检测口蹄疫血清抗体的方法

（一）口蹄疫正向间接红细胞凝集试验（间接血凝试验）

该试验是以口蹄疫O、A、C、Asia-1型病毒和猪水泡病病毒的细胞培养物（细胞毒）经PEG浓缩，蔗糖密度梯度超离后纯化的病毒抗原分别致敏戊二醛鞣酸处理的绵羊红细胞，而制成的血凝抗原，用于快速检测动物血清中的口蹄疫和猪水泡病特异抗体水平。

该法简易、快速、特异、直观、是当前测抗的实用方法。

1．试验材料 V型96孔110。医用血凝滴定板、玻璃板（与血凝板大小相同）、微量移液器（10~100微升）、塑料咀、微量振荡器、1毫升/5毫升刻度玻璃吸管、玻璃中试管（内径1.5毫米，长度100毫米）、铝质试管架（40孔）、口蹄疫各型和猪水泡正向间接血凝诊断液、口蹄疫O、A、C、Asia-1型阳性血清、SVD阳性血清、阴性血清、稀释液。

2．试验方法根据试验目的可分为用于鉴别诊断；用于监测疫苗接种动物的抗体水平的检测方法。

（1）疫苗接种动物抗体水平监测方法

接种何种疫苗就使用何种正向血凝诊断液。

①稀释待检血清在血凝板上1~8孔各加稀释液50微升，取待检血清50微升加入第1孔，混匀后从中取出50微升加入第2孔，混匀后从中取出50微升加入第3孔……直至第8孔混匀后从该孔取出50微升丢弃，保持每孔50微升的剂量。此时1~8孔的血清稀释度依次为1：2、1：4、1：8、1：16；1：32、1：

64、1：128、1：256。

②稀释阴性对照血清取中试管1支加稀释液1.5毫升，再加阴性血清0.1毫升，充分摇匀阴性血清的稀释度即为1：16。

③稀释阳性对照血清取中试管5支，第1管加稀释液3.1毫升，第2~5管分别加稀释液0.5毫升，取阳性血清0.1毫升加入第1管混匀后从中取出0.5毫升，加入第2管混匀后从中取出0.5毫升，加入第3管……直至第5管，此时各管阳性血清的稀释度低次为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512。

④滴加对照孔取1：16稀释的阴性血清50微升加入血凝板的第10孔；取1：500稀释的阳性血清50微升加入第11孔；取稀释液50微升加入第12孔。

⑤滴加正向血凝诊断液取正向血凝诊断液充分摇匀（瓶底应无血球沉淀），每孔各加25微升后立即置微量振荡器上振荡1分钟，取下血凝板放在白纸上观察每孔中的血球是否均匀（孔底应无血球沉淀）。如仍有部分孔底出现血球沉积，应继续振荡直至完全混匀为止。

⑥静置将血凝板放在室温下（15~30℃）静置2h后判定检测结果，若结果

不清晰或来不及判定，也可放置第2天判定。

⑦判定标准先观察10~12孔（对照孔），第10孔为阴性血清对照，应无红细胞凝集现象，红细胞全部沉入孔底，形成小园点或仅有25%红细胞有凝集（“+”的凝集）；第11孔为阳性血清对照，应出现“++”以上的凝集（50%以上的红细

胞发生凝集），证明该批正向诊断液的效价达到1：512为合格；第12孔为稀释液对照，红细胞也应全部沉入孔底或只有“+”的凝集。

在上述对照合格的前提下，观察待检血清各孔，以出现“++”凝集的待检血清最大稀释度为其抗体效价。例如检测接种口蹄疫O型灭活疫苗的猪群免疫水平时，某份血清1-7孔出现“++”或“++”以上（+++~#）凝集而第8孔仅有“+”凝集，判定该份血清中的O型抗体效价为1：128。

经实验室测定，口蹄疫O型灭活疫苗的免疫猪群血清中O型抗体效价达到1：128及其以上时，猪群可耐受20个O型强毒发病量的人工感染。

（2）用于鉴别诊断的正向间接血凝试验

①稀释待检血清取中试管8支列于试管架上，第1管加稀释液1.5毫升，第2~8管各加稀释液0.5毫升，取待检血清0.5毫升加入第1管混匀后从中取出0.5毫升加入第2管……直至第8管，待检血清的稀释度依次为1:4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256、1：512。

②稀释阴性对照血清取中试管1支加稀释液1.5毫升，再加阴性血清0.1毫升 ,即成1：16。

③稀释阳性对照血清取中试管5支，列于管架上，每管加稀释液4.9毫升阳血，依次用记号笔标明O、A、C、Asia型和SVD阳血，分别取这5种阳性血清10微升加入相应的试管中（注意每加一种阳性血清，必须单独使用一根吸管），盖上橡胶塞充分摇匀，阳性血清的稀释度即成1：500。

④滴加待检血清和对照血清取第8管待检血清加入血凝板上的1~5排第8孔，取7管血清加入1~5排的第7孔，取第6管血清加入1~5排的第6孔……直至第1孔，每孔 50微升。取阴性血清（1：16稀释度）加入1~5排的第10孔，每孔50微升。取1：500稀释的阳性血清加入1~5排的第11孔，每孔50微升。取稀释液加入1~5排的第12孔，每孔50微升。

⑤滴加正向间接血凝抗原（正向诊断液）第1排1~8孔和10~12孔加O型血凝抗原，每孔25微升。第二排1~8孔和10~12孔加A型血凝抗原，每孔25微升。第三排1~8孔和10~12孔加C型血凝抗原，每孔25微升。第四排1~8孔和10~12孔加Asia-1型血凝抗原，每孔25微升。第五排1~8孔和10~12孔加SVD血凝抗原，每孔25微升。加毕抗原后立即将血凝板置于微量振荡器上中速振荡1分钟，使抗体和抗原充分混匀，各孔不应有红细胞沉淀。

⑥静置从振荡器上取下血凝板，放在试验台上，盖上玻板，室温（15~30℃）静置2小时，判定结果，若结果不清晰或来不及判定，也可放置第2天判定。

⑦判定标准先仔细观察每排的10~12孔，10孔为阴性血清对照，12孔为稀释液对照，这2孔均应无凝集现象，或仅出现“+”的凝集。11孔为口蹄疫4个型和猪水泡病1：500稀释的阳性血清对照，应出现“++”~ “+++”的凝集，证明所使用的5种血凝抗原试剂合格。

在对照孔符合上述标准的前提下，观察1~5排的第1~8孔，某排1~8孔，出现“#”~“++”的凝集，其余4排仅在1~3孔出现“++”~“+”的凝集，便可判定该份待检血清为阳性，其型别与所加的血凝抗原的型别相同。例出第1排的1~3孔出现“#”凝集，第4-5孔出现“+++”凝集，第6孔出现“++”凝集，第7孔出现“+”凝集，第8孔无凝集（“—”），判定该份待检血清为口蹄疫O

型，表明血清中存在O型抗体其效价为1：128。如果该份血清采自口蹄疫O型疫苗免疫过的动物，就不能判定究竟是自然感染产生的抗体，还是接种过疫苗产生的抗体。因为本法尚不能区分感染性抗体和免疫性抗体。为此，欲使本法用于鉴别诊断，采血时必须要弄清该批动物是否接种过口蹄疫或猪水泡病疫苗。

⑧注意事项

A．严重溶血和污染的血清样品不宜检测，以免产生非特异反应。

B．勿用90o和130o血凝板，以免误判。

C．有时会出现“前带”现象，即第1~2孔红细胞沉淀而在第3~4孔又出现凝集，这是由于抗原抗体比例失调所致，不影响结果的判定。

D．血清必须是来自康复动物，至少是发病后10天的血清，否则不易检出。

注：稀释液配方如下：

Na2HPO4·12H2O (磷酸氢二钠) 35.8克

Na2H2PO4·2H2O （磷酸二氢钠) 1.56克

NaCl （氯化钠） 8.5克

NaN3（迭氮钠） 1.0克

加双蒸水或去离子水至1 000毫升，15磅高压灭菌20分钟，冷却后取出980毫升加正常兔血清20毫升即成，置4℃冰箱贮存备用。该配方适用于正向间接血凝试验和反向被动血凝试验，也适用于猪瘟间接血凝试验。

正向间接血凝抗原及其配套试剂由中国农科院兰州兽医研究所口蹄疫综防研究组提供。

（二）口蹄疫中和试验

病毒或毒素与相应抗体结合后，能使其失去对易感动物的致病力或对细胞的感染力，称为中和试验，中和试验不仅可在易感的实验动物体内进行，亦可在细胞培养或鸡胚中进行。

1．细胞中和试验

一般采用固定病毒稀释血清法，该法须在无菌条件下操作，亦须细胞适应毒。

（1）取两列无菌试管，第一列为正常血清对照组，第二列为待检血清中和组。先在二列试管中的第1管加含有0.5%水解乳蛋白的汉克氏液（乳白液）3毫升；第2~6管各加乳白液2毫升。

（2）取正常血清1毫升加入第一列的第1管，取待检血清1毫升加入第二列的第1管，混匀后，以同法对倍稀释，1~6管的正常和待检血清稀释度依次为1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128。

（3）二列试管中的1~6管分别加入 200TCID50细胞适应毒2毫升充分摇匀，置37℃水浴中保温60分钟。

（4）取各稀释度的血清分别接种3瓶长满单层的细胞，倾去旧的细胞营养液，每瓶接种1毫升，置37℃恒温箱内静置培养3天，每日镜检一次并详细记录细胞病变情况。

（5）细胞培养3天后判定结果，正常血清对照组的细胞应全部出现病变；中和组的血清1：8以上无细胞病变，判为阳性。1：8的血清出现细胞病变则判为阴性，该法特异性强，结果可靠，但要求无菌设备和培养细胞的条件，操作繁琐，

基层难以应用。

2．乳鼠中和试验

5~7日龄小白鼠对人工接种口蹄疫病毒易感染，产生特征性症状和规律性死亡。因此利用这一特性进行乳鼠中和试验。操作步骤如下：

（1）将待检血清用生理盐水或pH7.6的0.1M PBS稀释成1：4、1：8、1：16、1：32、1：64，分别与等量的10-3口蹄疫乳鼠适应毒混合，37℃水浴保温60分钟。

（2）每次试验应设阴性血清（1：8）与10-3病毒的混合液作为病毒对照；已知阳性血清与10-3病毒的混合液作为阳性对照，处理方法同（1）步骤。

（3）每一稀释度血清中和组分别于颈背皮下接种5~7日龄乳鼠4只，对照组接种2只，0.2毫升/只，由母鼠哺乳，观察5天判定结果。

（4）判定标准先检查对照鼠，阴性对照鼠应于48小时内病死；阳性对照鼠应健活。待检血清任何一组的乳鼠健活或仅死二只，判定该份血清为阳性。以能保护50%接种乳鼠免遭病毒感染的血清最大稀释度为乳鼠中和效价。

该法特异性强，结果可靠，简单易行，基层可采用。但存在需时较长，乳鼠易被母鼠所吃或咬死，敏感性低等缺点。

（三）口蹄疫乳鼠保护试验

待检血清稀释成1：5，接种乳鼠后12小时或24小时，用10-3病毒攻毒，同时设阴性血清和已知阳性血清（均为1：5稀释）作为对照。观察5天后判定结果。在阴性和阳性血清对照成立的前提下，待检血清组的乳鼠健活，判定该份血清为阳性，反之，则判为阴性。

该法多用于定性检测，一般不作为定量检测手段。

（四）口蹄疫琼脂扩散试验

抗原抗体在琼脂凝胶中，各以其固有的扩散系数扩散，当二者相遇时，在比例适当处发生结合而形成肉眼可见的沉淀带。

操作步骤如下：

1．称取琼脂糖或琼胶素1 克 ,迭氮钠1克，氯化钠 0.85克加pH7.6的0.01M PBS 100毫升。置沸水中煮熔化或15磅高压10分钟。趁热倾入平皿中，厚度3~4毫米。

2. 琼脂冷却凝固后，用打孔器打成中央一孔周围6孔的梅花形孔；中央孔径4~5毫米，周围孔径3毫米与中央孔的孔距3~4毫米。

3.中央孔加已知型别的浓缩抗原，四周孔加不同稀释度的待检血清和阴性、阳性对照血清（1：2稀释），静置扩散1小时。

4. 移入湿盒内于室温或在37℃温箱内自由扩散3~5天，也可放置于4~6℃冰箱内扩散。

5. 判定标准：出现沉淀线判阳性，反之，则判为阴性。

该法无需特殊仪器，设备通常用于定性检测，但需时间长，敏感性差，漏检率高。

（五）口蹄疫微量补体结合试验

1．在U型24孔或96孔微量滴定板上每孔滴入生理盐水100微升。

2．每孔滴入一份经过56℃灭活30分钟的待检血清25微升。

3．每板设已知阴性、阳性血清2孔对照（与待检血清试验条件相同）。

4．每孔滴入口蹄疫标准抗原25微升。

5．每孔滴入补体工作浓度50微升。振荡30秒，37℃温箱保温40分钟。

6.每孔加溶血素工作浓度 25微升和2%绵羊红细胞 25微升，振荡30秒于37℃下保温30分钟。

判定结果，阴性对照血清孔应完全溶血；阳性血清对照孔应不溶血为合格。凡完全溶血的待检血清判为阴性；凡不溶血的待检血清判为阳性。

该法特异性强，但敏感性低，适用于定性检测。

（六）口蹄疫对流免疫电泳

1. 电泳槽内的缓冲液为巴氏妥——巴氏妥钠缓冲液。

2. 1克琼脂糖加pH7.6的0.1M PBS 100毫升加热熔解后浇灌在5×13厘米玻板上厚度为0.6~0.8毫米，冷却凝固后用打孔器制成二排孔，其距离为3~4毫米，每5对孔为一组，组间距离为10毫米。

3. 每组左边孔，分别加O、A、C、Asua-1型和SVD浓缩抗原，每组右边孔加1：2的待检血清。每次试验应设阴性、阳性血清对照，抗原孔边用湿滤纸搭桥接阴极；血清孔边用湿滤纸搭桥接阳极。电压为80-110V，电流强度为15mA，电泳90分钟后取出凝胶板，并置于湿盒内37℃放置3~4小时判定结果。

4. 先检查对照孔，阴性血清应无沉淀线；阳性血清应出现清晰的沉淀线。凡与标准抗原对应孔的中间形成沉淀线的待检血清判为阳性，其型别与标准抗原的型别相同，反之，则判为阴性。

该法较琼扩灵敏度高，适用于大批血清样品的检测。

体液免疫球蛋白测定

体液免疫球蛋白测定第一节血清IgG、IgA、IgM测定血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM定量测定方法一般有单向环状免疫扩散法、火箭免疫电泳法、ELlSA、免疫比浊法、放射免疫分析法等。临床常用单向环状免疫扩散法和免疫比浊法来测定血清免疫球蛋白含量。一、血清IgG、IgA、lgM测定（一）单向环状免疫扩散法该法的原理是将抗血清均匀地分散于琼脂或琼脂糖凝胶内，胶板上打孔，孔内注入抗原或待测血清，抗原在含有抗血清的胶内呈放射状（环状）扩散，在抗原抗体达到一定比例时形成可见的沉淀环。在一定条件下，抗原含量越高，沉淀环越大。（二）免疫比浊法该法具有检测范围宽、测定结果准确、精密度高、检测时间短（一般在几分钟内即可完成测试）、敏感度高、稳定性好等优点。二、血清IgG、IgA、IgM测定的临床意义（一）年龄新生儿可由母体获得通过胎盘转移来的IgG，故血液中含量较高，接近成人水平。（二）免疫球蛋白IgG、IgA、IgM均升高慢性肝脏疾病如慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、隐匿性肝硬化患者血清中可见3种Ig均升高。慢性细菌感染如慢性支气管炎、肺结核，血IgG可升高。宫内感染时脐血或出生后的新生儿血清中IgM含量可增高。SLE患者以IgG、IgA升高较多见。类风湿关节炎患者以IgM增高为主。（三）单一免疫球蛋白升高主要是指患者血清中某一类免疫球蛋白含量显著增多，大多在30g／L以上，这种异常增多的免疫球蛋白其理化性质十分一致，称为单克隆蛋白（MP）即M蛋白。此类异常增多的免疫球蛋白多无免疫活性，故又称副蛋白。由它所致的疾病称为免疫增殖病如多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、恶性淋巴瘤、重链病、轻链病等。（四）免疫球蛋白降低先天性低Ig血症，主要见于体液免疫缺陷病和联合免疫缺陷病。IgA缺乏患者，易发生反复呼吸道感染。IgG缺乏患者，易发生化脓性感染。IgM缺乏患者，易发生革兰阴性细菌败血症。第二节血清IgD和IgE测定正常人血清中IgD含量很低，仅占血清免疫球蛋白总量的0.2%。膜结合型IgD（mIgD）构成BCR，是B 细胞分化发育成熟的标志。未成熟的B细胞仅表达mIgM，成熟B细胞可同时表达mIgM和mIgD。活化的B 细胞或记忆B细胞其表面的mIgD逐渐消失。 IgE是正常人血清中含量最少的免疫球蛋白，要由黏膜下淋巴组织中的浆细胞分泌。其重要特征为糖含量高达12%。IgE为亲细胞抗体，可引起Ⅰ型超敏反应。IgE可能与机体抗寄生虫免疫有关。第1页

口蹄疫O型间接血凝抗体检测试验

口蹄疫O型间接血凝抗体检测试验一、原理：用已知血凝抗原检测未知血清抗体的试验，称为正向间接血凝试验（IHA）。抗原与其对应的抗体相遇，在一条件下形成抗原—抗体复合物。但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。将抗原吸附（致敏）在红细胞表面，制成口蹄疫血凝抗原，用于检测免疫动物血清中的口蹄疫抗体水平。这种经过口蹄疫抗原致敏的红细胞与口蹄疫抗体相遇，红细胞便出现清晰的凝集现象。二、主要组分： 1．口蹄疫O型血凝抗原5ml/瓶，5瓶/盒； 2．口蹄疫O型阳性对照血清0.5ml/管，1管/盒，阳性血清已1:4稀释； 3．口蹄疫O型阴性对照血清0.5ml/管，1管/盒； 4．稀释液50ml/瓶，2瓶/盒； 5．封板膜10张/盒。三、试验器材： 1．96孔110°V型医用血凝板； 2．8道或12道移液器； 3．微量振荡器。四、物理性状： 1．抗原摇匀呈棕红色（或咖啡色），静置后，血球逐渐沉入瓶底； 2．阴性对照血清淡黄色清亮稍带粘性的液体； 3．阳性对照血清微红或淡黄色稍浑浊带粘性的液体； 4．稀释液淡黄或无色透明液体，低温下放置，瓶底易析出少量结晶，在水浴中加温后即可全溶，不影响使用。五、作用与用途：用于检测口蹄疫O型疫苗免疫动物血清抗体效价。六、用法与判定： 1、用法 1.1加稀释液在血凝板上1～7排的1～10孔、第8排的1～4孔和第5～7孔；加稀释液50μl/孔。 1.2稀释待检血清待检血清使用前，需经过56℃水浴灭活30分钟，取待检灭活血清样品50μl，分别加入反应板1～6排的第1孔中，与稀释液混匀后，吸取50μl，加于第2孔中，依次作2倍系列稀释至第10孔，第10孔混匀后取出50μl弃去。 1.3稀释阳性对照血清在血凝板的第7排第1孔加阳性血清50μl，2倍系列稀释至第10孔，混匀后从该孔取出50μl丢弃。此时被检血清和阳性血清的稀释倍数依次为1:2～1:1024。

抗原或抗体的检测

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抗原或抗体的检测一、检测的原理借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对样品中的抗原或抗体进行定性、定量、定位的检测。 1．抗原与抗体的亲和力（afｆiｎitｙ)抗原抗体的结合就像酶与底物的结合，激素与其受体的结合一样不是化学的反应,而是非共价键的可逆的结合。抗原决定簇和抗体分子可变区互补构型,造成两分子间有较强的亲和力。空间构型互补程度不同,抗原和抗体分子之间结合力强弱也不同。互补程度高，则亲和力强。此外，反应温度、酸碱度和离子浓度对抗原和抗体分子上各基因的解离性和电荷特性也有重要的影响,抗体与抗原决定簇之间的结合力大小可用亲合力来表示。高亲合力的抗体与抗原的结合力强，即使抗原浓度很低时也有较多的抗体结合抗原形成免疫复合物。 2．抗原或抗体外检测原理根据抗原抗体结合形成免疫复合物的性状与活性特点,对标本中的抗原或抗体进行定性、定位或定量的检测。定性和定位检测比较简单,即用已知的抗体和待检样品混合,经过一段时间，若有免疫复合物形成的现象发生,就说明待检样品中有相应的抗原存在。若无预期的现象发生,则说明样品中无相应的抗原存在。同理也可用已知的抗原检测样品中是否有相应抗体。对抗原或抗体进行定量检测时,以反应中加入抗原和抗体的浓度与形成免疫复物的浓度呈函数关系。（1）根据免疫复合物产生的多少来推算样品中抗原（或抗体）的含量:在一定的反应条件下,加入的已知抗体(或抗原)的浓度一定,反应产生的免疫复合物多少与待检样品中含有相应抗原(或抗体)量成正比。也就是抗体浓度一定时，免疫复合物越多则样品中的抗原量也越多。可用实验性标准曲线推算出样品中抗原(或抗体）的含量。如免疫单向扩散试验、免疫比浊试验和酶联免疫检测等都属于这类方法。 (2)抗原或抗体效价滴定的原理:当抗原抗体复合物形成多少不能反应抗原抗体反应强弱时，就不能以检测反应强度来对抗原或抗体进行定量。在实际工作中,把浓度低的反应成分（抗原或抗体)的浓度固定，把浓度高的另一种反应成分作一系列稀释。例如用人血清作抗原免疫3只家兔,比较3只家兔产生抗体的多少,即滴定3只兔血清抗体效价,可用双向琼脂扩散法来滴定,例如将抗体浓度固定，将抗原作不同的稀释度,分别将抗原或抗体滴入琼脂的相应小孔中，观察免疫兔血清与不同稀释度的抗原出现明显沉淀浅的抗原稀释度(如甲兔的抗体效价为1/２０00，而丙免的是1/８00０则可比较出后者比前者产生抗体的效价要高）。也就是表示效价的稀释度越高,样品中所含待检成分越多。因人血清(抗原)和抗体（免疫兔血清）相比，浓度高，故应稀释抗原。二、抗原或抗体检测的实用意义１．抗体检测的意义检测抗体可用于评价人和动物免疫功能的指标。抗体用于临床治疗或实验研究时也需做纯度分析和定量测定。临床上检测病人的抗病原生物的抗体、抗过敏原的抗体、抗HLＡ抗原的抗体、血型抗体及各种自身抗体,对有关疾病的诊断有重要意义。２．抗原检测的意义可做为抗原进行检测的物质可分为以下四类: （1)各种微生物及其大分子产物:用于传染病诊断、微生物的分类及鉴定以及对菌苗、疫苗的研究。（２）生物体内各种大分子物质：包括各种血清蛋白(如各类免疫球蛋白、补体的各种成分)、可溶性血型物质、多肽类激素、细胞因子及癌胚抗原等均可做为抗原进行检测。在对这些成分的生物学作用的研究以及各种疾病的诊断有重要意义。（3）人和动物细胞的表面分子：包括细胞表面各种分化抗原(如CD抗原)、同种异型

新城疫抗体水平检测

新城疫抗体水平检测文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-

新城疫的血凝和血凝抑制试验高若开一、实验目的 1.掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操作方法和结果判定方法。 2.分析血凝和血凝抑制试验的影响因素，用以确定最佳免疫时间、判定免疫效果和辅助疾病诊断。二、实验内容 1.血凝试验(HA)检测新城疫抗原 2.血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体三、实验原理 1.血凝试验（HA ）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA ）,也称直接血凝反应。 2.血凝抑制试验（HI ）原理：当在病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI ）反应，也称血凝抑制反应。病毒颗粒红细胞

口蹄疫O型液相阻断ELISA免疫抗体检测方法的应用_胡珊莲

2015年第1期浙江畜牧兽医欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍表3 副猪嗜血杆菌西药药敏试验结果药物耐药中敏高敏抑菌圈直径环丙沙星1516－202126氧氟沙星1011－151632头孢哌酮1516－202136复方新诺明1011－151611林可霉素1415－20210诺氟沙星1516－181924青霉素1920－27280链霉素1112－14150庆大霉素 12 13－14 15 21 Hps 血清型较多，目前报道有15种，不同菌株对同一种抗生素的敏感性存在很大差异，临床治疗应结合分离菌株的药敏试验结果，科学用药。3小结与讨论本试验通过对疑似发病猪场采集患猪病料，并进行病原菌分离鉴定、动物试验，鉴定为副猪嗜血杆菌。通过药敏试验，确诊分离菌对庆大霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和头孢哌酮高敏，复方新诺明中敏，青霉素、链霉素、林可霉素耐药；对金银花及其组成的复方敏感，且复方作用效果优于单方［9］。副猪嗜血杆菌病临床治疗上中药建议使用金银花及其组成复方，西药建议使用庆大霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和头孢哌酮。参考文献［1］Oliveira S ，Blackall P J ，Pijoan C．Characterization of the di －versity of Haemophilus parasuisfield isolates by use of sero －typing and genotyping ［J ］．Am J Vet Ｒes ，2003，64（4）：435－442．［2］Del Ｒio M L ，Gutierrez C B ，Ｒodriguez Ferri E F．Value of in －direct hemagglutination and coagglutination tests for serotyping Haemophilus parasuis ［J ］．J Clin Microbiol ，2003，41（2）：880－882．［3］蔡旭旺，刘正飞．副猪嗜血杆菌的分离培养和血清学鉴定［ J ］．华中农业大学学报，2005（2）：55－58．［4］高丰，罗毅，成军，等．副猪嗜血杆菌感染的诊断与防治［J ］．动物医学进展，2002，23（6）：101－102．［5］朱小宁，余兴龙，李润成，等．副猪嗜血杆菌的分离与鉴定及其16S rＲNA 生物信息学分析［J ］．湖南农业大学学报：自然科学版， 2009，35（5）：517－520．［6］易顺华，陈进喜，蒋碧桂．副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验［ J ］．动物医学进展，2009，30（9）：41－44．［7］冼琼珍，黄耿森，王淑敏，等，副猪嗜血杆菌的分离鉴定［J ］．中国兽医杂志：2006：42（3）：27－28．［8］尹秀凤，王艳，姜平，等．副猪嗜血杆菌PCＲ检测方法的建立与应用［J ］．中国兽医学报，2007，27（2）：180－183．［9］华升，梅书棋，曾德芳．副猪嗜血杆菌病研究进展［J ］．动物医学进展， 2006，27（11）：7－10．收稿日期：2014- 11-21口蹄疫O 型液相阻断ELISA 免疫抗体检测方法的应用胡珊莲（上海市闸北区光明荷斯坦牧业有限公司，上海闸北200436）摘要：应用液相阻断ELISA 试验方法检测上海光明荷斯坦牧业有限公司牧场牛群经口蹄疫O 型灭活疫苗免疫的奶牛血清样品2412份。经检测，2412份样品中规模奶牛场牛群免疫抗体滴度≤1?64样品42份，抗体滴度≥1?128样品2370份，抗体保护率为98%。关键词：液相阻断ELISA ；O 型口蹄疫；抗体检测；奶牛中图分类号：S858．23文献标识码：A 文章编号：1005－7307（2015）01－0003－003 口蹄疫属我国农业部公布的一类动物疫病，是由口蹄疫病毒引起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，以牛，猪最易感，羊、骆驼、象等均有发病报告。该病可分为O 、A 、C 、南非Ⅰ型、南非 Ⅱ型、南Ⅲ型和亚洲Ⅰ型等7个血清型，其中以O 型和A 型分布最广，危害最大。本试验应用液相阻断ELISA 检测方法跟踪检测上海光明荷斯坦牧业有限公司下属牧场O 型口蹄疫疫苗免疫抗体滴度水平，以利及时指导下属牧 3

免疫比浊法检测免疫球蛋白

免疫比浊法检测免疫球蛋白一、实验目的利用免疫比浊法绘制标准曲线，并检测样品中免疫球蛋白的浓度。（本小组检测的为IgG样品）二、实验原理 1.抗原抗体反应(Antigen-antibody reaction)：抗原与其刺激机体产生的相应抗体在体内或体外发生特异性结合的反应。反应特点有：特异性、比例性、可逆性、敏感性。影响因素有：电解质、温度、酸碱度。 2.免疫比浊法：合适比例的抗原抗体形成的免疫复合物，在PEG作用下形成微粒，使样品浊度发生变化。当一束光线通过溶液受到光散射和光吸收两个因素的影响而使光的强度减弱，根据光的强度改变可测得微粒浓度。分类：①透射比浊法（Transmission tubidimetry）当一定波长光线通过浊度发生变化的反应混合物时，由于被不溶性免疫复合物吸收而减弱，故在一定范围内吸光度与免疫复合物量呈正相关。当抗体浓度固定（过量），样品的浊度与其中所含抗原量成正比。（特点）透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计，几乎所有的实验室均能开展。不足的是灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗血清量大，检测的时间较长。②散射比浊法（Nephelometry）光线通过检测溶液时，被其中所含的抗原抗体复合物折射而部分偏转，产生散射光，其强度与复合物的数量和散射夹角成正比，与光的波长成反比。（特点）优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。其缺点是需特定的分析仪器，试剂价格高。本实验采用透射法。 3.聚乙二醇PEG的作用：在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂，3~4％的聚乙二醇，可破坏抗原抗体的水化层，促进抗原抗体靠近反应，但如浓度不适合，会影响其它溶质或产生非特异性聚集影响结果。三、实验材料免疫球蛋白A,G(IgA,IgG)测定试剂(试剂1[PEG]，试剂2[羊抗人IgA, IgG]）（1管/每组）免疫球蛋白A, G(IgA,IgG)校准品，蒸馏水，血清样本（1管）微量加样枪、ep管（1.5mL离心管）酶标仪、水浴箱四、实验步骤 1.在7个EP管中各加250μL IgG试剂1（PEG）。 2.7管分别加入蒸馏水、校准品原液、1：2校准品、1：4校准品、1：8校准品、1：16校准品、样本各2μL。 3.混匀后37℃水浴5min。 4.7管各加入85μL IgG试剂2（羊抗人IgG）。 5.混匀后37℃水浴10min。 6.分别吸取200μL至96孔酶标板中，用酶标仪在700nm处读取OD值。五、实验结果与数据处理 2.标准曲线

新城疫抗体水平检测

应，也称血凝抑制反应。四、实验材料离心机、恒温箱、冰箱、振荡器、96孔血凝版（5块）、微量移液器（20-100微升可调）、吸液尖（若干）、洗耳球、离心试管、普通试管、试管刷、烧杯、吸量管、一次性注射器、ND 标准抗原、1%红细胞悬液、抗凝剂、生理盐水。五、实验步骤（一）抗凝剂的配制将1克柠檬酸钠用25毫升生理盐水稀释备用。1毫升抗凝剂可用于采集9毫升血液。（二）10%红细胞悬液的配制 1、用注射器吸取0.5毫升抗凝剂无免疫健康青年公鸡的红细胞4.5毫升。 2、1500转离心5分钟，吸弃上清液。 3、用5-10倍生理盐水1500转洗涤3次，前两次5分钟，后一次10分钟。 4、吸弃上清液，用吸量管吸取红细胞，配制成10%红细胞悬液。 5、2-6摄氏度储存，备用。抗体

实验一_鸡新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法讲解

鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法 1．本次实验的目的和要求掌握鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。 2．实验内容或原理某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象(HA)。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验(HI)。 3．需用的仪器或试剂等动物健康成鸡2-5只，被检鸡15-25只。器材高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、0.025mm微量吸液器、微型振荡器、微量移液器、脱脂棉等。药剂（1）浓缩抗原；（2）生理盐水或磷酸缓冲盐水（PBS）；（3）Alsever细胞保存液；（4）红细胞悬液；（5）待检血清 4．实验步骤 (1)发现与鉴定病毒：鸡新城疫和禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡的红细胞，又能被特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应，即可鉴定此病毒。 (2)诊断病毒性疾病：如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验，如抗体效价有4倍以上升高，即有诊断意义。（3）免疫机体抗体效价的测定： 3.鸡新城疫（ND）的HA和HI （1）试验准备 ①抗原：一般以鸡新城疫Ⅱ系或LaUra系冻干苗作为已知抗原，进行试验。 ② 0.7％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血，放入含有抗凝剂的灭菌试管(按每毫升血加入3.8％灭菌柠檬酸钠0.2毫升做抗凝剂)内，迅速混匀。如当时不用，可直接采血放入红细胞保存液内(保存液2份，血液1份)于4℃冰箱内可保存两周。红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经3000转／分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液(生理盐水)洗涤。再用离心机3000转／分钟离心5-10分钟，弃上清，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞泥，按0.7％的稀释度加入稀释液(0.7毫升红细胞泥加99.3毫升稀释液)。 ③被检血清：将被检鸡群编号登记，用消毒过的干燥注射器采血，注入洁净干燥试管内(微量法可用孔径2-3毫米塑料管由翅静脉采血)，在室温中静置或离心，待血清析出后使用。

免疫球蛋白的结构

第一节免疫球蛋白的结构（The Structure of Immunoglobulin) B淋巴细胞在抗原刺激下增殖分化为浆细胞，产生能与相应抗原发生特异性结合的免疫蛋白，这类免疫球蛋白被称为抗体（antibody, Ab）。 1937年，Tiselius用电泳方法将血清蛋白分为白蛋白、α1、α2、β及γ球蛋白等组分，其后又证明抗体的活性部分是在γ球蛋白部分。因此，相当长一段时间内，抗体又被称为γ球蛋白（丙种球蛋白）。实际上，抗体的活性除γ球蛋白外，还存在于α和β球蛋白处。1968年和1972年的两次国际会议上，将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统一命名为免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。 Ig是化学结构的概念，它包括正常的抗体球蛋白和一些未证实抗体活性的免疫球蛋白，如骨髓瘤病人血清中的M蛋白及尿中的本周氏（Bence Jones, BJ）蛋白等。免疫球蛋白可分为分泌型（secreted Ig,SIg）和膜型（membrane Ig, mIg）。前者主要存在于血清及其他体液或外分泌液中，具有抗体的各种功能；后者是B细胞表面的抗原识别受体。 ☆☆相关素材☆☆ 图片正常人血清电泳分离图一免疫球蛋白的基本结构 The basical structure of immunoglobulin 免疫球蛋白分子是由两条相同的重链（heavy chain，H链）和两条相同的轻链（light chain，L链）通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。 X射线晶体结构分析发现，IgG分子由3个相同大小的节段组成，位于上端的两个臂由易弯曲的铰链区（hinge region）连接到主干上形成一个"Y"形分子，称为Ig分子的单体，是构成免疫球蛋白分子的基本单位。

猪口蹄疫抗体检测卡说明书(完整版)

猪口蹄疫抗体快速检测试剂盒 ——（胶体金法）使用说明书【名称】通用名称：猪口蹄疫抗体快速检测试剂盒英文名称：Rapid Anti-FMDV Test 汉语拼音：Zhu KouTiYi Kangti Kuaisu Jiance Shiji He(Jiaoti Jin Fa) 【原理】猪口蹄疫抗体检测试剂盒（胶体金法），系采用国际最先进的胶体金免疫层析技术检测样本（全血、血清、血浆）中抗猪口蹄疫抗体的方法。整个试验只需20分钟，操作简便、快速、准确，灵敏度高、结果直观、容易判定。本试剂盒内还设计一张“金标试纸与正向间接血凝试验实物参照图”，用试纸检测线的颜色与实物参照图对照，便可粗略估计样品中抗体的滴度。【试剂盒组成】 1.猪口蹄疫抗体快速检测卡50头份 2.说明书1份 3.一次滴管50根【操作方法】 1．在检测卡的加样孔内加入2滴（100ul）待检血清或血液样品。 2．将检测卡平放于桌面上，在室温下静置5－20分钟内判定结果。超过20分钟的结果只能作为参考。阳性：在观察孔内，检测线区（T）及对照线区

（C）同时出现紫红色线。猪口蹄疫抗体滴度越高，检测线（T）颜色越深。弱阳性：在观察孔内，检测线区（T）及对照线区（C）同时出现紫红色线，但检测线区（T）出现的颜色很浅。阴性：在观察孔内，只有对照线区（C）出现一条紫红色线。失效：在观察孔内，对照线区（C）和检测线区（T）都不出现色线；或仅检测线区（T）出现色线。【诊断参考】 1. 如果该猪未接种过猪口蹄疫病毒疫苗: a)当被检样品检测线（T）处无明显色带出现，说明被检测样品中没有口蹄疫病毒抗体。如果猪群健康，应当及时进行猪口蹄疫病毒疫苗接种。 b)当被检样品检测线（T）处有明显色带出现，则该猪有可能为野毒感染，应进一步观察验证。 2. 如果该猪已接种过猪口蹄疫病毒疫苗: c)当被检样品检测线（T）条带的色泽≥对照卡中1：32效价时，说明口蹄疫病毒抗体的滴度较高，已达到抵御强毒攻击的保护水平。 d)当被检样品检测线（T）条带的色泽＜对照卡中1：32效价时，说明口蹄疫病毒抗体效价未达到抵御口蹄疫病毒强毒攻击的最低保护滴度，建议进行疫苗补种。【注意事项】铝箔袋打开后，检测卡应尽快使用；受潮后检测卡将失效。常温保存，保质期18个月。【特点】方便:肉眼判断、无需仪器、操作简单；快速:5－20分钟即可出结果，有利于疫情的快速鉴别和免疫水平监测；用途:适合于各级防检部门、猪场、兽医站广泛使用。

鸡新城疫抗体水平测定

2018年全国职业院校技能大赛拟设赛项规程一、赛项名称赛项编号：GZ-2018011 赛项名称：鸡新城疫抗体水平测定英语翻译：Detection of the Antibody against Chicken NewCastle Disease Virus 赛项组别：高职组赛项归属产业：农林牧渔二、竞赛目的本赛项由学校、行业、企业共设，通过技能竞赛，能有效促进全国高职院校畜牧兽医类专业之间的交流，引领专业建设与课程改革；能进一步深化学校与企业之间的合作交流，加大行业人才队伍建设力度，提升行业产业发展水平。同时，通过本赛项的资源转化，可以向社会展示畜牧兽医类专业的师生风采和建设成果，提高专业的教学水平，提升人才培养质量。三、竞赛内容本赛项为鸡新城疫抗体水平测定（微量法），测定方法按《新城疫诊断技术》（GB/T16550-2008）标准，竞赛时间为180分钟。具体步骤及其分值如下：（一）试验器材准备（占总成绩的8%）按照操作规程进行器材准备，要求器材选择正确、摆放有序，物品标识合理，桌面整洁等。

（二）配制1%鸡红细胞悬液（占总成绩的18%）按照操作规程进行采血、离心、洗涤、配制1%鸡红细胞悬液，要求采血规范、熟练、采血量适量、离心机使用规范、洗涤次数及洗涤时间适宜、配制过程规范、1%鸡红细胞量适宜等。（三）血凝试验（占总成绩的20%）按照操作规程，用微量移液器在96孔V型血凝反应板1-12孔滴加稀释液、新城疫标准抗原，充分混匀，倍比稀释后，再次滴加稀释液，再添加1%鸡红细胞悬液，充分振荡混匀，静置感作适当时间后，正确判定抗原的血凝效价。要求微量移液器使用规范、倍比稀释操作规范、结果判定正确等。（四）配制四单位病毒（占总成绩的10%）根据血凝试验结果，按照操作规程配制四单位病毒。要求稀释倍数计算正确，稀释液体积加入得当、四单位病毒配制量适宜等。（五）血凝抑制试验（占总成绩的20%）按照操作规程，对20个被检血清进行血凝抑制试验操作，并设新城疫标准阳性血清对照、阴性血清对照；正确读取标准阴性血清、标准阳性血清及被检血清的结果，确定抗体滴度，完成报告。要求移液器使用规范、反应板各孔的稀释正确、感作时间得当、对照成立、结果判断正确等。（六）抗体滴度报告（占总成绩的24%）按照操作规程，正确判定抗体滴度，完成报告。要求抗体滴度判读正确、报告方式正确、结果误差符合要求、场地整洁等。四、竞赛方式本赛项为团体赛。每组参赛学生2名，比赛由2名学生配合完成，

2014全国职业院校技能大赛鸡新城疫抗体水平测定解读

2014年全国职业院校技能大赛 “鸡新城疫抗体水平测定”赛项规程一、赛项名称赛项编号：G-057 赛项名称：鸡新城疫抗体水平测定英语翻译：Detection of the antibody titer against the Newcastle disease virus 赛项组别：高职组赛项归属产业：农业二、竞赛目的通过本项目竞赛，促进高职学生了解鸡新城疫抗体水平测定的内容，熟练掌握测定方法，提高检测水平，培养学生的团队合作能力，不断提升学生的职业能力；引领农业职业院校适应畜牧业行业现状及技术发展趋势，促进畜牧兽医专业建设与教学改革；推进学院与相关企业深度合作，更好地实现工学结合的人才培养模式，为畜牧兽医行业培养高素质技术技能型人才。三、竞赛内容与时间（一）竞赛内容竞赛项目为鸡新城疫抗体水平测定（微量法）。测定方法参考《新城疫诊断技术》（GB/T16550—2008）标准，具体分为6个部分。竞赛总时间为180分钟。 1.试验器材准备（占总成绩的6%）按照操作规程进行试验器材的准备，并进行标识，合理摆放。 2.配制1%鸡红细胞悬液（占总成绩的20%）按照操作规程进行采血、离心、洗涤、配制1%鸡红细胞悬液。 3.血凝（HA）试验（占总成绩的16%）按照操作规程，用微量移液器在96孔V型血凝反应板上滴加稀

释液、新城疫标准抗原，充分混匀后倍比稀释，添加1%鸡红细胞悬液，充分振荡和感作，正确判定抗原的血凝效价。 4.配制四单位病毒（占总成绩的15%）根据HA试验测定结果，按照操作规程配制四单位病毒。 5.血凝抑制（HI）试验（占总成绩的16%）按照操作规程，对10个被检血清进行血凝抑制试验操作，同时设新城疫标准阳性血清对照和阴性血清对照。 6.抗体滴度报告（占总成绩的27%）按照操作规程正确读数，填写完成报告单。（二）竞赛时间四、竞赛方式本赛项为团体赛。每组参赛学生2名，须为同校在籍学生。由各省、自治区、直辖市教育行政部门商农业行政部门，在本区域内设置畜牧兽医专业的涉农高职院校全日制在籍学生中（参赛选手年龄须不超过25周岁，即2014年7月1日前不满26周岁），经选拔组成1个代表队参加比赛，每队限报1名指导教师。本赛项本次竞赛不邀请

猪口蹄疫病毒O型抗体检测试剂盒

仅供科研使用，不得用于临床检验。猪口蹄疫病毒O型抗体定性检测试剂盒（ELISA）说明书【产品名称】通用名称：猪口蹄疫病毒O型抗体定性检测试剂盒（ELISA）英文名称：Test Kit for Antibodies to Porcine Foot and Mouth Disease Virus O ELISA KIT 【包装规格】 96人份/盒【预期用途】仅供科研使用，口蹄疫是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus，FMDV）引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，其特征为口腔黏膜、蹄部、乳房皮肤发生水泡和烂斑。本试剂用于检测猪血清中口蹄疫病毒O型抗体，可用于口蹄疫病毒O型疫苗免疫效果评价。【检验原理】本试剂盒系由预包被口蹄疫病毒O型VP1抗原的酶标板、酶标记物及其他配套试剂组成，应用酶联免疫法（ELISA）原理检测猪血清、血浆样本中猪口蹄疫病毒O型抗体。实验时在酶标板中加入对照血清和待检样本，经温育后若样品中含有猪口蹄疫病毒O型抗体，则将与酶标板上抗原结合，经洗涤除去未结合的其他成分后；再加入酶标记物，与酶标板上抗原抗体复合物发生特异性结合；再经洗涤除去未结合的酶标记物，在孔中加TMB底物液，与酶反应形成蓝色产物，显色深浅与样品中的特异性抗体含量成正相关；加入终止液终止反应后，产物变为黄色；用酶标仪在450nm波长测定各反应孔中的吸光值，即可知样品是否含有口蹄疫病毒O型抗体。

【主要组成成分】主要成分需要但未提供的材料及耗材 1、酶标仪 2、精密移液器及一次性吸头 3、蒸馏水 4、洗瓶或者自动洗板机 5、37℃水浴锅或恒温箱 6、500ml量筒 7、无粉一次性乳胶手套【储存条件及有效期】 1、2-8℃保存，切勿冷冻，有效期6个月。 2、开封使用后，包被微孔板放入带有干燥剂的自封袋中，密闭自封袋，并将全部试剂放回2-8℃冰箱。 3、开封后，按照建议的条件保存，校准品、包被微孔板和HRP标记抗体，有效期为14天，其他成分在标签标明的有效期内是稳定的。

2018年全国职业院校技能大赛鸡新城疫抗体水平测定项目申报书 (46)

附件： 2018年全国职业院校技能大赛赛项申报书赛项名称：鸡新城疫抗体水平测定赛项类别：常规赛项?行业特色赛项□ 赛项组别：中职组□高职组? 涉及的专业大类/类：方案设计专家组组长：手机号码：方案申报单位（盖章）：全国林业职业教育教学指导委员会方案申报负责人：方案申报单位联络人：联络人手机号码：电子邮箱：通讯地址：邮政编码：申报日期：2017年8月31日

2018年全国职业院校技能大赛赛项申报方案一、赛项名称（一）赛项名称鸡新城疫抗体水平测定。（二）压题彩照图1 新城疫抗体水平测定比赛现场（三）赛项归属产业类型农业（四）赛项归属专业大类 51农林牧渔大类二、赛项申报专家组本赛项主要由本科及高职院校畜牧兽医及相关专业教师，农业科学院畜牧兽医研究所和企业技术骨干组成竞赛项目设计团队。竞赛项目设计团队成员及相关信息如表1。

表1 赛项申报专家组名单三、赛项目的本赛项考核的核心技能是鸡的采血方法、1%鸡红细胞悬液配制、血凝试验操作、四单位病毒配制、血凝抑制试验操作、抗体滴度报告撰写等技能。本赛项考核的核心知识是《动物微生物》、《兽医临床诊疗技术》、《动物传染病》等专业课程理论知识。本赛项由学校、行业、企业共设，是高职畜牧兽医专业的核心技能，通过技能竞赛有效促进学校建设并完善实验、实训平台，加强核心技能的训练，提升高职畜牧兽医专业的人才培养质量。同时，通过竞赛方式也有效促进学校与企业之间的合作交流，推动高职畜牧兽医等专业教学改革和校企合作，共同培养畜牧兽医行业一线技能型人才。四、赛项设计原则（一）公开、公平、公正本赛项筹备与实施的各环节均按规定要求科学组织，公开进行报名、审查，提前公布技术文件、比赛样题，合理设计竞赛规则、程序、标准，公开执行过程，严格命题、裁判回避制度等措施，确保比赛公平。赛项设计源于职业岗位具体要求、又能够展现通用性技术与选手能力；比赛过程在公平和不干扰比赛选手的前提下向社会开放，并邀请广播、电视、网络等媒体宣传报道，提高赛项知名度，促进职业技能大赛健康发展。（二）关联职业岗位面广鸡新城疫抗体水平测定是兽医临床衡量养殖场免疫状况、预警免疫缺陷、制定有效防疫方案的重要方法之一，是畜牧兽医专

血清免疫球蛋白测定.docx

血清免疫球蛋白测定 B-淋巴细胞受抗原刺激后，引起一系列细胞形态与生化特性变化，转化为淋巴母细胞并增生繁殖，最后演化为浆细胞，合成免疫球蛋白。免疫球蛋白普遍存在于生物体的血液、体液、外分泌液及某些细胞（如淋巴细胞）的细胞膜上。免疫球蛋白是一组具有抗体特性的球蛋白，其分子量很大，含有1000个以上的氨基酸分子，均由其共同抗原的两个相同的轻链（L链）和具有特异性抗原的两个不同的重链（H链）组成。 1分类根据重链的氨基酸组成不同，免疫球蛋白可分为分五类：免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白D（IgD）和免疫球蛋白E（IgE）。 1.1IgG IgG是人体的主要免疫球蛋白，也是唯一能通达胎盘的免疫球蛋白。根据IgG的重链氨基酸顺序的差别，可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4各亚类。IgG是主要抗感染抗体，对各种细菌、病DU有抗体活性，并有激活补体的作用。 1.2IgA IgA是分泌液中主要抗体，可分为IgA1和IgA2两个亚类。存在于血清中的称血清型IgA，存在于泪液、乳汁、胃肠道、呼吸道和泌尿生殖道分泌液中的称分泌型IgA，对局部粘膜有抗菌和抗病DU作用。

1.3IgM IgM可分为IgM1和IgM2两个亚类。是抗原刺激最先产生的免疫球蛋白，有较强的固定补体、溶解细菌及细胞的能力。IgM是抗革兰氏阴性菌和异体红细胞的主要抗体，也是存在于B淋巴细胞表面的主要免疫球蛋白。 1.4IgD 其作用与过敏反应有关。据报道，IgD可对某些抗原起反应，如青霉素、胰岛素、核抗原、甲状腺抗原等。它存在于B淋巴细胞表面，构成早期的膜受体，具有识别抗原，制动B淋巴细胞的分化作用。 1.5IgE 与I型变态反应有关，具有亲细胞特性。IgE通过Fc段与肥大细胞、嗜碱粒细胞上的Fc受体结合，故属亲同种细胞性抗体。当机体再次接触同种抗原后，过敏原即与结合在细胞表面的IgE作用，使细胞释放介质，引起平滑肌痉挛，血管通透性增加等过敏反应，还具有抗寄生虫感染作用。 2正常参考值 IgG：8～16g/L，IgA：1～4g/L，IgM：0.5～1.9g/L，IgD：0.01～0.4g/L，IgE：0.001～0.009g/L。 3临床意义 3.1血清免疫球蛋白降低血清免疫球蛋白水平取决于免疫球蛋白合成和分解代谢的速率以及由体内丢失的程度。血清免疫球蛋白降低可由于合成不足，丢失

检测口蹄疫血清抗体的方法

检测口蹄疫血清抗体的方法（一）口蹄疫正向间接红细胞凝集试验（间接血凝试验）该试验是以口蹄疫O、A、C、Asia-1型病毒和猪水泡病病毒的细胞培养物（细胞毒）经PEG浓缩，蔗糖密度梯度超离后纯化的病毒抗原分别致敏戊二醛鞣酸处理的绵羊红细胞，而制成的血凝抗原，用于快速检测动物血清中的口蹄疫和猪水泡病特异抗体水平。该法简易、快速、特异、直观、是当前测抗的实用方法。 1．试验材料V型96孔110。医用血凝滴定板、玻璃板（与血凝板大小相同）、微量移液器（10~100微升）、塑料咀、微量振荡器、1毫升/5毫升刻度玻璃吸管、玻璃中试管（内径毫米，长度100毫米）、铝质试管架（40孔）、口蹄疫各型和猪水泡正向间接血凝诊断液、口蹄疫O、A、C、Asia-1型阳性血清、SVD阳性血清、阴性血清、稀释液。 2．试验方法根据试验目的可分为用于鉴别诊断；用于监测疫苗接种动物的抗体水平的检测方法。（1）疫苗接种动物抗体水平监测方法接种何种疫苗就使用何种正向血凝诊断液。 ①稀释待检血清在血凝板上1~8孔各加稀释液50微升，取待检血清50微升加入第1孔，混匀后从中取出50微升加入第2孔，混匀后从中取出50微升加入第3孔……直至第8孔混匀后从该孔取出50微升丢弃，保持每孔50微升的剂量。此时1~8孔的血清稀释度依次为1：2、1：4、1：8、1：16；1：32、1：64、1：128、1：256。 ②稀释阴性对照血清取中试管1支加稀释液毫升，再加阴性血清毫升，充分摇匀阴性血清的稀释度即为1：16。 ③稀释阳性对照血清取中试管5支，第1管加稀释液毫升，第2~5管分别加稀释液毫升，取阳性血清毫升加入第1管混匀后从中取出毫升，加入第2管混匀后从中取出毫升，加入第3管……直至第5管，此时各管阳性血清的稀释度低次为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512。 ④滴加对照孔取1：16稀释的阴性血清50微升加入血凝板的第10孔；取1：500稀释的阳性血清50微升加入第11孔；取稀释液50微升加入第12孔。 ⑤滴加正向血凝诊断液取正向血凝诊断液充分摇匀（瓶底应无血球沉淀），每孔各加25微升后立即置微量振荡器上振荡1分钟，取下血凝板放在白纸上观察每孔中的血球是否均匀（孔底应无血球沉淀）。如仍有部分孔底出现血球沉积，应继续振荡直至完全混匀为止。 ⑥静置将血凝板放在室温下（15~30℃）静置2h后判定检测结果，若结果不清晰或来不及判定，也可放置第2天判定。 ⑦判定标准先观察10~12孔（对照孔），第10孔为阴性血清对照，应无红细胞凝集现象，红细胞全部沉入孔底，形成小园点或仅有25%红细胞有凝集（“+”的凝集）；第11孔为阳性血清对照，应出现“++”以上的凝集（50%以上

免疫球蛋白IgA测定

免疫球蛋白IgA测定 1检验目的指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。 2原理免疫透射比浊法抗免疫球蛋白A抗体和样本中的抗原形成抗原抗体复合物，出现凝集，进行透射比浊检测。通过加入PEG可促使反应迅速达到终点，可增加灵敏度，降低样本中抗原过剩导致假阴性的风险。 3标本要求 3.1使用新鲜血清,不使用血浆. 3.2在采集血液后2h分离血清. 3.38h内不能及时测定血清可存放于2-80C冰箱保存,3天后测定的血清置-150C―-200C 冰冻保存,但冰冻血清只能复融一次. 3.4严重溶血或脂血的标本不能作测定.

4试剂 4.1 试剂：上海罗氏诊断产品有限公司IgA试剂盒,国械注进20142405056 YZB/GER 5724-2014） 4.1.1 试剂组成 R1:TRIS 缓冲液：20 mmol/l，pH 8.0；氯化钠：200 mmol/L；PEG：3.6%；防腐剂和稳定剂。 R2:抗人免疫球蛋白A抗体（羊）：取决于滴度；TRIS缓冲液：20 mmol/l；氯化钠：150 mmol/L；防腐剂。 4.1.2 试剂准备：试剂为即用式。 4.1.3 试剂稳定性与贮存：2-8°C下保存期限：见试剂标签上的有效期。机上稳定期：90天。 4.1.4变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染则试剂不能使用。 4.2 校准品：使用罗氏多项生化校准品提供的IgA校准品对自动分析仪进行校准。 4.3 质控品：使用正常值、病理值复合控制品。 5 仪器

AU2700生化分析仪，罗氏P800生化分析仪, 西门子ADVIA-2400生化分析仪，东芝TBA-120生化分析仪 6 操作步骤 6.1 样品的准备：将标好号的样品离心后放到仪器规定的位置。 6.2 试剂的检测：仪器开机后，检查各种试剂的位置，体积等确认无误后方可进行测定。 6.3 项目基本参数：参见生化检验AU2700生化分析仪，罗氏P800生化分析仪, 西门子ADVIA-2400生化分析仪，东芝TBA-120生化分析仪项目测定参数。 6.4仪器操作步骤：参见生化检验AU2700生化分析仪，罗氏P800生化分析仪, 西门子ADVIA-2400生化分析仪，东芝TBA-120生化分析仪操作规程。 7 质量控制在每一批标本中都应把非定值血清水平I与II质控做为未知标本进行分析，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控。

新城疫抗体水平检测精编版

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新城疫的血凝和血凝抑制试验高若开一、实验目的 1.掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操作方法和结果判定方法。 2.分析血凝和血凝抑制试验的影响因素，用以确定最佳免疫时间、判定免疫效果和辅助疾病诊断。二、实验内容 1.血凝试验(HA)检测新城疫抗原 2.血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体三、实验原理 1.血凝试验（HA ）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物的红细胞 2.血凝抑制试验（HI ）原理：当在病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI ）反应，也称血凝抑制反应。抗体病毒颗粒红细胞

四、实验材料离心机、恒温箱、冰箱、振荡器、96孔血凝版（5块）、微量移液器（20-100微升可调）、吸液尖（若干）、洗耳球、离心试管、普通试管、试管刷、烧杯、吸量管、一次性注射器、ND标准抗原、1%红细胞悬液、抗凝剂、生理盐水。五、实验步骤（一）抗凝剂的配制将1克柠檬酸钠用25毫升生理盐水稀释备用。1毫升抗凝剂可用于采集9毫升血液。（二）10%红细胞悬液的配制 1、用注射器吸取毫升抗凝剂无免疫健康青年公鸡的红细胞毫升。 2、1500转离心5分钟，吸弃上清液。 3、用5-10倍生理盐水1500转洗涤3次，前两次5分钟，后一次10分钟。 4、吸弃上清液，用吸量管吸取红细胞，配制成10%红细胞悬液。 5、2-6摄氏度储存，备用。（三）血凝试验（HA) 1.在血凝板上第一排的1－12孔内各加入50ul生理盐水 2.将系苗用生理盐水5毫升稀释，在第1孔内加入50ul病毒抗原，然后依次倍比稀释至第11孔，最后弃50ul。 3.每孔加入1％鸡红细胞悬液50ul 4.轻轻振荡均匀，后放于室温或37℃中静置30分钟 5.结果判定 1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集； 2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集； 3、＋＋：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集； 4、＋：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集； 5、－：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集。血凝价的判定