生化实验报告 实验

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实验一考马斯亮蓝G-250 染色法测定蛋白质的含量(p24)一、目的要求掌握考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质含量原理和方法。二、实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质─染料结合的原理,定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250 染料在酸性溶液中为棕红色,当它与蛋白质通过范德华键结合后,变为蓝色。在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰(lmax)的位置,由465nm变为595nm。且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律,通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。考马斯亮蓝染色法的突出优点是:(1)灵敏度高,据估计比Lowry 法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry 法要大的多。(2)测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5 分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2 分钟即可完成,其颜色可以在1 小时内保持稳定,且在5 分钟至20 分钟之间,颜色的稳

定性最好。因而完全不用像Lowry 法那样费时和严格地控制时间。(3)干扰物质少。如干扰Lowry 法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。此法的缺点是:(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。(2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。三、材料、试剂与器具(一)、试剂:1、考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G—250 100mg 溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H 3 PO 4 ,用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4.7% (W/V)乙醇,8.5%(W/V)H 3 PO 4 。2、标准蛋白质溶液:纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0.15mol/LNaCl 配制成100ug/ml 蛋白溶液。(二)标准和待测蛋白质溶液1.标准蛋白质溶液纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0.15mol/LNaCl 配制成100ug/ml 蛋白溶液。2.待测蛋白质溶液。人血清,使用前用0.15mol/L NaCl 稀释200 倍。(二)、器材:1、试管1.5×15cm(×6)和试管架。2、移液管管0.5mL(×2);

1mL(×2);5mL(×1);3、可见光分光光度计。(三)、标准曲线制作:2、以 A 595nm 为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(),在坐标轴上绘制标准曲线。1)利用标准曲线查出回归方程。2)用公式计算回归方程。一般相关系数应过0.999 以上,至少2 个9 以上。4)、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上的点应该在直线两侧。(四)、蛋白质含量的测定:样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1 操作,测出样品的A 595nm ,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。一般被测样品的 A 595nm 值在0.1—0. 5 之间,所以上述样品如果 A 595nm 值太大,可以稀释后再测A 595nm 值,然后再计算。(五)、注意事项:1、玻璃仪器要洗涤干净。2、取量要准确。3、玻璃仪器要干燥,避免温度变化。4、对照:用被测物质以外的物质作空白对照。5、在试剂加入后的5-20min 内测定光吸收,因为在这段时间内颜色是最稳定的。6、测定中,蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。实验二、紫外吸收法测定核酸的含量一、目的1、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。2、学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。二、原理核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统(-C=C 一C=C 一),

能够强烈吸收250~280nm 波长的紫外光。核酸(DNA,RNA)的最大紫外吸收值在260nm 处。遵照Lambert-Beer 定律,可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。试管编号0 1 2 3 4 5 未知200ug/ml 标准蛋白(ml)0.0

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.15mol/L NaCl (ml)2 1.8 1.6 1.4 1.2

1.0 考马斯亮蓝试剂(ml)6 6 6 6 6 6 摇匀,1h 内以1 号管为空白对照,在595nm处比色蛋白质浓度(ug/ml)0 5 10 15 20 25 A 595nm 在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同,紫外吸收光也随之表现出明显的差异,它们的摩尔消光系数也随之不同。所以,在测定核酸物质时均应在固定的pH 溶液中进行。核酸的摩尔消光系数(或吸收系数),通常以ε (ρ )来表示,即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm 波长处的消光值(即光密度,或称为光吸收)。核酸的摩尔消光系数不是一个常数,而是依赖于材料的前处理、溶液的pH 和离子强度发生变化。它们的经典数值(pH = 7.0)如下:DNA 的ε (ρ )= 6 000 ~8 000 RNA 的ε (ρ )= 7 000 ~10 000 小牛胸腺DNA 钠盐溶液(pH = 7.0)的ε (ρ )= 6 600,DNA 的含磷量为9.2%,含1μ g/mL DNA 钠盐的溶液光密度为0.020。RNA 溶液(pH = 7.0)的ε (ρ )= 7 700~7 800,RNA 的含磷量为9.5%,含1μ g /mL RNA 溶液的光密度为0.022~0.024。采用紫外分光光度法测定核酸含量时,通常规定:

在260nm 波长下,浓度为1μ g/mL 的DNA 溶液其光密度为0.020,而浓度为1μ g/mL 的RNA 溶液其光密度为

0.024。因此,测定未知浓度的DNA(RNA)溶液的光密度OD260nm,即可计算测出其中核酸的含量。该法简单、快速、灵敏度高,如核酸3μ g/mL 的含量即可测出。对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品,测定误差较小,若样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质,测定误差较大,应设法事先除去。由于降解或水解作用,核酸的光密度可以增高约40%,这就是众所周知的增色效应(hyperchromic effect)。在大分子的核酸中,氢键和π -键相互作用改变了碱基的共振行为。因此,核酸的光密度低于构成它的核苷酸的光密度,该现象称为减色效应(hypochromic effect)。蛋白质和核苷酸也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处,在260nm 处的吸收值仅为核酸的1∕10 或更低,因此对于含有微量蛋白质的核酸样品,测定误差较小。RNA 的260nm 与280nm 吸收的比值.在 2.0 以上;DNA 的260nm 与280nm 吸收的比值则在1.9 左右,当样品中蛋白质含量较高时,比值下降。若样品内混杂有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质,应设法事先除去。三、实验材料、主要仪器和试剂(一)试剂1.标准核酸溶液(酵母RNA 或小牛胸腺DNA,用0.01NaOH 溶液配制成500μ g/ml 溶液)2.待测核酸

样品(二)器具1、紫外分光光度计2、微量注射器(50μ L)3、移液管3.试剂(1)5%~6%氨水:用25%~30%氨水稀释5 倍。(2)钼酸铵-过氯酸试剂:取3.6mL70%过氯酸和0.25g 钼酸铵溶于96.4mL 蒸馏水中。四、操作步骤(一)核酸紫外吸收光谱的测定取100μ L 的RNA 溶液于试管中,加入5 mL 蒸馏水,摇匀,测定核酸溶液在220~290nm 波长范围的消光值,再用蒸馏水作空白调零。以该溶液在各波段的光吸收值(即A 值)为纵坐标,波长为横坐标,绘制核酸的吸收光谱。(二)核酸溶液含量的测定将上述测吸收光谱溶液的A 260 直接计算溶液的RNA 含量五、注意事项如果待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸,则在测定时需加钼酸铵——过氯酸沉淀剂,沉淀除去大分子核酸,测定上清液A 值作为对照。六、思考题1.采用紫外光吸收法测定样品的核酸含量,有何优点及缺点?2.若样品中含有核苷酸类杂质,应如何校正?参考答案1.用紫外光吸收法测定样品的核酸含量,具有简单、快速、灵敏度高的优点,并且待测核酸样品中含有的微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质,产生较小测定误差。但该法在测定样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质时,则会产生较大测定误差,需要设法事先除去。2.当样品中含有核苷酸类杂质时,需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂处理,沉淀除去大分子核酸,测定上清液260

nm 处光密度,以此作为对照;再从未加沉淀剂测得的样品液260nm 光密度中扣除。实验三植物体内过氧化氢酶活性的测定一、目的过氧化氢酶普遍存在于植物组织中,其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力均有关系,故常加以测定。通过实验可了解过氧化氢酶的作用,并掌握测定过氧化氢酶活性的原理和方法。二、原理过氧化氢酶把过氧化氢分解为水和氧,其活性大小,以一定时间内分解的过氧化氢量来表示,当酶与底物(H 2 O 2 )反应结束后,用碘量法测定未分解的H 2 O 2 量。以钼酸铵作催化剂,使H 2 O 2 与KI 反应,放出游离碘,然后用硫代硫酸钠滴定碘,其反应式为:H 2 O 2 + 2KI + H 2 SO 4 —→I 2 + K 2 SO 4 + 2H 2 O I 2 + 2Na 2 S 2 O 3 —→2NaI + Na 2 S 4 O 6 根据空白和测定二者硫代硫酸钠滴定用量之差,即可求出过氧化氢酶分解H 2 O 2 的量。三、材料、仪器设备及试剂 A 260 1. 材料:水稻叶、甘蔗叶及其他植物叶片。 2. 仪器设备:分析天平;恒温水浴;研钵;100ml 容量瓶;100ml 三角瓶;滴定管;滴定管架;移液管;移液管架;漏斗;洗耳球等。3. 试剂及配制 1.8mol·L -1 H 2 SO 4 10﹪(NH 4. ) 6 M O7 O 4 0.02 mol·L -1 Na 2 S 2 O 3 20﹪KI 1﹪淀粉液CaCO 3 粉石英砂0.018﹪H 2 O 2 溶液配制:吸取30﹪H 2 O 2 原液0.3ml 至50ml 容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀后再稀释10 倍。四、实验步骤 1. 过氧化氢酶

的提取选取甘蔗功能叶片,擦净去主脉剪成碎片,混匀后迅速称取1g 放入经冷冻过的研钵中,加少量CaCO 3 粉末及石英砂,并加入3~4ml 蒸馏水,在冰浴上研磨至匀浆,用蒸馏水将匀浆通过漏斗洗入100ml 容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,摇匀后过滤。然后再取滤液10ml 至100ml 容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀即为酶稀释液。 2. 酶活性测定 2.1 取100ml 容量瓶4 个,编号,向各瓶准确加入稀释后的酶液10ml,立即向3、4 号瓶中加入1.8mol·L -1 H 2 SO 4 5ml 以终止酶活性,作为空白测定。2.2 将各瓶放在20℃水浴中保温5~10min(若室温超过20℃则以室温为准)。保温后向各瓶准确加入0.018﹪H 2 O 2 5ml, 摇匀并记录酶促反应开始时间。 2.3 将各瓶放在20℃水浴中让酶与底物(H 2 O 2 )作用5min。时间到后迅速取出,立即在1、 2 号瓶中加入1.8mol·L -1 H 2 SO 4 5ml 以终止酶活性。2.4 向4 个瓶中各加入20﹪KI 1ml 和3 滴10﹪(NH 4. ) 6 M O7 O 4 ,摇匀,用0.02 mol·L -1 Na 2 S 2 O 3 滴定至淡黄色后再加入5 滴1﹪淀粉液作指示剂,再用0.02 mol·L -1 Na 2 S 2 O 3 滴定至蓝色刚消失为滴定终点,记录Na 2 S 2 O 3 用量。五、酶活性计算空白与样品两个重复滴定值取平均值按下公式计算出过氧化氢酶活性:被分解H 2 O 2 (mg)= 〔空白滴定值(ml)-样品滴定值(ml)〕× C × 17.17 被分解H 2 O 2 (mg)×酶液稀释

倍数过氧化氢酶活性(mgH 2 O 2 ·g -1 Fw·min -1 )= ————————————————————样品鲜重(g)×酶促反应时间(min)公式中:C -Na 2 S 2 O 3 量浓度

17.17 — 2 1 H 2 O 2 摩尔质量实验四种子粗脂肪的提取

一、实验目的脂肪广泛存在于油料植物种子和果实中,测定脂肪的含量,可以鉴别其品质的优劣,也是油料作物选种和种质资源调查的常规测定项目。二、实验原理在了解了实验目的之后,关于这个实验有以下几个问题需要大家思考: 1.种子成分很复杂,脂肪的提取如何进行? 2.什么是粗脂肪?(答:脂肪不溶于水,易溶于有机溶剂(如石油醚)。利用这一特性,选用有机溶剂直接浸提出样品中的脂肪进行测定。提取物中除脂肪之外,还有游离脂肪酸、石蜡、磷脂、固醇、色素、有机酸等物质,故浸提物称粗脂肪。)通过以上问题的思考,我们知道了脂肪的提取主要是利用其易溶于有机溶剂的特性。具体的实验操作粗脂肪的提取,一般采用索氏脂肪提取器。利用脂类物质溶于有机溶剂的特性。在索氏提取器中用有机溶剂(本实验用石油醚,沸程为30 ~60 ℃)对样品中的脂类物质进行提取。图索氏脂肪提取器 1. 浸提管 2. 通气管 3. 虹吸管 4. 小烧瓶 5. 冷凝管索氏提取器是由提取瓶、提取管、冷凝器三部分组成的,提取管两侧分别有虹吸管和连接管。各部分连接处要严密不能漏气。提取时,将待测样品包在脱脂滤

纸包内,放入提取管内。提取瓶内加入石油醚,加热提取瓶,石油醚气化,由连接管上升进入冷凝器,凝成液体滴入提取管内,浸提样品中的脂类物质。待提取管内石油醚液面达到一定高度,溶有粗脂肪的石油醚经虹吸管流入提取瓶。流入提取瓶内的石油醚继续被加热气化、上升、冷凝,滴入提取管内,如此循环往复,直到抽提完全为止。三、材料、仪器与试剂(一)实验材料大豆、花生、蓖麻、向日葵、芝麻等油料种子。(二)仪器设备索氏提取器(50 mL ),烧杯,干燥器,脱脂滤纸,镊子,分析天平,烘箱,恒温水浴,脱脂棉。(三)试剂石油醚(化学纯,沸程30 ~60 ℃)。四、实验操作1.将洗净、晾干的芝麻种籽放在80 ~100 ℃烘箱中烘4 小时。待冷却后,准确地称取2 ~4 g ,置于研钵中研磨细,将研碎的样品及擦净研钵的脱脂棉一并用脱脂滤纸包住用丝线扎好,勿让样品漏出。或用特制的滤纸斗装样品后,斗口用脱脂棉塞好。放入索氏提取器的提取管内,最后再用石油醚洗净研钵后倒入提取管内。 2. 洗净索氏提取瓶,在105 ℃烘箱内烘干至恒重,记录重量。将石油醚加到提取瓶内约为瓶容积的

1/2 ~2/3 。把提取器各部分连接后,接口处不能漏气。用70 ~80 ℃恒温水浴加热提取瓶,使抽提进行16 小时左右,直至抽提管内的石油醚用滤纸检验无油迹为止。此时表示提取完全。3. 提取完毕,取出滤纸包,再回馏一次,

洗涤提取管。再继续蒸馏,当提取管中的石油醚液面接近虹吸管口而未流入提取瓶时,倒出石油醚。若提取瓶中仍有石油醚,继续蒸馏,直至提取瓶中石油醚完全蒸完。取下提取瓶,洗净瓶的外壁,放入105 ℃烘箱中烘干至恒重,记录重量。五、注意事项 1.本法采用沸点低于60 ℃的有机溶剂,不能提取出样品中结合状态的脂类,故此法又称为游离脂类定量测定法。2.待测样品若是液体,应将一定体积的样品滴在脱脂滤纸上在60~80℃烘箱中烘干后放入提取管内。 3.本法使用有机溶剂石油醚(沸程30 ~

60 ℃)故加热时不能用明火。六、思考题1. 索氏提取法提取的为什么是粗脂肪? 2. 做好本实验应注意哪些事

项? 实验五血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳一、实验目的学习醋酸纤维薄膜电泳的操作技术,了解电泳技术的基本原理,测定人血清中各种蛋白质的相对含量。二、实验原理醋酸纤维薄膜电泳(CAME)是以醋酸纤维薄膜(CAM)作支持物的一种区带电泳技术。醋酸纤维素薄膜是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂(如:丙酮,氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等)后,涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构,渗透性强,对分子移动阻力小,厚度为。醋酸纤维素薄膜作为是电泳支持体有以下优点:①电泳后区带界限清晰;②通电时间较短(二十分钟至一小时);③它对各种

蛋白质(包括血清白蛋白,溶菌酶及核糖核酸酶)都几乎完全不吸附,因此无拖尾现象;④对染料也没有吸附,因此不结合的染料能完全洗掉,无样品处几乎完全无色。它的电渗作用虽高但很均一,不影响样品的分离效果,由于醋酸纤维素薄膜吸水量较低,因此必需在密闭的容器中进行电泳,并使用较低有电流避免蒸发。本实验以醋酸纤维素薄膜为电泳支持物,分离人血清蛋白。血清蛋白中含有清蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及行状不同(见下表),在电场中的迁移速度不同。分子量小、等电点低的,在相同碱性PH 缓冲体系中,带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。例如人血清蛋白在PH8.6 的缓冲体系中电泳,染色后可显示5 条区带。清蛋白泳动最快,其余依次是

球蛋白(如图1)。醋酸纤维薄膜电泳已经广泛用于血清蛋白,血红蛋白,球蛋白,脂蛋白,糖蛋白,甲胎蛋白,类固醇及同工酶等的分离分析中,尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低,但它具有简单,快速等优点。根据样品理化性质,从提高电泳速度和分辨力出发选择缓冲液的种类,pH 和离子强度。选择好的缓冲液最好是挥发性强,对显色或紫外光等观察区带没有影响,若样品含盐量较高时,宜采用含盐缓冲液。例如血清蛋白电泳可选用pH8.6 的巴比妥

缓冲液或硼酸缓冲液;氨基酸的分离则可选用pH7.2 的磷酸盐缓冲液等。电泳时先将滤膜剪成一定长度和宽度的纸条。在欲点样的位置用铅笔做上记号,点上样品,在一定的电压,电流下电泳一定时间,取下滤膜,进行染色。不同物质需采用不同的显色方法,如核苷酸等物质可在紫外分析灯下观察定位,但许多物质必须经染色剂显色。醋酸纤维素薄膜电泳染色后区带可剪下,溶于一定的溶剂中进行光密度测定。也可以浸于折射率为1.474 的油中或其他透明液中使之透明,然后直接用光密度计测定。它的缺点是厚度小,样品用量很小,不适于制备。将血清样品点样于醋纤膜上,在pH8.6 的缓冲液中电泳时,血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等电点不同而致表面净电荷量不等,加之分子大小和形状各异,因而电泳迁移率不同,彼此得以分离。电泳后,CAM 经染色和漂洗,可清晰呈现清蛋白、α 1 、α 2 、β 、γ —球蛋白5 条区带,比色即可计算出血清各蛋白组分的相对百分数。人血清中5 种蛋白质的等电点及分子量蛋白质名称等电点(pI)分子量清蛋白-球蛋白-球蛋白-球蛋白

4.88

5.06 5.12

6.85~~~300 000 90 000~150 000 156 000~300 000 三、材料、仪器与试剂(一)、材料:人血清(二)、仪器醋酸纤维薄膜(8X2mm);点样器;染色皿,漂洗器,镊子;玻璃板;

常压电泳仪;直流电源整流器;水平电泳槽;粗滤纸;直尺和铅笔(三)、药品巴比妥缓冲液(pH8.6 I=0.06);氨基黑10B 染色液;漂洗液;95%乙醇45ml、冰醋酸5ml;蒸馏水50ml;洗脱液0.4mol/LnaOH;透明液;无水乙醇:冰醋酸=7:3 四、操作步骤1、仪器与薄膜的准备(1)醋酸纤维薄膜的选择与润湿用镊子取一片薄膜,在距醋纤膜一端1.5cm用铅笔作好标记,然后将薄膜放进缓冲液中,小心放在盛有缓冲液的培养皿中。若漂浮在液面的薄膜在15~30 秒内迅速润湿,整条薄膜色泽深浅一致,则此薄膜均匀可以用于电泳;若薄膜润湿缓慢,色泽深浅不一或有条纹或斑点,则表示薄膜不均匀应弃去,以免影响电泳结果。浸泡于缓冲液中约30 分钟,当完全浸透后,用镊子轻轻取出,夹在两层滤纸内吸干,方可用于电泳。(2)电泳槽的准备(如下图)将电泳槽置于水平平台上,将缓冲液注入电泳槽中,两边的电极槽缓冲液的高度要在同一平面。根据电泳槽支架的宽度,裁剪尺寸合适的滤纸条。在电泳槽的两个膜支架上,各放2~4层滤纸条,使滤纸一端的长边与支架前沿对齐,另一端浸入电极缓冲液中。当滤纸条全部润湿后,用玻璃棒轻轻挤压膜支架上的滤纸以驱赶气泡,

使滤纸的一端紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维薄膜的桥梁,故称为滤纸桥。2、点样将点样器先在白瓷反应砖上的血清中沾一下,点样前应在滤纸上反复练

习,此步是实验的关键,掌握点样技术后再正式点样是获得清晰区带的电泳图谱的重要环节。薄膜浸泡于缓冲液中约30 分钟后,用镊子轻轻取出,夹在两层滤纸内吸干,平铺在玻璃板上(无光泽面朝上),再在膜条一端2~3 厘米处轻轻水平落下并随即提起,使血清完全深透至薄膜内,形成一定宽度、粗细均匀的直线。3、电泳用镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸上,点样面朝下,另一端平贴在阳极端支架上。若膜条与电泳方向不平行,则图谱不整。膜条与滤纸桥之间压严,使膜条绷直,中间不下垂。如有很多膜条同时电泳时,膜条间应相距1~3mm ,使之不互相接触,以免相互干扰。盖严电泳室,平衡10分钟后方可通电,否则分离不好。正确连接电泳槽与电泳仪对应的正负极,开启电源通电。电压160V,电流强度0.4—0.7mA/cm膜总宽。电泳时间约为25分钟。4、染色电泳完毕后断电,用镊子取出薄膜条投入染液5~10 分钟,染色过程中不时轻轻晃动染色皿,使染色充分。5、漂洗从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液,投入盛有漂洗液的培养皿中反复漂洗,直至背景漂净为止。此时清晰可见5 条色带,待干。6、透明将脱色后干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡2~3分钟后取出平铺在玻璃板上,用一直径0.5cm 的玻璃棒将其

间的气泡赶出,两者之间不能有气泡。干燥后此透明薄膜,区带着色清晰,可用于光吸收扫描,长期保存不褪色。7、定量

(1)洗脱比色法将各蛋白质区带仔细剪下,分置各试管中,另从空白背景剪块平均大小的膜条置于空白管中。各管加入0.4mol/lNaOH4ml,于37℃水浴20 分钟(不时振荡),待颜色脱净即用波长620nm比色,以空白管调零,读各管吸光度。计算:吸光度总和(T)= A 清

吸光度) 血清蛋白组分的相对百分数:正常值清蛋白% = A 清/T×100% 54%~73%α 1 球蛋白%%~5.1% α 2 球蛋白%= 2 A

%~10.6% β 球蛋白% = A

~11% γ 球蛋白% = A

~20% (2)光吸收扫描法将染色干燥的血清蛋白醋纤维素薄膜电泳图谱放入自动光吸收扫

描仪(或色谱扫描仪)内,未透明的薄膜通过反射,透明的薄膜通过透射方式进行扫描。在记录仪上自动绘出各组分的曲线图:横坐标为膜的长度,纵坐标为光吸收值;每个峰代表一种蛋白组分,下图为扫描模式图。同时可进行数据处理,以打字的方式显示各组分的相对百分含量。目前,临床检验多采用此法从处理数据。

生物化学实验报告 2011

孝感学院生命科学技术学院实验报告 专业:学号:姓名:分数:实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的与要求 掌握还原糖和总糖测定的基本原理,学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。 二、实验原理 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,如乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同,可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来,对没有还原性的双糖和多糖,可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定,再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计,在540 nm波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子水,所以在计算多糖含量时应乘以0.9。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1.实验材料小麦面粉(1000 g) 2.主要仪器 (1)具塞玻璃刻度试管:20 mL×11 (2)滤纸(3)烧杯:100 mL×2 (4)三角瓶:100 mL×1 (5)容量瓶:100 mL×3 (6)刻度吸管:1mL×1;2 mL×2; 10 mL×1 (7)恒温水浴锅(8)煤气炉(9)漏斗(10)天平(11)分光光度计 3.试剂 (1)1mg/mL葡萄糖标准液 准确称取80 ℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100 mg,置于小烧杯中,加少量蒸馏水溶解后,转移到100 mL容量瓶中,用蒸馏水定容至100 mL,混匀,4℃冰箱中保存备用。 (2)3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂 3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂:称取6.5 g DNS溶于少量热蒸馏水中,溶解后移入1000 mL 容量瓶中,加入2 mol/L氢氧化钠溶液325 mL,再加入45 g丙三醇,摇匀,冷却后定容至1000 mL。 (3)碘-碘化钾溶液:称取5 g碘和10 g碘化钾,溶于100 mL蒸馏水中。 (4)酚酞指示剂:称取0.1 g酚酞,溶于250 mL 70%乙醇中。 (5)6 M HCl和6 M NaOH各100 mL。(分别取59.19 mL 37 %浓盐酸和24克NaOH定容至100mL) 四、操作步骤 1. 制作葡萄糖标准曲线 批阅教师:年月日

生物化学实验报告册

生物化学实验报告册 1.实验前应认真预习实验指导,明确实验目的和要求,写出预实验报告。 2.进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律,不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3.严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题,切勿盲目处理,应及时请教指导老师。 4.严格按操作规程使用仪器,凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用,对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法,才能开始使用;仪器发生故障,应立即关闭电源并报告老师,不得擅自拆修。 5.取用试剂时必须“随开随盖”,“盖随瓶走”,即用毕立即盖好放回原处,切忌“张冠李戴”,避免污染。 6.爱护公物,节约水、电、试剂,遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7.注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时,管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8.废纸及其它固体废物严禁倒入水槽,应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱,必须事先用水稀释,方可倒入

水槽内,并放水冲走。 9.以实事求是的科学态度如实记录实验结果,仔细分析,做出客观结论。 实验失败,须认真查找原因,而不能任意涂改实验结果。实验完毕,认真书写实验报告,按时上交。 10.实验完毕,个人应将试剂、仪器器材摆放整齐,用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好,方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理,保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等,并严格执行值日生登记制度。 实验报告通过分析总结实验的结果和问题,加深对有关理论和技术的理解与掌握,提高分析、综合、概括问题的能力,同时也是学习撰写研究论文的过程。 1.实验报告应该在专用的生化实验报告本上、按上述格式要求书写。 2.实验报告的前三部分①实验原理、②实验材料、③实验步骤要求在实验课前预习后撰写,作为实验预习报告的内容。预习时也要考虑并设计好相应实验记录的表格。 3.每项内容的基本要求 实验原理:简明扼要地写出实验的原理,涉及化学反应时用化学反应方程式表示。 实验材料:应包括各种来源的生物样品及试剂和主要仪

(完整word版)生物化学实验知识点整理,推荐文档

生物化学实验知识点整理 实验一 还原糖的测定、实验二 粮食中总糖含量的测定 1.还原糖测定的原理 3,5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原成棕色的氨基化合物,在550nm 处测定光的吸收增加量,得出该溶液的浓度,从而计算得到还原糖的含量 2.总糖测定原理 多糖为非还原糖,可用酸将多糖和寡糖水解成具有还原性的单糖,在利用还原糖的性质进行测定,这样就可以分别求出总糖和还原糖的含量 3.电子天平使用 4.冷凝回流的作用: 使HCl 冷凝回流至锥形瓶中,防止HCl 挥发,从而降低HCl 的浓度。 5.多糖水解方法: 加酸进行水解 6.怎样检验淀粉都已经水解: 加入1-2滴碘液,如果立即变蓝则说明没有完全水解,反之,则说明已经完全水解。 7.各支试管中溶液的浓度计算 8.NaOH 用量:HCl NaOH n n = 9.不能中途换分光光度计,因为不同的分光光度计的光源发光强度不同 10.分光光度计的原理:在通常情况下,原子处于基态,当通过基态原子的某辐射线所具有的能量(或频率)恰好符合该原子从基态跃迁到激发态所需的能量(或频率)时,该基态原子就会从入射辐射中吸收能量,产生原子吸收光谱。原子的能级是量子化的,所以原子对不同频率辐射的吸收也是有选择的。这种选择吸收的定量关系服从式/E h hc νλ?==。 实验证明,在一定浓度范围内,物质的吸光度A 与吸光样品的浓度c 及厚度L 的乘积成正比,这就是光的吸收定律,也称为郎伯-比尔定律 分光光度计就是以郎伯比尔定律为原理,来测定浓度 11.为什么要水解多糖才能用DNS 因为DNS 只能与还原糖溶液在加热的条件下反应生成棕红色的氨基化合物,不能与没有还原性的多糖反应。 12.为什么要乘以0.9 以0.9才能得到多糖的含量。 13.为什么要中和后再测? 因为DNS 要在中性或微碱性的环境下与葡萄糖反应 实验三 蛋白质的水解和纸色谱法分离氨基酸、实验四 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 1.纸色谱分离氨基酸分离原理 由于各氨基酸在固定相(水)和流动相(有机溶剂)中的分配系数不同,从而移动速度不同,经过一段时间后,不同的氨基酸将存在于不同的部位,达到分离的目的。 2.天然氨基酸为L 型 3.酸式水解的优点是:是保持氨基酸的旋光性不变,原来是L 型,水解后还是L 型,由于甘氨酸所有的R 基团是氢原子,所以它不是L 型

生物化学实验报告

一、实验目的: 1、熟悉工作曲线的制作方法及注意事项; 2、掌握3, 5-二硝基水杨酸(DNS)比色定糖的原理和方法; 3、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法; 4、掌握酶蛋白分离提纯的原理; 5、掌握酶的比活力测定及其计算方法; 6、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法; 7、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件。 称量技术: 1、了解电子天平的用途 2、了解电子天平的工作原理 3、掌握电子天平的使用方法 4、掌握电子天平使用前后的注意事项 离心技术: 1、了解离心机的基本原理和用途 2、了解离心机的类型和用途 3、了解离心机的型号和控制版面 4、掌握离心机的使用方法 5、掌握离心机使用的注意事项 层析技术: 1、了解层析技术的基本原理 2、了解层析技术的分类情况 3、了解各种层析技术的原理 4、掌握凝胶层析技术 光谱分析技术: 1、学习掌握紫外可见、荧光、红外光谱分析技术原理 2、了解仪器结构和分类 3、熟练掌握常用仪器的使用方法和注意事项 电泳技术: 1、了解电泳的基本原理 2、了解电泳的类型

3、学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理 4、掌握垂直板电泳的操作技术 5、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作技术 6、了解转移电泳的基本原理和操作方法 7、了解双向电泳的基本原理和操作方法 二、实验原理: 1、蔗糖酶的提取: ①酵母菌的基本特征: 单细胞,椭圆形、圆形或柱形。长5-30μm,宽1-5μm。 ②生物材料破碎方法: (1)机械(匀浆)法 ①研钵 ②玻璃或Teflon研棒匀浆器(50mL)Teflon:聚四氟乙烯 先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎,此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高,适用于少量组织和脏器。 ③高速组织捣碎机(0.5-1L) 将材料配成稀糊状液,放置于筒内约1/3 体积,盖紧筒盖,将调速器先拨至最慢处,开动开关后,逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 ④高压匀质机(XL) 高压下的细胞通过阀门流出时,细胞内外压力同时降低,但由于细胞膜的作用,胞外压力瞬间降至常压,而胞内压力相比之下降低较慢,从而在细胞内外形成压力差,使细胞膜破裂。 优点:快速,产热小,对蛋白损伤小,破碎效率高。一次破碎效率可达90%以上 (2)超声波处理法 用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,此法多适用于微生物材料,常在30 至60Hz 频率下处理10-15 分钟,此法的缺点是在处理过程会产生大量的热,应采取相应降温措施。(3)反复冻融法 将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内的水形成冰粒而剩余的细胞液中盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。设备简单、效率不高,时间长,注意蛋白酶! (4)化学处理法 有些动物细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。

生化实验报告模版

生物化学实验报告 姓名:郭玥 学号: 3120100021 专业年级: 2012级护理本科 组别:第8实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心

【实验报告第一部分(预习报告内容):①实验原理、②实验材料(包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材)、③实验步骤(包括实验流程、操作步骤和注意事项);评分(满分30分):XX】 实验目的:1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 实验原理:1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别, 可分离纯化各种蛋白质。 3、盐析法:盐析法是在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度或达饱和状态,可 使蛋白质在水中溶解度降低,从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后,由 于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质,致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃 至消失。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变,蛋白质表面的电荷 大量被中和,更加导致蛋白质溶解度降低,蛋白质分子之间聚集而沉淀。

4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆 的交换,利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 5、醋酸纤维素薄膜电泳原理:血清中各种蛋白质的等电点不同,一般都低于pH7.4。 它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷,在电场中向正极移动。由于血清中 各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同,因而在醋酸纤维素薄膜上电 泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白(Albumin)、α1-球蛋白、α 2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 实验材料:人混合血清葡聚糖凝胶(G-25)层析柱 DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液 醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸 1%BaCl 溶液氨基黑染色液 2 漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液 电泳仪、电泳槽 实验流程:盐析(粗分离)→葡聚糖凝胶层析(脱盐)→DEAE纤维素离子交换层析(纯化)→醋酸纤维素薄膜电泳(纯度鉴定) 实验步骤: (一)盐析+凝胶柱层析除盐:

生化实验操作考核要点(新)

【实验操作考核要点】 一、目的要求 1.掌握组织样品的制备方法,了解其注意事项。 2.了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项,掌握其操作方法。 3.正确操作使用刻度吸管和可调微量移液器。 4.熟练运用溶液混匀的各种方法(视具体情况,采用合适的混匀方法)。 5.正确掌握溶液转移的操作。 6.正确操作使用分光光度计。 二、操作考核内容 按百分制计。 1.吸量管操作(20分); 2.可调式微量移液器操作(20分); 3.溶液混匀操作(视具体情况,采用合适的混匀方法)(15分); 4.溶液转移操作(10分); 5.分光光度计比色操作(25分)。 6.整体表现(10分)。 三、操作考核标准 (一)吸量管操作(20分,每项操作5分) 1.执管 要求右手拿吸量管,左手拿橡皮球,只能用食指而不能用拇指按压吸量管上口来调节吸取液量的刻度;吸液、排液整个操作过程吸量管应始终保持垂直。 2.坐姿 要求腰、背保持竖直,看刻度时眼睛保持平视。 3.吸取溶液 吸量管插入液面深度约0.5cm,不能一插到底,也不能插入过浅而吸进空气致使溶液进入橡皮球内;调控吸量管吸取液量的刻度时,吸量管尖应离开液面靠在容器内壁上。 4.排出液体

吸量管尖应靠上受纳容器内壁,让管内溶液自然流出。不能用橡皮球吹压,而且在流净后吸量管尖停靠受纳容器内壁至少3秒。 (二)可调式微量移液器操作(20分,每项操作5分) 1.设定容量值 转动加样器的调节旋钮,反时针方向转动旋钮,可提高设定取液量。顺时针方向转动旋钮,可降低设定取液量。在调整设定移液量的旋钮时,不要用力过猛,并应注意使取液器显示的数值不超过其可调范围。 2.吸液 (1)选择合适的吸头安放在取液套筒上,稍加扭转压紧吸嘴使之与套筒之间无空气间隙; (2)把按钮压至第一停点,垂直握持加样器,使吸头浸入液面下2~3毫米处,然后缓慢平稳地松开按钮,吸入液体,等一秒钟,然后将吸头提离液面,贴壁停留2-3秒,使管尖外侧的液滴滑落。 3.放液 (1)将吸头口贴到容器内壁底部并保持100°~40°倾斜; (2)平稳地把按钮压到第一停点,等一秒钟后再把按钮压到第二停点以排出剩余液体; (3)压住按钮,同时提起加样器,使吸头贴容器壁擦过,再松开按钮。按吸头弹射器除去吸头。 4.压放按钮时保持平稳;加样器不得倒转;吸头中有液体时不可将加样器平放。取液器吸嘴为一次性使用。实验完毕,将取液器读数调至最大量程值,竖立放于支架上。 (三)溶液的混匀(操作流程中下划实线的三处,每项操作5分,共15分)1.肝糖原的提取与鉴定操作中,肝匀浆上清液中加5ml 95%乙醇后的混匀最好用倾倒混匀,也可用滴管或吸量管吸、吹混匀,或用玻璃棒搅拌混匀。 2.肝糖原定量测定中,肝组织消化液沸水浴后全部转入100 ml容量瓶,加水至刻线后的混匀应采用倒转混匀。 3.肝糖原定量测定中,加蒽酮溶液后的混匀,可将试管倾斜约45o再作旋转混匀。因蒽酮溶液(浓硫酸配制)比重大于样品水溶液很多,一加入便沉于管

高级生物化学与分子生物学综合实验报告优选资料p

5. 按表1中给出的浓缩胶配置方法制备浓缩胶。注意一旦加入TEMED,马上开始聚合,故应快速操作。 6. 在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净梳子。 7. 在等待浓缩胶聚合时,可对样品进行处理,在样品中按1:1体积比加入样品处理液,在100℃加热5min以使蛋白质变性。 8. 浓缩胶聚合完全后(30-60 min),小心移出梳子。将凝胶固定于电泳装置上,上下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。 二、上样电泳 1. 按预定顺序加样,加样量通常为10~25μL。 电泳检测样品至少包括:蛋白Marker、上样液(原液)、上样后的穿透液、10mM 咪唑冲洗液、50mM咪唑冲洗液、100mM咪唑冲洗液、250mM咪唑冲洗液。 2. 将电泳装置与电源相接,凝胶上所加电压为8V/ cm。当染料前沿进入分离胶后,把电压提高到15 V/ cm,继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm,然后关闭电源。 3. 从电泳装置上卸下玻璃板,用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。 三、用考马斯亮蓝对SDS聚丙稀酰胺凝胶进行染色和脱色 染色时间:现温度下不少于2h。 脱色需3~10小时,期间应多次更换脱色液直至背景清楚。为了永久性记录,应尽快对凝胶进行拍照。 四、实验结果与讨论 1、质粒的提取、酶切电泳图谱 1 2 M 图1-1 第四组电泳图谱图1-2 第三组电泳图谱 1:酶切后的质粒2:质粒M :Marker 1、2:质粒4、5:酶切后质粒 观察结果:通过对比第三组和第四组电泳图谱,可以发现酶切后的质粒条带在原质粒条带的前面,并且质粒泳道条带比较多;电泳条带模糊,呈凹凸形状,拖尾现象比较严重,不能很明显地观察结果。 原因分析:

生物化学实验报告:蛋白质分子量的测定——凝胶层析法

生物化学实验报告:蛋白质分子量的测定— —凝胶层析法 实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法 一、实验目的 1.掌握凝胶层析的基本原理。 2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。二、实验原理 凝胶层析法也称分子筛层析法,是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时,其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质,每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致,像筛子,小的分子可以进入凝胶网孔,而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时,这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动,流程短,移动速率快,先被洗出层析柱;而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部,然后再扩散出来,故流程长,移动速度慢,最后被洗出层析柱,从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗

入凝胶的物质,则居二者之间从柱中流出。总之,各种不同相对分子质量的蛋白质分子,最终于它们被排阻和扩散的程度不同,在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同,从而彼此可以分离开来。 将凝胶装在柱后,柱床体积称为“总体积”,以Vt表示。实质上Vt是Vo,Vi与Vg三部分组成,Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”,即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积,相应于一般层析法中柱内流动相的体积;Vi为内体积,即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体积与Vo与Vi之间的关系可用下式表示:Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积,自加入样品时算起,到组分最大浓度出现时所流出的体积;Kd为样品组分在二相间的分配系数,也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关,而与柱的长度粗细无关,也就是说它对每一物质为常数,与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得,上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi 上式中Ve为实际测得的洗脱体积;Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液通过实际测量求得;Vi可g×Wr求得。因此,对一层析柱胶床来说,只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积就可算出它的Kd值。

生化大实验实验报告

生化大实验 实验报告 姓名: 学号: 专业: 班级: 实验班级: 单位: 指导老师:

实验1 多酚氧化酶(PPO)的分离提取 一、实验原理: 多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌,它是植物组织广泛存在的一种含铜氧化酶,位于质体、微体,可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节,属于末端氧化酶的一种。 植物受到机械损伤和病菌侵染后,PPO催化酚与O2氧化形成为醌,使组织形成褐变,以便损伤恢复,防止或减少感染,提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用,所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。另外,多酚氧化酶也可以与细胞其他底物氧化相偶联,起到末端氧化酶的作用。 蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同,通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出,且大分子蛋白质不能通过透析膜。 二、实验目的: 通过本项实验,学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法,掌握相关的仪器设备的正确使用的方法,以及蛋白质的提取分离的系统技术。 三、材料与试剂: 1.材料:马铃薯(两小组共称200g) 2.试剂:0.03M磷酸缓冲液pH 6.0(含0.02M巯基乙醇,0.001M EDTA,5%甘油,1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制是配x10倍的浓缩液1000ml;固体硫酸铵; 0.03M磷酸缓冲液pH 6.0(含0.02M巯基乙醇,0.001M EDTA,0.005M MgCl2) 3.设备:试管与试管架;烧杯、玻璃棒;移液管、滴管等;试剂瓶;透析袋;过滤纱布;植物组织匀浆机;pH计和pH试纸;高速冷冻离心机; 四、操作步骤: 1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块,加入300ml缓冲液A,两者按1:1(W/V)比例匀浆1min; 2.用两层纱布将所得的浆液过滤; 3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min; 4.上清液两组平分,每组150ml,加36.45g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min; 5.取上清液定容至150ml,加入30.75g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min,倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml 0.03M磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min; 6.将所得溶液倒入透析袋中,用0.02M的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。 五、结果和分析: 实验所得的初酶液颜色为浅黄色,颜色浅,主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少,从而最大程度的保留了PPO的活性;经过一个夜晚的透析,得到了澄清的略带黄色的液体,这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。 六、讨论与结论: 1. 本实验在匀浆阶段应尽量快速,防止酚类充分暴露在空气中被氧化; 2.实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净;

生物化学实验重点试题

一、解词 1、总氮量水中各种形态无机和有机氮的总量 2、酶的抑制作用是指在某个酶促反应系统中,某种低相对分子质量的物质加入后,导致酶活力降低的过程。 3、酶的最适温度酶催化活性最高时的温度 4、蛋白质的等电点每个蛋白都存在一个pH使它的表面净电荷为零即等电点 5、盐析增加中性盐浓度使蛋白质、气体、未带电分子溶解度降低的现象 6、蛋白质变性蛋白质在某些物理和化学因素作用下其特定的空间构象被改变,从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失6、酶的专一性酶对底物及其催化反应的严格选择性通常酶只能催化一种化学反应或一类相似的反应 7、激活剂能提高酶活性的物质大部分是离子或简单的有机化合物 8、抑制剂凡能使酶催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质 9、酶催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体 二、填空 1、球蛋白可在半饱和中性硫酸铵溶液中析出,清蛋白可在高盐浓度溶液中析出。 2、在PH3.0、和9.5时的电场中,卵清蛋白(PI4.6)移动方向分别为负移 动,正移动。 3、唾液淀粉酶的最适温度是37 4、还原糖与本乃狄试剂共热现象生成生成砖红色沉淀。 5、维生素C也称抗坏血酸,它具有很强还原性 6、用苔黑酚浓盐酸溶液可以鉴定核糖核酸 7、当溶液的PH低于蛋白质等电点时,蛋白质分子带正电荷;当溶液的 PH大于蛋白质等电点时,蛋白质分子带负电荷; 10.凯氏定氮法测定蛋白质含量消化终点颜色为清澈的蓝紫色色。 11.蛋白质变性的实质是空间结构被破坏。 12.常用的RNA提取方法有苯酚法、、高盐法等。 13、维持蛋白质亲水胶体稳定的因素是蛋白质颗粒表面的电荷层 和水化膜、 14、蛋白质在等电点时,主要以两性离子离子形式存在;当溶液的P H>PI 时,蛋白质分子以负离子形式存在;当溶液的P H<PI时,蛋白质分子带正离子形式存在。 15、蛋白质分子中氮的平均含量为 5.16% ,样品中的蛋白质含量常以测 氮量乘以 6.25 、即 6 。 三、选择 1、盐析法沉淀蛋白质的原理( ) A 与蛋白质结合成不溶性蛋白盐 B 次级键断裂蛋白质的构象改变 C 中和电荷,破坏水化膜 D 调节蛋白质溶液的等电点 2、以下哪项不是酶的特性() A 酶是生物催化剂,催化效率极高 B 易受Ph,温度等外界因素的影响 C 能加速化学反应但不改变反应平衡点 D 有高度特异性 3、RNA和DNA的最大紫外吸收值是在() A 280nm B 260nm C 510nm D 620nm 4、.凯氏定氮法使用的混合催化剂硫酸钾-硫酸铜配比为() A 1:3 B 5:1 C 3:1 D 1:1

生物化学实验报告

实验一糖类的性质实验 (一)糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 (一)α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸(硫酸、盐酸)作用下,脱水生成糠醛及糠醛衍生物,后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性,故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架,滴管 3、试剂 莫氏试剂:5%α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g,溶于95%酒精中,总体积达100 mL,贮于棕色瓶内。用前配制。 1%葡萄糖溶液100 mL 1%果糖溶液100 mL 1%蔗糖溶液100 mL 1%淀粉溶液100 mL %糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管,分别加入1%葡萄糖溶液、1%果糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液、%糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂,充分混合。倾斜试管,小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL,慢慢立起试管,切勿摇动。 观察记录各管颜色。 (二)间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下,酮醣脱水生成羟甲基糠醛,后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢,只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时,才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架,滴管 3、试剂 塞氏试剂:%间苯二酚-盐酸溶液1000 mL,称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中,再用蒸馏水稀至1000 mL。 1%葡萄糖溶液100 mL 1%果糖溶液100 mL 1%蔗糖溶液100 mL 4、实验操作

生物化学实验练习题及参考答案[1]

生物化学实验 一、名词解释: 分配层析法电泳同工酶酶活性分光光度法层析技术比活力 二、填空题: 1. 测定蛋白质含量的方法有,,和。 2. CAT能把H2O2分解为H2O和O2,其活性大小以来表示,当CAT与H2O2反应结束,再用测定未分解的H2O2。 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以作为载体的一种区带电泳,这种凝胶是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成。化学聚合法一般用来制备_____________胶,其自由基的引发剂是,催化剂是______________;光聚合法适于制备大孔径的_________________胶,催化剂是______________。 4.层析技术按分离过程所主要依据的物理化学性质进行分类,可分成以下几种:_______________,_______________,_______________,_______________和________________。 5. 使用离心机离心样品前,必须使离心管__________且对称放入离心机。 6. 米氏常数可近似表示酶和底物亲合力,Km愈小,表示E对S的亲合力愈,Km愈大,表示E对S 的亲合力愈。 7. 分光光度计在使用之前必须预热,注意预热及样品槽空时必须_________(打开、合上)样品池翻盖。 8. CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一,其活性高低与植物的密切相关。 9. 纸层析实验中,____________形成固定相,____________流动相。 10. 聚丙烯酰胺凝胶是是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成的,在具有自由基团体系时,两者就聚合。引发产生自由基的方法有两种:和。11. 层析技术按按固定相的使用形式进行分类,可分成以下几种:_______________,_______________,_______________和________________。 三、问答题: 1、简述4种测定蛋白质含量的方法及其原理。 2、简述不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个不连续及三种物理效应。 3、试分析影响电泳的主要因素有哪些? 参考答案: 生物化学实验 一、名词解释: 1、电泳:指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。 2、同工酶:指催化同一种化学反应,但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。 3、分配层析法:用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同,而达到分离目的的一种实验方法。

浙江大学生物化学丙实验报告1

实验报告 课程名称: 生物化学实验(丙) 指导老师: 方祥年 成绩:__________________ 实验名称: 蔗糖酶的提取 同组学生姓名: 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求(必填) 二、实验内容和原理(必填) 三、实验材料与试剂(必填) 四、实验器材与仪器(必填) 五、操作方法和实验步骤(必填) 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析(必填) 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法; 2、巩固理论知识,学会学以致用并发现新问题。 二、实验内容和原理 1、实验内容: 蔗糖酶的提取、分离纯化 2、实验原理: ①酵母细胞破碎 细胞破碎的常用方法 液体剪切法固体剪切法压力和研磨 物理法、化学渗透法、酶溶 本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法(研磨)将酵母细胞破碎,把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。 ②蔗糖酶的初步分离纯化 蛋白酶常用的初步分离纯化方法有:盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。 本实验采用选择性变性(加热)、有机溶剂(乙醇)沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯以及收集样品。 由于一般酶蛋白在常温下分离纯化过程中易变性失活,为了能获得尽可能高的产率和纯度,在提纯 操作中要始终保持酶的活性,如在低温下操作等,这样才能得到较好地分离提纯效果。 三、实验材料与试剂

1、实验材料 市售干酵母粉10g/组(3~4人) 2、实验试剂 石英砂,95%乙醇(-20℃),20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。 四、实验器材与仪器 电子天平(称量干酵母粉);研砵(每组一套);50ml高速离心管(4支/组、4孔50ml离心管架一个/组);托盘天平(离心管平衡用);高速冷冻离心机;恒温水浴箱(50℃);量筒(50ml)、微量移液枪(1000ul)及枪头或移液管(1ml)、玻棒、滴管等;1.5ml离心管(留样品Ⅰ、Ⅱ用)及离心管架;制冰机;-20℃冰箱。 五、操作方法和实验步骤 1、酵母细胞破粹(干磨法) ①称量:称取市售干酵母粉10g+约3-5 g石英砂放入研钵 ②研磨(干磨):至尽可能成细粉末状(约15min) ③加液+研磨:量取总体积40 ml的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液,分2次加研磨10min, 使呈糊状液体; ④离心:将糊状液体转移到2支50ml离心管中,两支离心管平衡后(托盘天平上),离心10min (条件:4℃、12000r/min) ⑤收集+测量:收集上清液并量出体积V1(样品I),另留1ml上清液(样品I )放置-20℃冰箱保存用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析 2、热处理 ①水浴热处理:将上步抽提液(样品I),迅速放入50℃恒温水浴,保温30min, 并每隔5min用玻璃棒温和搅拌提取液。 ②冰浴冷却:保温后迅速用冰浴冷却5min ③离心:将热处理后的样品I转移至两支50ml离心管中,平衡后,离心10min。 (条件:4℃,12000r/min) ④收集+测量:收集上清液并量出体积V2(样品Ⅱ),另留1ml上清液(样品Ⅱ)放置-20℃冰箱保存(用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS-PAGE分析。 3、有机溶剂(乙醇)沉淀 ①冰浴:将热处理后的上清液加入相同体积的-20℃的95%乙醇,冰浴中温和搅动混匀,

生物化学实验报告

生物化学实验报告 动物营养研究所 树润 2015.10.12 猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活性测定一.实验目地 1.通过实验了解活性物质的分离提取。 2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。 二.实验原理 超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白,是唯一以自由基为底物 的酶,具有清除自由基的功能酶,在酶分子上共价连接金属辅 基,因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。 该酶首次从牛红细胞中分离得到,是一种蓝色含铜蛋白,之后, 研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力,因此将其 命名为超氧化物歧化酶1-2。超氧化物歧化酶是一种能专一地清 除超氧离子自由基(O2-)的金属酶,它具有抗衰老、抗辐射、 抗炎抗癌等作用,因而在医药(如关节炎、红斑狼疮等疾病的 治疗3)、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业(SOD灵芝菌5 等)等方面具有了广泛的应用前景。 超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体的一种金属酶, 可催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应, 生成H2O2和 O2。SOD催化下述反应:2H++2O2-→H2O2+O2。

超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同,可分为 Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体,呈 蓝绿色;Mn-SOD呈紫红色;Fe-SOD呈黄褐色。 SOD提取、纯化制备方法各异, 常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料,从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法:邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。 该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定,酶活性单 位定义为:每毫升反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率 达50%的酶量定义为一个酶单位。 样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮 蓝G-250在游离状态下呈红色,与蛋白质结合呈现蓝色。在一 定围,溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比,可 用比色法测定,测定围1-1000μg。 三.实验试剂与器材 1.实验试剂 ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯 亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐 溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等 2.实验器材

生化实验报告资料

生物化学实验报告 姓名:吴瑞 学号: 3120016004 专业年级: 2012级临床医学(妇幼保健) 组别:第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心

一、实验室规则 1.实验前应认真预习实验指导,明确实验目的和要求,写出预实验报告。 2.进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律,不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3.严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题,切勿盲目处理,应及时请教指导老师。 4.严格按操作规程使用仪器,凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用,对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法,才能开始使用;仪器发生故障,应立即关闭电源并报告老师,不得擅自拆修。 5.取用试剂时必须“随开随盖”,“盖随瓶走”,即用毕立即盖好放回原处,切忌“张冠李戴”,避免污染。 6.爱护公物,节约水、电、试剂,遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7.注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时,管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8.废纸及其它固体废物严禁倒入水槽,应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱,必须事先用水稀释,方可倒入水槽内,并放水冲走。 9.以实事求是的科学态度如实记录实验结果,仔细分析,做出客观结论。实验失败,须认真查找原因,而不能任意涂改实验结果。实验完毕,认真书写实验报告,按时上交。 10.实验完毕,个人应将试剂、仪器器材摆放整齐,用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好,方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理,保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等,并严格执行值日生登记制度。

12级生物化学实验2期末复习题-考试

12级生物化学实验2期末复习题-考试

生物化学实验(2)理论习题 一、名词解释题 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE):在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后,蛋白质亚基的点泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,而电荷因素可以被忽略。当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时,电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系,可以用来测定蛋白质亚基的分子量。 2、电泳:带电颗粒在电场作用下,向着与其电性相反的电极移动,称为电泳 3、层析分离技术:是一种物理的分离方法,利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别,使各组分以不同的程度分布在两个相中。 4、吸附色谱法:利用同一吸附剂对混合物中不同成分吸附能力的差异,从而使各成分达到分离目的的色谱法。 5、离子交换层析:以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。 6、分配层析:根据一种或多种化合物,在两种不相

融合的溶剂间的分配来分离物质的方法。 7、亲和层析:是利用生物活性物质之间的专一亲和吸附作用而进行的层析方法。是近年来发展的纯化酶和其他高分子的一种特殊的层析技术。 8、凝胶层析(凝胶色谱):混合物随流动相经过凝胶层析柱时,由于各组分流经体积的差异,使不同分子量的组分得以分离的层析方法。 9、电渗作用:指在电场作用下液体(通常是水)相对于和它接触的固定的固体相作相对运动的现象。 10、担体:担体是一种化学惰性的,多孔性的固体微粒,能提供较大的惰性表面,使固定液以液膜状态均匀地分布在其表面。 11、死时间:从进样到惰性气体峰出现极大值的时间称为死时间.。 12、保留时间:被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间,也即从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间,称为此组分的保留时间。 13、高效液相色谱法:,以液体为流动相,采用高压输液系统,将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,在柱内各成分被分离后,进入检测器进行检测,

生物化学实验习题及参考答案

生物化学实验习题及参 考答案 Document number【980KGB-6898YT-769T8CB-246UT-18GG08】

生物化学实验习题及解答 一、名词解释 1、pI; 2、层析; 3、透析; 4、SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳; 5、蛋白质变性; 6、复性; 7、Tm 值; 8、同工酶; 9、Km值; 10、DNA变性;11、退火;12、增色效应 二、基础理论单项选择题 1、用下列方法测定蛋白质含量,哪一种方法需要完整的肽键() A、双缩脲反应 B、凯氏定氮 C、紫外吸收 D、羧肽酶法 2、下列哪组反应是错误的() A、葡萄糖——Molish反应 B、胆固醇——Libermann-Burchard反应 C、色氨酸——坂口(Sakaguchi)反应 D、氨基酸——茚三酮反应 3、Sanger试剂是() A、苯异硫氰酸 B、2,4-二硝基氟苯 C、丹磺酰氯 D、-巯基乙醇 4、肽键在下列哪个波长具有最大光吸收() A、215nm B、260nm C、280nm D、340nm 5、下列蛋白质组分中,哪一种在280nm具有最大的光吸收() A、色氨酸的吲哚基 B、酪氨酸的酚环 C、苯丙氨酸的苯环 D、半胱氨酸的硫原子 6、SDS凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量是根据各种蛋白质() A、在一定pH值条件下所带的净电荷的不同 B、分子大小不同 C、分子极性不同 D、溶解度不同 7、蛋白质用硫酸铵沉淀后,可选用透析法除去硫酸铵。硫酸铵是否从透析袋中除净,你选用下列哪一种试剂检查() A、茚三酮试剂 B、奈氏试剂 C、双缩脲试剂 D、Folin-酚试剂 8、蛋白质变性是由于() A、一级结构改变 B、亚基解聚 C、空间构象破坏 D、辅基脱落 9、用生牛奶或生蛋清解救重金属盐中毒是依据蛋白质具有() A、胶体性 B、粘性 C、变性作用 D、沉淀作用 10、有关变性的错误描述为()

生物化学实验习题及参考答案

生物化学实验习题及参考答案

生物化学实验习题及解答 一、名词解释 1、pI:指氨基酸的正离子浓度和负离子浓度相等时的pH值,用符号pI表示。 2、层析:按照在移动相和固定相(可以是气体或液体)之间的分配比例将混合成分分开的技术。 3、透析:通过小分子经过半透膜扩散到水(或缓冲 液)的原理,将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。 4、SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳:在去污剂十二烷基硫 酸钠存在下的聚丙烯酰氨凝胶电泳。SDS-PAGE 只是按照分子的大小,而不是根据分子所带的电荷大小分离的。 5、蛋白质变性:生物大分子的天然构象遭到破坏导 致其生物活性丧失的现象。蛋白质在受到光照,热,有机溶济以及一些变性济的作用时,次级键受到破坏,导致天然构象的破坏,使蛋白质的生物活性丧失。 6、复性:在一定的条件下,变性的生物大分子恢复成具有生物活性的天然构象的现象。

7、Tm 值:核酸分子变性过程中,紫外吸收达到最大增量一半时的溶解温度。 8、同工酶:能催发相同的反应类型但其理化性质及免疫学性质不同的酶。 9、Km值:反应速度为最大反应速度一半时的底物 浓度。是酶的特征物理学常数之一。近似表示酶与底物的亲和力。 10、DNA变性:DNA双链解链,分离成两条单链的现象。 11、退火:既DNA由单链复性、变成双链结构的过 程。来源相同的DNA单链经退火后完全恢复双 链结构的过程,同源DNA之间`DNA和RNA之 间,退火后形成杂交分子。 12、增色效应:当双螺旋DNA熔解(解链)时,260nm 处紫外吸收增加的现象。 二、基础理论单项选择题 1、A; 2、C; 3、B; 4、A; 5、A; 6、B; 7、B; 8、C; 9、D;10、A;11、A;12、D;13、A; 1、用下列方法测定蛋白质含量,哪一种方法需要完整的肽键?()

生物化学实验复习题库

生物化学实验复习题库 1、卵磷脂的提取原理: 卵磷脂在脑、神经组织、肝、肾上腺和红细胞中含量较多,蛋黄中含量特别丰富。卵磷脂易溶于醇、乙醚等脂溶剂,可利用这些脂溶剂提取。本实验用95%乙醇提取卵磷脂,用蒸汽浴分离乙醇和卵磷脂 2、卵磷脂的提取原理鉴定新提取得到的卵磷脂为白色蜡状物,与空气接触后因所含不饱和脂肪酸被氧化而呈褐色。卵磷脂中胆碱基在碱性条件中分解成三甲胺,三甲胺有特异的鱼腥臭味,可鉴别。 3、糖的颜色反应莫氏试验: 糖经无机酸(浓硫酸、浓盐酸)脱水产生糠醛或糠醛衍生物,后者在浓无机酸作用下,能与а-萘酚生成紫红色缩合物。因为糠醛或糠醛衍生物对此均呈阳性反应,故不是糖类的特异性反应,但可用来鉴定糖的存在。 4、糖的颜色反应塞氏试验: 酮糖在浓酸的作用下,脱水生成5-羟甲基糠醛,后者与间苯二酚作用,呈红色反应;有时亦同时产生棕红色沉淀,此沉淀溶于乙醇,成鲜红色溶液。此反应是酮糖的特异性反应,醛糖在同样条件下成色反应缓慢,只有在糖浓度高或煮沸时间长时,才微弱的阳性反应。在实验条条件下蔗糖有可能水解而呈阳性反应。塞氏试验可鉴别酮糖的存在。 5、何谓纸层析法? 纸层析是最简单的液一液相分配层析。滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时,大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附,因此,纸及其饱和水为层析的固定相,与固定相不相混溶的有机溶剂为层析的流动相。 因为不同的氨基酸在相同的溶剂中溶解度不同,所以利用在滤纸上迁移速度不同分离氨基酸 6.何谓Rf值?影响Rf值的主要因素是什么

Rf为氨基酸的比移值。Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶液前沿的距离 影响纸层析迁移率Rf值的主要因素:1、样品本身的性质和结构;2、溶剂的性质;3、PH 值;4、温度;5、滤纸性质。 7.怎样制备扩展剂? 8.层析缸中平衡溶剂的作用是什么? 9.牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 牛奶含有半乳糖、蛋白质、脂肪成分。蛋白质中的酪蛋白通过等电点沉淀,再通过离心而获得,糖类小分子由于处于清液中而分离,沉淀物中所含有的脂肪通过有机溶剂抽提而去除,最终得到纯白色、晶状酪蛋白。 方法:取新鲜牛乳,加入PH4.7的醋酸缓冲液,40度下沉淀析出酪蛋白,然后洗涤,醇醚吸水至干燥得粉末称重,计算提取率。步骤:保温→调PH→沉淀→离心→洗涤→干燥→称量 10.何谓蛋白质的等电点?有何实用意义? 蛋白质的等电点:指氨基酸的正离子浓度和负离子浓度相等时的pH值,用符号pI表示。 蛋白质同氨基酸一样为两性电解质,调节蛋白质的PH可使蛋白质带正电或带负电;在pI 时溶解度最低,在外加电场中蛋白质分子既不向正极移动也不向负极移动。 11、蛋白质变性与沉淀的关系。 沉淀可以是由蛋白质变性从而产生沉淀,也可以是由于盐析。蛋白质变性是指光照,热,有机溶济以及一些变性剂(如重金属盐)的作用时蛋白质的空间结构被破坏,使得蛋白质丧失活性,该过程不可逆。盐析是指向蛋白质的溶液中加入轻金属盐,使得蛋白质沉淀析出,这是由于加入盐降低了蛋白质得溶解度而析出,该过程可逆,加水蛋白质又会溶解。二者本质上是不同的。

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