯，酒精灯，载玻片，擦镜纸，纱布，胶头滴管，5mm玻璃管，试管，脱脂棉，标签纸，胶皮管，镊子，烧杯，三角烧瓶，广口瓶。

五、试剂

NaNO3，NaH2PO4，ZnSO4，MnCl2，CuSO4，FeC6H5O7，Na2MoO4，CoCl2，Na2EDTA，维生素B1，维生素B12。六、实验原理

由于培养时间过长和微生物污染，单胞藻会出现退化现象，主要表现在生长缓慢、达不到理想培养密度和容易发生突然衰败等。为了使单胞藻重新获得旺盛的生长能力，在培养一定时间后（例如半年到一年）就要进行一次分离培养。即首先尽量减少培养液中微生物含量，然后从培养液中挑出单个的藻细胞在新培养液中单独培养，从而使之“复壮”。

七、实验步骤

㈠用品准备：

1 拉管将5mm玻璃管在酒精喷灯上拉制成毛细管，套上胶管备用。

2 用品消毒将离心管和试管加上棉塞，然后用报纸或牛皮纸包裹，捆扎后高压蒸汽灭菌。烘干备用。

3 碎玻片和载玻片准备与消毒将载玻片砸碎，收集后倒入盛有70%酒精的广口瓶中，注意使液面淹没所有碎玻片，振摇使碎玻片和酒精溶液充分接触。另取一定数量的载玻片，放入盛有70%酒精的广口瓶中，注意使液面淹没所有载玻片。

4 培养基制备参考“实验二单胞藻的培养”。

5 藻液制备

⑴减菌处理：

①抗生素减菌：向藻液内同时加入青链霉素，使各自的浓度达到25U/ml。48h后重新接种除去抗生素残留。除去残留时可使用两种方法：一是接种少量藻液于新鲜培养液，二是将用新鲜培养液替换藻液，每次替换一半，2天左右替换1次。重复几次即可。

②离心减菌：离心，使藻细胞沉降于离心管底部，倒去上清夜，重新加入培养液，振荡后再离心。重复5次以上。

⑵稀释：向盛有培养液的试管中加入1毛细管藻液，摇匀后开始进行分离操作。

㈡分离

用镊子夹取从广口瓶中夹取一个载玻片，在酒精灯上燃烧灭菌，冷却片刻后平放于实验台。然后从广口瓶中夹取碎玻片，燃烧灭菌，冷却片刻后平放于载玻片上。一个载玻片上可同时放多个碎玻片。

将毛细管插入稀释好的藻液中，取出即有少量水样留于管内。用毛细管在预先灭菌过的碎玻片上吹一个水滴，尽量使整个水滴处于显微镜视野之内。然后在显微镜下观察。如果整个水滴之内只发现一个藻细胞，将该碎玻片夹起，放入具棉塞试管中。如果水滴中有不止一个藻细胞，则继续稀释藻液，直至达到理想浓度。

㈢培养：将分离好的试管放在试管架上，培养于光照培养箱中，培养条件参考“实验二单胞藻的培养”，每天振摇1次。大约1个月以后试管中出现藻色则说明分离取得成功。

八、实验报告要求

根据实验过程写出实验报告，同时每人至少分离出一株纯的藻种。

九、实验注意事项

在实验过程中应严格执行无菌操作。

十、思考题

1 分离前的减菌处理的必要性？

2 应如何避免碎玻片在灼烧过程中掉落？

3 应如何尽快在视野中找到水滴？

实验五卤虫形态观察

一、实验目的

掌握卤虫的主要形态特征。

二、实验内容

1 观察卤虫休眠卵的形态；

2 观察卤虫无节幼体和后无节幼体的形态；

3 观察卤虫拟成体和成体的形态。

三、实验材料

卤虫卵，无节幼体，后无节幼体，拟成体，成体。

四、实验仪器、设备

显微镜，解剖镜，针灸针，载玻片，擦镜纸，纱布，胶头滴管，烧杯。

五、试剂

鲁哥氏碘液，氯仿。

六、实验原理

卤虫休眠卵球形，外表土灰色或红褐色。干卵表面往往具有一块凹陷，形似瘪了的乒乓球。初孵无节幼体为I龄，有三对附肢：第1触角，第2触角和大颚。头部有一个颜色较深的斑点，是其单眼。此时口及肛门还没有通开，靠消化卵黄维持自身代谢。II龄以后的幼体为后无节幼体，消化道已经打通，身体逐渐延长，形成不明显的分节。无节幼体在4次蜕皮后变态为拟成体。此时体长增加明显，已形成不具附肢的后体节，同时头部出现复眼。触角失去运动功能，第二触角开始出现雌雄分化，雄虫的第二触角开始特化为抱持器，而雌性的则退化为小的叶片状感觉器官。胸肢也分化为端肢节、内肢节和外肢节。而腹部第1、2肢节组成的生殖节也出现外生殖器的原基。

幼体孵化后经12-15次蜕皮后成为成体。成体卤虫身体细长，分为头、胸、腹三部分。头部短小，不分节。背部中央有一深颜色的单眼，两侧有一对具柄的复眼，雄性的复眼往往比雌性的大。第1触角1对，不分节，细棒状，末端有感觉毛3根，一般雄性第一触角较雌性的长。第二触角1对，雌性的较粗短而稍弯曲，状如叶片。雄性第二触角极为发达，特化为由原肢节和末肢节组成的抱持器，原肢节中间区域有一个小的突起，称为额结节。末肢节大而扁平，呈三角形。大颚，第一小颚和第二小颚各1对，组成口器。胸部分11节，每节具扁平叶状胸肢1对。内缘为内叶，由一些小叶组成，各叶边缘有羽状刚毛和小刺。外缘末端的1片为扇叶，边缘呈羽毛状。基部的1片为外叶，边缘无毛。扇叶和外叶之间的1片为鳃叶，是呼吸器官。腹部由8个体节组成，无附肢。第一、二腹节愈合为生殖节。雌性生殖节腹面具一膨大的近球形卵囊，储存由卵巢排出的夏卵或休眠卵。卵囊近尾端有一个卵囊口，休眠卵或幼体由此口排出体外。卵巢1对，条带状，位于腹部皮下，性成熟时可见不成熟的卵粒。雄性生殖节腹面

具有阴茎1对，外观长条形，两阴茎基部相连。精巢1对，条带状，位于腹部皮下，性成熟时不透明。腹部最后一节为尾节，末端有1对扁平不分节的尾叉。尾叉上着生数量不等的刚毛。消化道从口至肛门贯穿身体中轴，口位于头部腹面，肛门位于左右尾叉之间，在充满食物时消化道非常明显。

卤虫形态图：A 后无节幼体；B 雌性成体；C 无节幼体；D 雄性成体；E 雌性卵囊；F 雄性抱持器放大；G 雄性阴茎。

七、实验步骤

1 卵用解剖镜观察卤虫卵的形态特征。

2 无节幼体、后无节幼体向无节幼体、后无节幼体培养容器中滴加适量的氯仿，将其麻醉后在显微镜下观察其形态结构。注意区分无节幼体和后无节幼体的主要形态区别。

3 拟成体和成体向拟成体和成体培养容器中滴加适量的氯仿，将其麻醉后在解剖镜和显微镜下观察其形态结构。为便于观察可借助针灸针，必要时进行简单的解剖操作，例如解剖下一条附肢。重点观察头部、雌雄生殖器官、附肢、尾节形态。

八、实验报告要求

要求每人画出轮虫形态构造图，以及卤虫无节幼体和雄性成体的形态图。同时总结卤虫无节幼体和

后无节幼体之间，拟成体与成体之间，以及雌雄成体之间的主要区别。

九、实验注意事项

用氯仿进行麻醉处理时应注意麻醉剂量和时间，麻醉剂量过大、时间过长会导致虫体死亡，而剂量过小则会因虫体躯干或附肢频繁摆动而影响观察。

十、思考题

1 卤虫休眠卵外观上具有什么特点？

2 所观察卵样中有没有破损的虫卵，情形如何？

3 无节幼体和后无节幼体形态上有什么区别？

4 拟成体和成体在形态上有什么不同？

5 雌雄成体在形态上有什么不同之处？外观上最容易区分两者的形态特征是什么？