细胞内钙离子的检测方法
Ca2+在细胞内的生理作用
Ca2+在细胞内的生理作用摘要：本文主要介绍Ca2+的一些作用，钙是人体内最重要的元素之一，参与 一切生命活动过程，维系着细胞的生理功能。钙主要是以离子形式发挥作用，其作用方式类似于激素的第二信使，因此有人称之为“生物学信使”。血浆中的钙离子浓度虽比细胞内高千倍以上，但比起骨骼和其他组织来说，还是很少的。但它存在于身体各部分，是调节体内钙浓度的重要因素之一。就是这些钙离子，通过平衡细胞内钙离子水平，在细胞中发挥着重要的作用。它维持了神经、肌肉、凝血机制，并在神经介质和激素的释放等生理功能方面发挥着重要作用，与细胞的受精等作用也有着密切关系。 一Ca2+与突触前神经递质的释放和突触后整合作用 当神经冲动抵达神经末稍时，末梢产生动作电位和离子转移，钙离子由细胞膜外进入膜内，使一定数量的小泡与突触前膜贴紧、融合起来，然后小泡与突触前膜粘合处出现破裂口，小泡内递质和其他内容物就释放到突触间隙内。在这一过程中钙离子的转移很重要。如果减少细胞外钙离子的浓度，即细胞膜内外的钙离子浓度差下降，则神经递质释放就要受到抑制，而增加细胞外钙离子的浓度差，则递质释放就增加。所以，钙离子由膜外进入膜内数量的多少，是直接关系到递质释放量的。钙离子是小泡膜与突触前膜贴紧融合的必要因素。钙离子有两方面作用：一方面是降低轴浆的粘度，有利于小泡移动；另一方面是消除突触前膜内的负电位，便于小泡和突触前膜接触而发生融合。 神经递质释放后，穿过突触间隙，激活突触后受体，这是突触后整合作用的第一步。整合作用的一部分经由亲离子受体的开放产生电位变化直接总合而发生在质膜水平；而另一部分额外的、重要的突触后整合作用通过信号级联发生在细胞内，这些信号级联控制着多种代谢过程和生物合成过程，进而调节长时程神经元反应，如调节突触强度、神经元兴奋性和调控蛋白质合成，Ca+在所有这些过程中所扮演的至关重要的作用。和控制膜通道的许多依赖Ca2+的信号、长时程突触可塑性及基因表达都被详细描述过。ER在信息的突触后处理过程中有特殊的作用，因为ER是个通用的、发信号的细胞器，能够把新产生的信号和正在进行的细胞进程进行整合，如将蛋白质合成及翻译后修饰和多种分子的细胞内转运进行整合。依赖于内膜Ca2+的兴奋性，ER密切参与在高度极化的神经细胞的末梢远端突触后部位产生的信号传递。这个ER参与的信号传播对突触活性与基因表达之间的偶联尤为重要。 二Ca2+与血液凝固 凝血开始到形成凝血酶之前为止，是由内源性和外源性两个系统组成。内源性（血液的内在性）凝血机制，为血液的单独过程。血液与异物表面（血管壁的胶原纤维等）接触时，所谓接触因子的第XII因子和第XI因子就被激活，当第VI因子被激活后，它再使无活性的第IX因子活化。另一方面，血小板也在异物表面上粘着、凝集，并引起血小板变性（viscous me－tamorphosis）释放血小板第III因子。紧接着血浆中第VIII因子和钙离子与这些有活性的第XI因子和血小板第III因子发生反应，把无活性的第X因子激活。第V因子再和血小板
细胞增殖及细胞活力检测方法
细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA 的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，
所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA 的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU 后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。 图1：EdU及BrdU原理示意图（摘至invitrogen说明书） 在一些情况下，细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多，这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力，Alamar Blue，MTT及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力，所以这是一种间接的方法。 Calbiochem的快速细胞增殖试剂盒，或者，严格来说，叫细胞活力试剂盒，采用一
钙离子测定
用荧光测定法，通过测定荧光强度来反映细胞中的钙离子浓度是目前普遍采用的细胞内钙离子检测方法。根据激发光的波长不同，可以将检测细胞内钙离子用的荧光染料分为紫外光激发的钙离子荧光指示剂和可见光激发的钙离子荧光指示剂。其中，紫外光激发的钙离子荧光指示剂有Fura 2、lndo-1、Bis-fura、Ouin-2、Fura-4 F、Fura-5F、Fura-6F、Benzothiaza-1、Benzoth． Iaza-2、BTC等；可见光激发的钙离子荧光指示剂有FIno-3、Fluo-4、Fluo-5N、Rhod-5N、X-rhod-5N 、Calcium Green-1 、Calcium Green-2、Calcium Orange、Calcium Crimson、Fura Red等。Fluo-3具有Kd值较高、可见光激发、监测背景低等优点，被广泛用于荧光监测的指示剂[9]。Fluo-3/AM在与钙结合后表现为荧光强度的增加，细胞内钙离子浓度愈高，荧光愈强，细胞内钙离子浓度愈低，荧光愈弱[10]。以往测定细胞内钙离子浓度变化的方法通常是利用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)来完成，但缺点是LSCM扫描采集速度慢，对培养器皿要求特殊，且价格高昂，检测成本高，对细胞伤害大。为降低长时间采集对样品造成的损伤，作者应用高灵敏度的流式细胞仪和流式细胞技术相结合，以纯化的T淋巴细胞为研究对象，选择Fluo-3/AM负载细胞，成功获得了实时监测并分析受到外界信号刺激时细胞内Ca2+ 浓度的动态变化。结果显示随着刺激信号的加入和时间的变化，Fluo-3/AM负载的T淋巴细胞内的钙离子浓度呈现动态变化。该方法能简单快速、可直接动态实时检测细胞内钙离子荧光信号，为研究细胞内的Ca2+浓度的动态变化提供了实用的解决方案和方法。 水母发光蛋白（ＡＥＱ）广泛应用于Ｃａ２＋信号监测领域己有近４０年。ＡＥＱ是由一个２２ＫＤａ大小的可结合Ｃａ２＋的脱辅基发光蛋白和辅基腔肠素（ＣＴＺ）组成的，在有
胞内游离Ca的测定方法
Pluronic F-127 (F127)美国Molecular Probes Inc.产品。 Ultima型共聚焦激光扫描显微镜为美国MERIDIAN Instruments Inc 产品。 1. 光源：Ultima型50Mw UV,200Mw Visible 2. 激发波长：351-364nm，488nm，514nm 3. 扫描系统：Ultima为台阶扫描，精度0.1um 目的：监测细胞胞浆中游离钙的动态变化 原理：正常细胞内游离钙浓度[Ca2┼]i为0.1 umol/L,胞外钙离子浓度为1.2-1.3mmol/L,相差达10000倍。胞外钙内流和胞内钙库动员形成的钙震荡(钙峰或钙波)在各种生理过程中起重要作用；病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢紊乱,直至细胞坏死或凋亡；钙离子通道阻断剂已广泛应用于临床。显而易见,测定[Ca2┼]i在生理学、病理学和药理学等研究工作中均具有重要意义。Fluo-3/AM等钙离子荧光染料以脂溶性的乙酰甲氧基酯（AM酯）的形式导入细胞，在胞内水解酶的的作用下水解成游离酸，与钙离子的结合物在激发光作用下能产生特异的荧光。荧光信号的强弱随钙离子浓度的变化而变化。 100ug Fluo-3/AM 溶于100ul DMSO中，就是1ug/ul,1mg/ml,1g/L 方法：1.预先用二甲基亚砜(DMSO)将Fluo-3/AM配制为1mmol/L(1g/L)原液,-20oC避光保存。F127用DMSO配制成20%溶液(W/V)。用无血清无酚红培养液将Fluo-3/AM稀释成终浓度为10umol/L，并加入0.1％的Pluronic F-127备用。2.移去培养皿中的原培养液，用PBS液冲洗心肌细胞2遍，加入10umol/L 染料液1ml，置于37oC的CO2孵箱里避光温育30min。 3.将染色后的心肌细胞用PBS液冲洗3遍，加入1mlDMEM液后置于20倍光学显微镜观察区域及层面，用LSCM观察Fluo-3染色的细胞的某一层面的荧光图像。 4.启动LSCM，选择488nm氩离子激光，启动计算机，运行lasersharp2000软件，选择time-course程序，设置扫描间隔时间（30sec）、扫描次数（300次），开始扫描。 5.将数据输入excel进行整理、统计、分析。 一、细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的测定 按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM或Fluo-3/AM来检测细胞内[Ca2+]i。Fura-2的结构类似于四羧酸的Ca2+螯合剂EGTA，能以1：1的比例特异性地与Ca2+结合，与EGTA不同的是Fura-2可发出荧光，并且结合Ca2+后荧光特性有改变，Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380 nm和340 nm，这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。Fura-2为一极性很大的酸性化合物，不能进入细胞内，但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为Fura-2/AM。后者脂溶性很强，又消除了负电荷，容易通过细胞膜，随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为Fura-2，与胞浆中的游离Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。并且，Fura-2与Ca2+解离容易，随着游离Ca2+的增加或减少，其荧光强度便随之变化。因此，Fura-2的荧光强度与[Ca2+]i呈比例关系，据此可以测定[Ca2+]i及其变化(Malgaroli, A., et al., 1987)。
人脐血及骨髓淋巴细胞免疫表型的比较及其意义
人脐血及骨髓淋巴细胞免疫表型的比较及其意义 郭 荣,邹 萍,邹典斌1 (华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所,武汉430022; 1郑州大学医学院第一附属医院血液科,郑州450052) 摘要 为比较脐血和骨髓淋巴细胞及祖细胞分化抗原,通过流式细胞术(FCM)双标法对38份脐血及10份骨髓免疫细胞表型进行了分析研究。研究发现:①脐血及骨髓淋巴细胞中均测到幼稚淋巴细胞(CD3-CD4+),且前者中含量较多,但脐血细胞毒T细胞含量(CTL,CD3+CD16+56+)低于骨髓;②脐血中N K细胞(CD3-CD16+56+)比例高于骨髓;③脐血有核细胞中CD34+细胞的比值接近于骨髓,但脐血CD34+细胞中髓系祖细胞(CD34+ CD13+,CD34+HLA2DR+)及淋巴系祖细胞(CD34+CD19+)含量均低于骨髓。结论:①脐血免疫细胞具有不成熟性,这估计是脐血移植后GVHD程度轻的主要原因;②脐血淋巴细胞中N K细胞含量较高,推测脐血移植后移植物抗白血病效应(GVL)并不会降低;③脐血CD34+细胞中髓系祖细胞及淋巴系祖细胞比例均低于骨髓,可能是脐血移植后造血及免疫重建速度较慢的原因之一。 关键词 脐血;骨髓;淋巴细胞;免疫表型 中图分类号 R33111;R331.2 A Comparison bet w een Immunophenotypes of Lymphoid Cells from H uman Umbilical Cord Blood and Bone Marrow and Its Signif icance GUO Rong,ZOU Ping,ZOU Dian2Bin1 (Instit ute of Hematology,The A f f iliated U nion Hospital,Tongji Medical College,Huaz hong Science and Technology U niversity, W uhan430022,Chi na;1Depart ment of Hematology,The Fi rst A f f iliated Hospital of Medical College of Zhenz hou U niversity, Zhenz hou450052,Chi na) Abstract To compare the expression of CD antigens on immune cells from umbilical cord blood(UCB)and bone marrow(BM)and analyze its clinical significance,the phenotypes of lymphoid cells and nucleated cells from38UCB and 10BM samples were investigated by flow cytometry with double labeling monoclonal antibodies.The results showed that the immature lymphocytes(CD3-CD4+)were detedcted in UCB and higher than those in BM;cytotoxic T lymphocytes (CD3+CD16+CD56+)in UCB were significantly lower than those in BM.N K cells(CD3-CD16+CD56+)in UCB were higher than those in BM.The ratio of CD34+cells in nucleated cells of UCB was similar to that of BM,however,both the contents of myeloid(CD34+CD13+and CD34+HLA2DR+)and lymphoid(CD34+CD19+)progenitor cells in UCB were lower than those in BM.It is concluded that the immune cells in UCBpossess immaturity,which might lead to mild GVHD after UCB trans plantation.It is infered from the higher ratio of N K cells in UCB,GVL will not decrease after UCB transplantation.The lower contents of myeloid and lymphoid progenitor cells in UCB probably accounted for the slow hematopoiesis and immune reconstitution following UCB transplantation. K ey w ords umbilical cord blood;bone marrow;lymphoid cell;immunophenotype 脐血具有经济、来源广、采集方便、无采集并发症,移植后移植物抗宿主病(graft versus host dis2 ease,GV HD)程度轻,移植物抗白血病(graft versus leukemia,GVL)效应不降低等优点。但是脐血也存在造血重建速度慢,易合并感染的问题。本研究应用流式细胞术(flow cytometry,FCM)对脐血和骨髓免疫细胞分化抗原进行检测,比较二者在淋系祖细胞、髓系祖细胞、幼稚淋巴细胞及N K细胞含量方面有无差别,旨在分析二者免疫表型差异,探讨其在扩大脐血应用范围中的作用和意义。 材料与方法 标本采集 无菌条件下采集正常足月分娩新生儿脐血38份。母亲年龄24-35岁,平均(29.3±3.3)岁。新生儿娩出后,立即(不超过30秒)用止血钳在距脐轮2-3cm处夹住脐带,在两钳间剪断脐带,用含少许肝素的注射器抽取脐血,加入离心管中混匀。骨髓 通讯作者:郭荣 电话:(027)85730575.E2mail:gh7311@yahoo. https://www.360docs.net/doc/f717349772.html, ? 9 1 5 ? 中国实验血液学杂志 Journal of Ex perimental Hem atology2002;10(6):519-522
钙离子在调控细胞凋亡和细胞迁移中的作用综述
钙离子在调控细胞凋亡和细胞迁移中的作 用综述 中国农业大学植生071 薛永铭0702040118 摘要钙离子对生命活动具有重要作用。本文集中讨论钙离子在细胞凋亡与迁移的调控中所扮演的重要角色。亚细胞区室内钙离子分布的微妙变化可以有效地正调控或负调控细胞凋亡，这是钙离子参与四条信号通路来调控细胞凋亡的基础。程和平教授研究组最近发现钙闪烁在细胞定向迁移中的作用，对细胞迁移的研究有重要作用。 关键词钙离子信号通路细胞凋亡Caspase（半胱天冬酶）细胞迁移钙闪烁 一、钙离子对生命活动具有重要作用。 钙离子对多项生命活动具有重要作用。在动物生理的教科书中对其主要生理功能进行了总结： 1.钙离子是凝血因子，参与凝血过程； 2.参与肌肉（包括骨骼肌、平滑肌）收缩过程（内质网内钙库的释放）； 3.参与神经递质合成与释放、激素合成与分泌； 4.是骨骼构成的重要物质。 这些重要生理功能已经有了几十年的研究基础，然而近些年的研究却揭示了钙离子在细胞凋亡与迁移的调控中所扮演的重要角色，使人们得以钙离子的生理功能，所以我认为集中笔墨将这两个方面进行介绍也是很有意义的。 二、钙离子参与四条主要的凋亡信号通路。 长期研究表明，亚细胞区室内钙离子分布的微妙变化可以有效地正调控或负调控细胞凋亡，因此钙离子扮演着细胞生存的捍卫者或是无情的死刑执行者的双重角色。近年来，研究者发现并总结出了引起哺乳动物细胞凋亡的四条信号通路：外部
通路（死亡受体通路）、内部通路（线粒体通路）、依赖Caspase-2的通路、不依赖于Caspase的通路（GrA介导通路）。四条通路图示见图1。 图1 引发哺乳动物细胞凋亡的四条信号通路。（引自Sten Orrenius et al., 2003）1.钙离子与死亡受体通路 死亡受体（DR）通路是目前研究最多最清楚的凋亡诱导机制。死亡受体包括Fas、TRAILR2、TRAILR1等，都属于肿瘤坏死因子受体超家族。以Fas为例，Fas 触发的凋亡机制是通过升高钙离子浓度来实现的。钙结合蛋白对内质网腔内钙离子变化非常敏感，与Fas结合后使钙离子内流，启动细胞凋亡，激活Caspase-8。在I 型细胞中，Caspase-8激活Caspase-3，而Caspase-3是细胞凋亡的直接执行者之一；在II型细胞中，Caspase-8剪切Bid蛋白，而后依赖线粒体通路诱导凋亡。 2.钙离子与线粒体通路 线粒体是胞内重要的钙库，内质网与线粒体之间的钙离子交流对细胞命运有深刻地影响。在一些刺激作用下，内质网将其储存的钙离子释放，然后线粒体摄取钙离子，引起钙离子超载，导致线粒体的损伤。线粒体的损伤会导致细胞色素c的释放，引发凋亡体（apoptosome）的形成，apoptosome激活Caspase-9，Caspase-9又激活了细胞凋亡的直接执行者Caspase-3，诱导了细胞凋亡。线粒体通透孔的开放使
流式细胞仪常用的几种检测方法
精品文档，放心下载，放心阅读 流式细胞仪常用的几种检测方法（转载） 一、测定用乙醇固定的DNA的含量 1、培养细胞的DNA含量的测定精品文档，超值下载 制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中； 加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存； 附:细胞固定的一般步骤 1) 取单细胞悬液1～2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中； 2) 300g离心5分钟，弃上清，反复两次； 3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中； 4) 将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分 钟。在4℃条件下可保存2~3周。 注意： 2根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛； 2将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃； 2细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。 2 300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中； 2显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤； 2加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟； 2上机检测。 2、新鲜组织的DNA含量的测定 1) 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液； 2) 500g离心5分钟； 3) 弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中； 4) 再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤； 5) 上机检测。 3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定 1) 从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液； 2) 用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清； 3) 加入PI液1ml室温避光30分钟； 4) 调整细胞浓度为1×106/ml； 5) 上机检测。
细胞线粒体内钙离子浓度荧光检测试剂盒产品说明书中文版
细胞线粒体内钙离子浓度荧光检测试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 细胞线粒体内钙离子浓度荧光检测试剂是一种旨在通过线粒体钙离子特异性荧光探针Rhod-2，与钙离子结合后，其荧光强度显著增强，在荧光分光光度仪下观察相对荧光峰值的变化，来测定细胞线粒体中总钙离子浓度的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种活体细胞（动物、人体等）内线粒体钙离子的浓度检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感。 技术背景 钙是人体中的一种重要电介质和矿物质，占1150克。其中99％的钙以氟磷灰石钙（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨组织中。非骨组织钙成分主要存在于细胞内。钙具有两种主要形式：一种是非弥散型蛋白结合钙，其构成约40％至50％的血清中的总钙含量；另一种为弥散型游离钙，其进一步分成具有活性的复合钙（complexed calcium）和离子钙（ionized calcium）。钙对神经肌肉兴奋性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、离子跨膜运输、释放神经传导介质、信使传导等方面起着重要作用。在细胞内，钙离子主要储存在线粒体和内质网等细胞器中。其中线粒体钙离子在调节线粒体代谢、保持线粒体的A TP产量达到细胞需求，维持细胞内环境钙离子平衡方面起着重要作用。线粒体钙的检测包括沉淀法、EDTA鳌合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技术，但容易受到钠、钾、磷酸盐、硫酸盐的干扰，或者受限于仪器的特殊的要求，以及需要线粒体纯化。Rhod-2，罗丹明123（rhodamine 123）的衍生产物，一种与钙离子结合产生荧光，同时其正电荷特性，特异性地聚集在线粒体里，由此用于测定线粒体内钙离子水平。在荧光分光光度仪下，激发波长550nm，散发波长590nm，来定量测定线粒体的钙浓度。 产品内容 清理液（Reagent A）40毫升 染色液（Reagent B）30微升 介导液（Reagent C）600微升 饱和液（Reagent D）2毫升 阴性液（Reagent E）2毫升 产品说明书1份 保存方式 保存染色液（Reagent B）和介导液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月 用户自备 1.5毫升离心管：用于工作液配制的容器 细胞培养箱：用于染色孵育 黑色96孔板：用于样品操作的容器
钙离子成像
钙离子成像 一、实验目的 钙是人体的重要组成成份，它广泛分布于全身各组织器官中，正常人体的钙占体重的1.5%-2.0%。在人体中的含量居第五位。钙离子与神经递质的释放、肌肉收缩以及凝血过程等生理过程都有重要关系，因此钙离子的检测对人体了解相关的生理活动非常的重要。 二、实验仪器 硬件设备： ? 1.Olympus 倒置显微镜 IX71 ? 2. TILL单光仪 ? 3.EM-CCD（HAMAMATSU C9100） ? https://www.360docs.net/doc/f717349772.html,puter 软件模块：SimplePCI 6.5 三、实验原理 测量钙离子的合成指示剂分为单波长激发指示剂、双波长激发指示剂和双波长发射指示剂3种。 ①波长激发指示剂：Quin-2 是第1代荧光指示剂，在340 nm处激发，505nm处可观察到结合Ca2+的发射峰强度的增加。用于测定静息状态或接近静息状态下的细胞内Ca2+的浓度，无法检测 1μM以上的Ca2+浓度 ②双波长激发指示剂：Fura-2 Fura-2是第2代荧光指示剂，当介质中无钙时，Fura-2的激发峰为380nm；当与钙结合后，激发峰向短波方向移至340nm，所以采用激发比例荧光测量。进入细胞的Fura-2随时间推移将泄漏到细胞外，所以应尽量缩短测定时间。 ③双波长发射指示剂：Indo-1 Indo-1为单波长激发(340nm)和双波长发射(405和506nm)指示剂，其优点与
Fura-2相同。Indo-1已经在流式细胞研究中广泛使用。测量340nm和380nm激发下的发射荧光强度： F 340和F 380 →R= F 340 / F 380 校准 [Ca2+] i =K d (R-R min )/(R max -R)(nmol/L) R max 是加入0.1%的TritonX-100破坏细胞膜后所得到的最大荧光强度比值； R min 为加入5μM的螯合剂EGTA后测得的最小荧光强度比值。K d 为Fura-2与钙离 子反应的解离常数，大小为224nmol/L. 四、实验结果
中国人血液淋巴细胞免疫表型参考值调查
中国人血液淋巴细胞免疫表型参考值调查 来源:https://www.360docs.net/doc/f717349772.html,时间:2007-10-06 字体:[大中小] 收藏我要投稿 文章出处：朱敏转载请注明出处 【摘要】目的建立健康中国成人血液淋巴细胞免疫表型分析参考值。方法用Simultest IMK-Lymphocyte试剂盒的荧光抗体对102例健康中国成人血液进行染色，以FACSort流式细胞仪进行分析，Simulset程序获取数据并分析结果，SPSS软件进行统计。结果18～65岁健康中国成人淋巴细胞参考值范围CD+3细胞是50%～84%（955～2 860/μl），CD-3CD+19细胞为5%～18%(90～560/μl)，CD+3CD+4细胞为27%～51%(550～1 440/μl)，CD+3CD+8细胞为15%～44%(320～1 250/μl)，CD-3、CD+16和/或CD+56细胞为7%～40%(150～1 100/μl)，CD+3CD+4/CD+3CD+8比值为0.71～2.87。随着年龄增长CD+3CD+4细胞略有升高，CD+3CD+8细胞略有降低。NK细胞在大年龄组女性低于男性，且有统计学差异(P＜0.05)。与高加索人和美国人相比，中国人的CD+3CD+8细胞和NK细胞(CD-3，CD+16和/或CD+56)的相对值(百分率)与绝对值均高，CD-3CD+19细胞和CD+3CD+4细胞仅相对值较低，但绝对值不少。CD+3CD+4/CD+3CD+8比值向低值漂移。结论种族、性别、年龄和环境因素可影响健康人淋巴细胞表型分布。 Reference values on blood lymphocyte immunophenotype in healthy Chinese adult Zhu Lihua, Wang Jianzhong, First Hospital, Beijing Medical University, Beijing,100034 【Abstruct】Objective To establish the reference values on blood lymphocyte immunophenotype in healthy Chinese adults.Method Staining whole blood with fluorescein-conjugated monoclonal antibodies supplied by simultest TM IMK lymphocyte kit, we analyzed 102 healthy Chinese residents (age range 18～65 years) by FACSort flow cytometer, acquired results by Simultest programme, and performed statistical analysis by SPSS software.Results The 95% reference ranges in absolute counts per microliter of whole blood (percentage of lymphocytes) for CD+3, CD+3CD+4, CD+3CD+8, CD-3CD+19, CD-3/CD+16 and/or CD+56 cells were 955 to 2 860 (50% to 84%), 550 to 1 440 (27% to 51%), 320 to 1250 (15% to 44%), 90 to 560 (5% to 18%), 150 to 1 100 (7% to 40%) respectively. The CD+3CD+4/CD+3CD+8 ratio was 0.71 to 2.87. CD+3CD+4 cells increased and CD+3CD+8 cells decreased slightly with age. Women were compared to men in old age group, NK cells (CD-3/CD+16 and/or CD+56) were lower (P＜0.05). Compared with Caucasians and Americans, Chinese had higher percentage and absolute numbers of CD+3CD+8 and NK cells, but had lower percentage of CD-3CD+19 and CD+3CD+4 cells without absolute number change. So CD+3CD+4/CD+3CD+8ratio skew to the lower values.Conclusion The race, age and environment could influence the reference value of lymphocyte immunophenotype. 【Key words】Lymphocyte immunophenotype Reference value Flow cytometry 淋巴细胞免疫表型分析在原发或获得性免疫缺陷病、自身免疫性疾病的辅助诊断和移植免疫的监测中具有重要作用。随着流式细胞仪的广泛应用，采用流式细胞术进行淋巴细胞免疫表型分析已逐渐成为临床检验的常规工作之一。各国的流式细胞术实验室均建立了自己的参考值，并对其种族、性别、年龄等影响因素进行了探讨。目前我国还没有用流式细胞术、采用双染色分析淋巴细胞免疫表型参考值的报告。为此我们对102例健康成人进行了淋巴细胞免疫表型分析，现报告如下。材料和方法 一、研究对象 102例标本均取自于无免疫性疾病、无现症、不吸烟、体检健康、血细胞计数及肝、肾功能检查正常的成人。年龄18～65岁，其中男性54人，女性48人。首先按男女性别分为两大组，每组中又以40岁为界，≤40岁者为小年龄组（男24人，女19人），＞40岁者为大年龄组（男30人，女29人）。
流式细胞仪常用的几种检测方法
流式细胞仪常用的几种检测方法（转载） 一、测定用乙醇固定的DNA的含量 1、培养细胞的DNA含量的测定 制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中； 加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存； 附:细胞固定的一般步骤 1) 取单细胞悬液1～2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中； 2) 300g离心5分钟，弃上清，反复两次； 3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中； 4) 将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分 钟。在4℃条件下可保存2~3周。 注意： 2根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛； 2将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃； 2细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。 2 300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中； 2显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤； 2加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟； 2上机检测。 2、新鲜组织的DNA含量的测定 1) 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液； 2) 500g离心5分钟； 3) 弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中； 4) 再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤； 5) 上机检测。 3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定 1) 从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液； 2) 用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清； 3) 加入PI液1ml室温避光30分钟； 4) 调整细胞浓度为1×106/ml； 5) 上机检测。 二、细胞凋亡检测及相关分子检测 1、细胞DNA含量分布（由细胞DNA降解方式检测细胞凋亡）
激光共聚焦扫描显微镜技术在大鼠皮层神经元细胞内钙离子浓度动态测定中的应用
?５３０? ?实验研究? 激光共聚焦扫描显微镜技术在大鼠皮层神经元细胞内钙离子浓度动态测定中的应用 武美娜李新毅白玮郭芬祁金顺 【摘要】目的探讨激光共聚焦扫描显微镜（ＬＣＳＭ）技术在动态测定神经元细胞内钙离子浓度中的应用。方法采用原代培养大鼠皮层神经元，用ＬＣＳＭ测定给ＫＣＩ前后细胞内钙离子浓度的动态变化。结果培养神经元状态良好。用ＬＣＳＭ准确、稳定、可靠地测出细胞内钙离子浓度的动态变化。结论ＬＣＳＭ在动态测定神经元细胞内钙离子浓度中具有明显优势。 【关键词】显微镜检查，共焦；细胞内钙离子浓度；皮层神经元 ＵｓｅｏｆＩａｓｅｒｅｏｎｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｆｏｒｄｙｎａｍｉｃｓｔｕｄｙｏｆｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｒａｔｃｏｒ－ｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎｓＷＵＭｅｉ－ｎａ＇，ＬＩＸｉｎ一蚋，ＢＡｌＷｅｉ，ＧＵＯＦｅｎ，ＱＩＪｉｎ－ｓｈｕｎ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｘｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔ）＇，Ｔａｉｙｕａｎ０３０００１．Ｃｈｉｎａ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｄｏｃｕｍｅｎｔｔｈｅｐｒｏｍｉｓｅｓｏｆｌａｓｅｒｃｏｎｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＬＣＳＭ）ｉｎｄｙｎａｍｉｃｓｔｕｄｙｏｆ ｉｎｔｒａｅｅｌｌｕｌａｆｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（『Ｃａ邳）ｊｎｎｅｕｒｏｎｓｓｕｂｊｅｅｔｅｄｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｒｕｇａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．ＭｅｔｈｏｄｓＬＣＳＭｗａｓｕｓｅ（１ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｏｆｆＣａ２ｑｉｉｎｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｄｃｏｒｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎｓｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒＫＣＩｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｃｕｌｔｕｒｅｄｎｅｕｒｏｎｓｓｈｏｗｅｄｇｏｏｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｇｒｏｗｔｈｓｔａｔｕｓ．Ａｃｃｕｒａｔｅ，ｓｔａｂｌｅａｎｄｒｅｌｉａｂｌｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｏｆｄｙｎａｍｉｃ『Ｃａ２＋］ｉｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｕｓｉｎｇＩ￡ＳＭ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＬＣＳＭｔｅｃｈｎｉｑｕｅｍａｙｓｈｏｗｐｒｏｍｉｓｅｓｆｏｒｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｉｎｆＣａ２＋］ｉ． 【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＣＯｌｌｆｏｃａｌ；ＩｎｔｒａｃｅＵｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｃｏｒｔｉｅａｌｎｅｕｒｏｎｓ Ｃａ２＋是细胞内最为重要的阳离子和第二信使之一。它对于神经递质释放、神经元之间信息传递和神经元存活等都具有重要意义。神经元细胞内游离Ｃａｚ＋浓度（［Ｃａ：＋３ｉ）异常升高是导致胞内钙稳态失调和细胞死亡的重要因素…，因而观察神经元［Ｃａ２＋］ｉ的变化是神经生理学研究中的一个重要内容。然而。目前采用的一些测定细胞内钙离子浓度的方法．如Ｃａ“活化的发光蛋白法、偶氮染料法、ｃａ：＋选择性微电极测定法、发射示踪法、核磁共振法、荧光标记法等各有优势，但同时也有不足之处【引。 激光共聚焦扫描显微镜（１ａｓｅｒｃｏｎｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ＬＣＳＭ）是２０世纪８０年代诞生的一种先进的细胞生物学分析仪器。利用紫外光或可见光激 基金项目：国家自然科学基金科学部主任基金资助项目（３０７４００９５）；教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（２００６０１１４００４）；山西省自然科学基金资助项目（２００６０１１０５）；山西省重点实验室开放基金资助项目（２００６０３０１２） 作者单位：０３０００１太原，山西医科大学生理教研室（武美娜、郭芬、祁金顺）；山西医科大学第一医院神经内科（李新毅）；山西省肿瘤医院病理科（白玮） 通讯作者：祁金顺：发荧光探针，计算机进行图像处理。可以对活细胞生理信号、离子含量如Ｃａ嗽度进行实时动态分析检测。ＬＣＳＭ具有高灵敏度、高分辨率、高放大倍数的特点。可进行定性、定量、定时、定位的分析测量，是近代生物医学技术最重要的发展之一。因此，它已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学和遗传学等领域新一代强有力的研究工具［，，４｜。ＬＣＳＭ的一个显著优点是可以对同一样品平面随时间进行连续扫描。进而分析细胞结构或细胞内离子含量的动态变化。对细胞内Ｃ矿的动态测定，要求仪器具有实时、连续测定的能力。本文介绍使用ＬＣＳＭ在原代培养大鼠皮层神经元细胞内Ｃａ２＋浓度动态测定中的具体应用及其优势。 １材料和方法 １．１大鼠皮层神经元的原代培养：取新生１～３ｄＷｉｓｔａｒ大鼠，无菌条件下分离大脑皮层，剪碎（＜ｌｉｎｌｎ，）。以终浓度为０．０３２５％的胰蛋白酶消化（３７℃，５—１０ｍｉｎ），用含胎牛血清的培养基终止消化，火抛光的Ｐａｓｔｅｕｒ吸管轻轻吹打１０～２０次，静置沉淀３～５ｍｉｎ．取上液２００目筛网过滤后１０００ｒ／ｍｉｎ离心５
原子吸收法对钙的测定
原子吸收法对钙的测定 摘要：探讨原子吸收分光光度法测定食品中钙的方法。钙单元素检测范围在0～5μg/ml浓度内，标准曲线线性关系良好，（r= 0.99942）；相对标准偏差为1.59%～2.19%，加标回收率95.13%～96.28%。结论：该检测结果与国标方法比较无显著性差。该方法抗干扰能力强，检出限低，重现性好，精密度高，回收率高，操作快速简洁等优点。适合开展大批量检测工作，可为食品中钙的含量测定提供技术支持。 abstract： this paper is to investigate the method to determine calcium in food by the atomic absorption spectrometry. the range of calcium single-element detection is in 0～5μg/ml concentration， and the standard curve linear relationship is good，（r=0.99942）； the relative standard derivations for ca is 1.59%～2.19% respectively. the recoveries of samples for ca is 95.13%～96.28% respectively. conclusion： results of the testing methods has no significant difference with the national standard. this method has strong anti-interference ability， low detection limit， good reproducibility， high-precision， high-rate， simple and fast operation and other advantages. to carry out testing for high-volume work can provide the technical support for the calcium determination.
急性淋巴细胞白血病免疫表型特点及其临床意义
急性淋巴细胞白血病免疫表型特点及其 临床意义 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 【摘要】目的为探讨急性淋巴细胞白血病(ALL)的免疫表型特征及与治疗的关系。方法采用流式细胞仪对77例ALL患者进行免疫表型分析。结果① 77例ALL中L1型44.16%，L2型50.65%，L3型 5.19%;B淋巴细胞性ALL(B-ALL)80.52%，T淋巴细胞性ALL(T-ALL)15.58%。② 77例ALL中髓系抗原(My)阳性率为57.14%;其中表达CD13的阳性率最高，为84.09%，其次为CD33和CD15;My+ B-ALL占B-ALL的58.06%，My+ T-ALL占T-ALL的50%，两组比较差别无统计学意义(P0.05);My+ ALL组CR率为81.82%，略低于My-ALL 组(88.24%)，但差异无统计学意义(P0.05)。③ CD34表达阳性率为49.35%，B-ALL中为56.45%，明显高于T-ALL的25%(P0.05);My+ ALL 中CD34表达阳性率为71.05%，高于My-ALL的33.33%(P0.05);CD+34 ALL组CR率为76.47%，低于CD-34ALL组的90.91%，但差异无统计学意义(P0.05)。结论 ALL免疫分型与FAB分型变化无相关性;My+ ALL 患者中CD34表达阳性率高于My-ALL患者;CD34和髓系抗原的表达与CR率无相关性。
【关键词】急性淋巴细胞白血病;免疫表型 急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)的免疫分型对其诊断、治疗及预后判断有重要意义，而ALL不同的恶性克隆来源存在着显著不同的生物学特征及预后因素。为进一步探讨ALL各亚型免疫表型的特点及其与预后的关系，我们对本院77例ALL患者资料进行了研究，现报告如下。 1 资料和方法 1.1 病例资料 宁夏医科大学附属医院血液科及儿科2002-2008年间的住院初治ALL患者77例。男54例，女23例，年龄2.2～72岁，其中14岁儿童患者42例，中位年龄5.6岁，≥14岁患者35例，中位年龄23岁。所有病例均根据临床表现、骨髓细胞形态学、细胞化学染色及免疫分型而确诊。细胞形态学诊断根据FAB分型标准[1]，对于免疫分型诊断ALL又同时存在髓系抗原表达阳性，但又不够急性混合细胞白血病诊断标准，视为伴髓系抗原表达的ALL(My+ ALL)[2]。 1.2 免疫表型分析 受检者抽取骨髓或外周血经肝素抗凝，采用活细胞三色免疫荧光法标记，流式细胞仪检测，通过二维点图分析抗原表达情况。流式细胞仪型号为FACS Calibur，美国Becton-Dickinson公司生产，所用单克隆抗体亦均为美国BD公司产品。B淋巴细胞系单抗：CD10、CD19、CD20、CD22;T淋巴细胞系单抗：CD3、CD5、CD7;髓系单抗：CD13、CD14、CD15、CD33、CD117;造血干/祖细胞单抗：CD34。结果判定用