分析讨论从菜籽饼粕中提取蛋白质

分析讨论从菜籽饼粕中提取

蛋白质

油菜籽

?油菜是我国大面积生产的一种油料作物，产量居世界第1位

?油菜籽中油脂的含量为37.5%-46.3%。在油脂提取加工过程中产生菜籽饼粕。?在现代工业条件下加工菜籽，通常可得到将近60%的菜籽饼粕。每年产量超过

1×107 t

菜籽饼粕

?菜籽饼粕作为油脂加工的主要副产品，是一种蛋白质来源。其主要价值体现在蛋白质上。菜籽粕的粗蛋白含量36%左右，含多种氨基酸。

?菜籽饼粕可用于牲畜饲料，营养价值较高，但也含有较多的有害物质，因此要限制其用量。

有害物质

?由于菜籽饼粕中硫代葡萄糖苷（能水解生成致甲状腺肿大和其他有毒的物质）以及一些抗营养因子（如植酸、多酚类物质等）的存在，使菜籽饼粕的合理利用一直受到制约，所以从菜籽饼粕中提取蛋白质的过程，也是去除菜籽饼粕中有毒物质的过程。

1.菜籽饼粕的脱毒处理

?硫甙的脱除

?植酸的脱除

?多酚的去除

硫甙

?指硫代葡萄糖苷，本身不具有毒性，而其各种降解产物是有毒的。

?硫氰酸酯、异硫氰酸酯和吧唑烷硫酮，引起甲状腺肿。

?腈与硫葡萄糖苷的其他降解产物不同，主要引起动物肝脏、肾脏肿大和出血。

硫甙的脱除

?微生物发酵法——通过改变外界条件，诱变选育出适合的发酵微生物，以菜籽饼粕为底物，分解菜籽饼粕中硫甙，得到比较纯净蛋白质。

?双液相萃取法——以己烷为非极性相萃取油，以甲醇—水为极性相，萃取菜籽中的有毒物质，在得到高品质毛油的同时，可以得到色浅、味淡、蛋白质含量高、硫甙含量低的菜籽饼粕。但此法不能降低饼粕中的植酸含量

植酸

?又名肌醇六磷酸或环己六醇磷酸酯，食品工业用于果蔬及水产的保鲜、护色，也用作金属防锈、防蚀剂。

?抗营养化——①降低矿物元素的吸收利用。

②降低饲料蛋白质的消化利用。③降低消化酶的活性

植酸的脱除

?最常用的方法，是利用蛋白质和植酸溶解特性上的差别，从而进行分离的。调节植物蛋白萃取液的pH值，得到可溶的和不可溶的两部分植酸，然后通过过滤或离心分离去除不溶的植酸。

?在pH值为6~10时，植酸以“植酸—多价金属阳离子—蛋白质”的三元络合物形式存在。因此，可以利用EDTA螯合剂来解离这种三元络合物。

?以草酸盐作为钙镁等离子的沉淀剂，破坏菜籽饼粕中“植酸—多价金属阳离子—蛋白质”三元复合物结构，在中性条件下直接提取植酸。

多酚

?多羟基苯。如苯二酚、苯三酚等。常是植物及微生物中产生的酚类次生代谢产物。?植物多酚中的儿茶酚, 花青素, 异黄酮和缩合单宁都能与蛋白质结合或与消化道内的酶结合降低蛋白质的消化性, 影响其营养成分的吸收。

多酚的去除

?菜籽中有大量的酚存在于壳中，因此只要能有效脱除其壳，就能大大降低酚的含量。?Elzbieta Dtuzewska等人开发的膜壁扩散萃取过程，在脱除硫甙的同时可脱除约87%的酚。氨的存在亦能使菜籽中酚的含量大幅度降低。?Tzeng Y M等人用MeOH—NH3—H2O处理菜籽粕中酚的含量为0.4%~0.5%，而己烷处理粕中的酚含量则为1.5%~1.8%。

2.菜籽蛋白的提取方法

水相法（碱提酸沉淀方法）

水相酶解法

双液相萃取

超滤、渗滤法

水相法（碱提酸沉淀方法）水相法主要是采用不同水相将蛋白萃取而出，然后在菜籽蛋白等电点附近将蛋白沉淀，再分离干燥制取菜籽分离蛋白，最常用的萃取水相是稀碱、水、稀酸、NaCl水溶液及六偏磷酸钠溶液等。

水相法优点

?不需用易燃易爆溶剂，提高了生产的安全性，降低了对空气的污染；

?水相法提取与脱毒可同时进行，缩短了生产过程，效果较好；

?处理条件温和，蛋白质变性程度低，所得蛋白质与油脂的品质较高，并且工艺简单，成本较低，容易在实际中应用。

水相酶解法

水相酶解法是在水相萃取法的基础上，利用酶制剂将菜籽粕中的蛋白质充分溶出的提取分离方法。

其实验方法包括酶的筛选及处理参数研究、酶解后水浸提工艺研究和菜籽蛋白提取液超滤工艺三方面的研究。

水相酶解法的优点

?有利于蛋白质与油脂的析出，以提高蛋白质与油脂的得率，降低蛋白质产品的含油率，使蛋白质产品更耐贮藏。?无需改变常规水剂法制油的原有工艺路线，无需淘汰原有设备，只需在原有工艺中增加酶处理工序，购置相关超滤萃取设备即可上马。

双液相萃取

双液相萃取在去除菜籽饼粕中硫苷的同时，能够有效地提取菜籽饼粕中的蛋白质。

超滤、渗滤法

菜籽中50%以上蛋白质为白蛋白，这些蛋白极易溶于水、稀酸、稀碱和稀盐溶液，用工业规模难以沉淀。采用超滤（UF）、渗滤（DF）法，利用超滤膜对分离组的有选择性，截留分子较大（一般菜籽蛋白质为8 000~600 000μm）的各种蛋白质分子或相当粒径胶体物质，而溶剂和小分子物质透过，可将蛋白质浓缩、分离并保留在截留物中。此法是浓缩和提纯所有溶解蛋白较简便的方法，浓缩蛋白具有较佳的氨基酸组成。

3.展望

从菜籽饼粕中提取蛋白质的关键，是采用经济和环保的方法，脱除其中的抗营养因子和有毒成分，同时提高蛋白质的得率。随着膜分离技术、微波技术、超声波技术和食品酶技术的发展，将极大地促进油菜产业的发展，大大地提高菜籽饼粕的综合利用程度。例如，将提取菜籽蛋白和提取植酸相结合，得到多种有用的成分。预计菜籽蛋白将作为一种全新的优质蛋白质广泛应用在各个领域。

蛋白质的提取与检测

蛋白质的提取与检测第一节细胞总蛋白的提取及含量测定【基本原理】蛋白质含量测定法是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种经典的方法，即定氮法、双缩脲法（Biuret法）、Folin-酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有两种近年普遍使用起来的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）与二辛可宁酸法（BCA法）。值得注意的是，上述方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这几种方法测定有可能得出不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 Lowry法：蛋白质与碱性铜溶液中的二价铜离子络和使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与磷钼钨酸反应并产生深蓝色，在750nm有最大光吸收值。在一定浓度范围内，反应液颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比,由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。 Bradford法：蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250结合，使得染料最大吸收峰从465nm变为595nm，溶液的颜色由棕黑色变为蓝色。在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。

BCA （Bicinchoninic acid）法：二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子（Biuret reaction）并与 BCA相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在 562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关 0.118 0.05 0.154 0.1 0.213 0.2 0.283 0.3 0.329 0.4 0.404 0.5 第二节SDS-PAGE电泳【基本原理】

蛋白质提取与制备的原理和方法

蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。蛋白质类别和溶解性质白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。真球蛋白 : 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，则脂溶性占优势，如脂肪部分被包围于分子之中，则水溶性占优势。蛋白质的制备是一项十分细致的工作。涉及物理学、化学和生物学的知识很广。近年来虽然有了不改进，但其主要原理仍不外乎两个方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超离心、超滤等。由于蛋白质不能溶化，也不能蒸发，所能分配的物相只限于固相和液相，并在这两相间互相交替进行分离纯化。制备方法可按照分子大小、形状、带电性质及溶解度等主要因素进行分类。按分子大小和形态

木瓜蛋白酶的提取

木瓜蛋白酶的提取、分离纯化及其生物学研究综述及实验方法 13生物技术第二大组第二小组组员：王玓玥（组长）、王子贺、王思瑶、王宇涛、王守鑫、谭国栋一、研究背景：在经济飞速发展的今天，人们的生活水平已远远不只在于吃饱穿暖，食品的安全和营养问题受到人们越来越多的关注，绿色健康的生活也成为大家共同的追求，木瓜蛋白酶以它自身耐热及特殊结构等特点被广泛的用于食品行业，如何分离纯化得到高纯度低成本的木瓜蛋白酶则是人们现在研究的重点，本小组便也以此为研究主题展开实验。二、木瓜蛋白酶基本介绍：木瓜蛋白酶，又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，这种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时，酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观

为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。木瓜蛋白酶的最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI）为8.75；木瓜蛋白酶的最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。。另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白质的45%；（3）

蛋白质提取及纯化

蛋白质提取及纯化提取蛋白质的当天早晨去后把高速离心机和超高速离心机都打开冷却 1、前一天晚上用Resuspension Buffer重悬4L菌体，然后离心于4C保存，第二天使用。 2、用少量预冷的Resuspension Buffer重悬细菌，1 protease inhibitor tablets(EDTA Free)，1mM PMSF, 然后用玻璃Homogenizer做均一化处理，将总体积调至80ml； 3、High Pressure Homogenizer破壁，特别注意样品一定要在不加压力的情况下运行一个循环（2min）；然后1200bar，6min三个循环，整个过程冰水冷却； 4、DNaseI处理：加入2.5mg DNaseI，10mM MgCl2, 室温处理30min； 5、 11.000rpm，4℃，15min; then 11.000rpm，4℃，15min； 6、 1mM PMSF, 45.000rpm，4℃，90min; 7、用Resuspension Buffer洗两次以除去可溶性的蛋白质，然后预热分光光度计； 8、用3-4ml Binding Buffer重悬Membrane pellets，动作一定要轻缓，重悬后的总体积不超过8ml，取出300ul测定OD800和OD850(以OD850为准),测定时候是逐步稀释，每次吸光值小于1； 9、调整OD850≤30-50，在缓慢搅拌（速度一定要慢）的情况下逐滴加入30%的 LDAO使其终浓度达到0.5%，1mM PMSF，26℃黑暗条件下重悬1h，期间注意观察颜色变化； 10、45.000rpm, 4℃, 30min，注意观察颜色的变化以及沉淀是否发生明显的变化。 Charge and Equilibrate Resin (1)用蒸馏水冲洗柱子以除去20%酒精，注意不要用buffer，1ml/min，至紫外吸收和电导稳定； (2)用0.1M NiSO4 Charge Resin，1ml/min，10倍柱体积，尽量使得紫外吸收和电导稳定； (3)用蒸馏水冲洗，1ml/min，至紫外吸收和电导稳定；

胃蛋白酶提取的分离纯化

胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。关键词：胃蛋白酶分离纯化应用．生物提取法生产胃蛋白酶 1．1 工艺路线（自溶、过滤）（脱脂、去杂质）猪胃黏膜→自溶液→上清液（浓缩、干燥） →胃蛋白酶成品工艺过程（1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。（4）浓缩、干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。 2胃蛋白酶的分离技术有机溶剂法

可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。 2．2盐析法盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。美国专利（2，701,228）改进后，用锌盐沉淀胃酶。当母液含醇（或酮）在50%--55%、pH在—时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀，沉淀物为胃酶的锌盐，然后用金属螯合剂除去锌盐，得15000—16000倍活力的酶，收集率为%%。此法较上述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。底物亲和法底物亲和法是利用酶（胃蛋白酶）与其底物（酪蛋白）的亲和性，从胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在的乳酸缓冲液中充分结合，然后调pH至4（底物的等电点）沉淀底物和酶的结合物，随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中，添加低浓度的SDS将底物和酶分离，得到酶—SDS复合物，再进一步分离纯化。陈躬瑞（2001）成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了实验室分离，得率大约为30%。与传统的分离方法比较，此法具有简单高效的优点，为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用，同时具有较高的特异性。【2】透析法胃蛋白酶的分离过程中还经常用到透析法。该法是利用蛋白质大分子对半透膜的不可透过性而与小分子物质及盐分开的。由于透析主要是扩散过程，如果袋内外的盐浓度相等，扩散就会停止，因此要经常换溶剂，一般一天换2—3次。如在冷处透析，则溶剂也要预先冷却，避免样品变性。透析时的盐是否除净，可用化学试剂或电导仪来检测。【1】 3胃蛋白酶的纯化技术凝胶过滤法

大豆分离蛋白的提取

大豆分离蛋白的提取 ——紫苏摘要：本文综述述了大豆分离蛋白的碱提酸沉法、双极膜法、泡沫分离法的分离原理，并讨论了其生产中影响提取率的因素。关键词：大豆分离蛋白碱提酸沉法双极膜法泡沫分离法大豆蛋白含量较高而且营养丰富，含有8种人体必需氨基酸，且比例比较合理。目前大豆蛋白已成为一种重要的蛋白资源，特别是大豆分离蛋白含蛋白质90%以上，是一种优良的食品原料。目前大豆分离蛋白的生产应用较多的是以下几种： 1. 碱提酸沉法大豆分离蛋白的传统提取方法是碱提酸沉法，主要利用大豆蛋白在大豆蛋白在高pH时溶解度最大，在等电ｐＨ条件下溶解度最小的原理，使之凝聚沉淀。一般分3个步骤：弱碱萃取蛋白质、酸沉淀、喷雾干燥。如图[1] 影响等电沉淀的因素较多： ①原料——原料豆粕应是低温或闪蒸脱脂后的低变性豆粕。这种豆粕含杂质少，蛋白含量较高，蛋白变性程度低，适于大豆分离蛋白生产[2]。 ②水分——浸提时，加水量越多，蛋白质的提取率就越高；但是加水太多，酸沉时蛋白的损失量增高；加水太少，大豆蛋白的溶出率大大下降，还会增加后续各工序的难度。试验得出,浸提时脱脂豆粕与水的比例为1∶10~12最适合提取[3]。 ③pH——蛋白质的溶解度与浸提pH有很大的关系，pH太低的时候，蛋白组分解离; pH 太高，易发生“胱赖反应”，生成有毒物质。 ④温度——温度的高低对蛋白收率、纯度及色泽有显著影响。浸提温度过高，会使蛋白变性，而且粘度增加，分离困难，耗能提高[4]。经试验认为等电酸沉温度控制在40~45℃为宜[1]。 ⑤时间——一般来说浸提时间越长，蛋白的溶出率就越高。但一定的时间后，蛋白得率随浸提时间的延长而无显著的变化。生产中要综合考虑能源消耗、生产周期、工艺成本等各种因素来确定合理的时间[4]。 ⑥另外，当浆料粒度太细反而会使蛋白得率和浸提效果下降，同时增加了过滤分离的难度。加酸速度和搅拌速度控制不好容易出现虽到等电点,但蛋白质凝集下沉缓慢,上清液混浊[1]。 ⒉双极膜电解法双极性膜是一种新型离子交换复合膜,它通常由阳离子交换层和阴离子交换层复合而成,中间是亲水界面层,结构如图1所示[5]：双极膜由3层组成：阴离子交换膜和阳离子交换膜以及阴阳离子交换膜中间的亲水层。在电流作用下，水分子在双极膜上电离为H+和OH-，离子在电势的驱动下，通过膜选择透过阴离子或阳离子，导致溶液的pH值降低，达到大豆蛋白质的等电点而使蛋白质沉淀。这种方法不需要加入酸或碱调整蛋白质溶液的pH值，避免分离得到的大豆蛋白质中混入盐离子，并且可保护大豆蛋白质的功能性。[3]

蛋白质提取方法

蛋白质提取方法-------列举10种方法一、植物组织蛋白质提取方法（summer） 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清夜，样品制备完成。蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8）45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！二、植物组织蛋白质提取方法(summer) 三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。药品：提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！三、组织：肠黏膜（newinbio）目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达应用TRIPURE 提取蛋白质步骤：含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）倒转混匀，置室温10min 离心：12000 g，10min，4度，弃上清，加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE 用量）振荡，置室温20min 离心：7500g，5 min，4 度，弃上清重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2 次沉淀中加入100％乙醇2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀，1％SDS溶解沉淀离心：10000g，10min，4度取上清-20 度保存（或可直接用于WESTERN BLOT）存在的问题：加入1％SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了白色沉定，SDS 结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，

【1】生物样本中蛋白质的提取及测定(分子医学实验)

《分子生物学实验》实验报告实验名称：生物样本中蛋白质的提取及测定姓名：杰学号：3140104666 组别：同组同学：唐曦

带教教师：伟俞萍实验日期：2015年9月15日目录 1.原理： (3) 1.1生物样本中蛋白质的提取 (3) 1.2生物样本中蛋白质的测定 (3) 1.2.1 Lowry法 (3) 1.2.2 考马斯亮蓝法 (4) 1.2.3 紫外吸收法 (4) 2.操作步骤 (4) 2.1生物样本中蛋白质的提取 (4) 2.2生物样本中蛋白质的测定 (5) 2.2.1 Lowry法 (5) 2.2.2 考马斯亮蓝法 (5) 2.2.3紫外吸收法 (5) 3、实验结果 (6) 3.1 原始数据 (6) 3.1.1 Lowry法 (6) 3.1.2 考马斯亮蓝法 (7) 3.1.3 紫外吸收法 (7)

3.2 数据处理 (8) 3.2.1 Lowry法 (8) 3.2.2 考马斯亮蓝法 (9) 3.2.3 紫外吸收法 (10) 4.讨论： (11) 1.原理： 1.1生物样本中蛋白质的提取离体不久的组织，在适宜的温度及pH等条件下，可以进行一定程度的物质代谢。因此，在生物化学实验中，常利用离体组织来研究各种物质代谢的途径与酶系作用，也可以从组织中提取各种代谢物质或酶进行研究。但生物组织离体过久，其所含物质的含量和生物活性都将发生变化。例如，组织中的某些酶在久置后会发生变性而失活；有些组织成分如糖原、ATP等，甚至在动物死亡数分钟至十几分钟，其含量即有明显的降低。因此，利用离体组织作代谢研究或作为提取材料时，都必须迅速将它取出，并尽快地进行提取或测定。一般采用断头法处死动物，放出血液，立即取出实验所需的脏器或组织，除去外层的脂肪及结缔组织后，用冰冷的生理盐水洗去血液（必要时可用冰冷的生理盐水灌注脏器以洗去血液），再用滤纸吸干，即可用于实验。取出的脏器或组织，可根据不同的方法制成不同的组织样品。包括组织糜、组织匀浆、组织浸出液。由于动物肝脏细胞比较脆弱，易于破碎，故本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料，采用匀浆法法将其破碎，然后加入样品提取液使蛋白质溶解，用高速离心法弃去细胞碎片。收集上清液后可进行蛋白质定量分析。 1.2生物样本中蛋白质的测定 1.2.1 Lowry法 1921年，Folin发明了Folin-酚试剂法测定蛋白质的浓度，反应原理是利用蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸残基还原酚试剂（磷钨酸-磷泪酸）生成蓝色

菠萝蛋白酶提取方法的研究

菠萝蛋白酶提取方法的研究本文主要研究了以菠萝废弃物为原料,采用硫酸铵盐析法结合超滤浓缩法的技术从菠萝皮中提取菠萝蛋白酶。首先,在硫酸铵盐析分离提取菠萝皮浸提液中菠萝蛋白酶的过程中,实验研究结果表明,硫酸铵液体加入法要优于固体加入法；随着菠萝皮浸提液的pH值的增大,菠萝蛋白酶的酶活回收率先增大后减小,pH值为7时,得到的菠萝蛋白酶酶活回收率最大,为83.6%；随着硫酸铵浓度的增大,菠萝蛋白酶的酶活回收率先增大后减小,当硫酸铵的饱和度达到40%的时侯,菠萝蛋白酶的酶活回收率最大,为83.6%；在选定的实验温度范围内,随着温度的升高,菠萝蛋白酶的酶活回收率先增大后减小,20℃时菠萝蛋白酶的酶活回收率最大,为86.9%；随着盐析时间的增加,菠萝蛋白酶的酶活回收率先增大后减小,当盐析时间为60min时菠萝蛋白酶的酶活回收率最大,为89.2%。其次,在超滤法浓缩提取菠萝皮浸提液中的菠萝蛋白酶的过程中,实验研究结果表明,选择截留分子量为20KD的超滤膜对菠萝皮浸提液进行超滤,收集其截留液,酶活截留率可达94%,或者选择截留分子量为100KD的超滤膜,酶活截留率为10.3%,可收集透过液；随着离心分离转速的增加,菠萝蛋白酶的酶活回收率逐渐增大,当离心分离转速当达到8000rpm转速时,菠萝蛋白酶的酶活截留率不再发生变化,为89.3%；使用20KD的超滤膜时,随着操作压力的增大,超滤膜的渗透通量先增大后减小,当操作压力为0.35MPa时,渗透通量达到最大值为 5.57L·m-2·h-1；使用100KD的超滤膜时,随着操作压力的增大,超滤膜的渗透通量先增大后减小,当操作压力为0.25MPa左右时,渗透通量达到最大值为 7.69L·m-2·h-1；无论是未经过处理,还是经过处理的超滤膜,随着使用次数的增加,其本身的渗透通量都逐渐减小,同时,经超滤菠萝皮浸提液得到的蛋白酶活

大豆蛋白提取技术研究进展

大豆蛋白提取技术研究进展系别：食品工程系专业：食品科学与工程班级：食科13-2班学号：242013002003 姓名：陈亚林

摘要大豆蛋白产品分为三类，即大豆蛋白粉、大豆浓缩蛋白和大豆分离蛋白。大豆分离蛋白含有人体所必需的八种氨基酸,不含胆固醇，具有许多优良的食品性能，添加在食品中可以改善食品的品质和性能，提高食品营养价值。是一种重要的植物蛋白,在食品工业中得到了广泛的应用,是近年来的研究重点。其中,大豆浓缩蛋白的提取方法有稀酸浸提法、酒精浸提法和湿热浸提法。大豆分离蛋白有碱溶酸沉法、离子交换法、超滤膜分离法等。本文以研究方向和工艺改进方面为着力点解释大豆浓缩蛋白和分离蛋白这两种主要的提取方法的发展脉络。关键词大豆浓缩蛋白；大豆分离蛋白；稀酸浸提法；酒精浸提法；碱溶酸沉法；离子交换法；超过滤法；湿热浸提法大豆分离蛋白（soy protein isolate,SPI）是把脱皮大豆中的除蛋白质以外的可能性物质和纤维素、半纤维素物质都除掉，得到的蛋白质含量不低于 90%的制品，又称等电点蛋白。与大豆浓缩蛋白相比，生产大豆分离蛋白不仅要从低温脱溶豆粕中除去低分子可溶性糖等成分，而且还要去除不溶性纤维素、半纤维素等成分。其生产方法主要有碱溶酸沉法、超过滤法和离子交换法。一、碱溶酸沉法 1.提取原理低温豆粕中的蛋白质大部分能溶于稀碱溶液。将低温豆粕用稀碱溶液浸提后，用离心分离法除去原料中的不溶性物质，然后用酸把浸出物的PH调至4.5左右，蛋白质由于处于等电点状态而凝聚沉淀，经分离可得到蛋白质沉淀，再经洗涤、中和、干燥得到大豆分离蛋白。 2.提取工艺豆粕的质量直接影响大豆分离蛋白的功能特性和提取率，只有高质量的豆粕才能获得高质量和高得率的大豆分离。要求原料无霉变，豆皮含量低，残留溶剂少，蛋白质含量高（45%以上），脂肪含量低，NSI高（不低于80%）。豆粕粉碎后过40-60目筛。首先利用弱碱溶液浸泡低温豆粕，使可溶性蛋白质、糖类等溶解出来，利用离心机除去溶液中不溶性的纤维素和残渣。在已溶解的蛋白质溶液中加入适量的酸液，调节溶液的PH达到4.5，使大部分蛋白质从溶液中沉析出来，这时只有大约10%的少量蛋白质人仍留在溶液中，这部分溶液称为乳清。乳清中除含有少量蛋白质外，还含有可溶性糖、灰分和其他微量成分，然后将用酸沉析出的蛋白质凝聚体进行搅动、水洗、送入中和罐，加碱中和溶解成溶液状态。将蛋白质溶液调节到合适浓度，由高压泵送入加热器经闪蒸器快速灭菌后，再送入喷雾干燥塔脱水，制成大豆分离蛋白。

蛋白质提取综合性实验

生物化学综合性实验蛋白质的提取（沉淀法）和定量分析之鸡蛋中卵清蛋白的提取和定量测定一、实验目的研究盐析沉淀和等电点沉淀法的基本原理和技术。一、二、实验原理 1、沉淀法粗分离蛋白质[1][2] 沉淀法是分离纯化生物大分子物质常用的一种经典方法，可分盐析法、等电点沉淀法和有机溶剂沉淀法等。蛋白质分子表面含有带电荷的基团，这些基团与水分子有较大的亲和力，故蛋白质在水溶液中能形成水化膜，增加了蛋白质水溶液和稳定性。如果在蛋白质溶液中加入大量中性盐，导致蛋白质分子表面电荷被中和，水化膜被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出，这就是盐析作用。由于各种蛋白质分子表面的极性基团所带电荷数目不同，它们在蛋白质表面上的分布情况也不一样，因此，将不同蛋白质盐析出来所需要的盐浓度也各异，盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合液中的各个成分分步盐析出来，达到粗分离蛋白质的目的。盐析法是1878年Hammarster首次使用的，可用作盐析的中性盐有过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠、硫酸铵等，其中应用最广的是硫酸铵，硫酸铵在水中溶解度大，25℃可达4.1mol/L的浓度，化学性质稳定，溶解度的温度系数变化较小，价廉易得；分段效果较其他盐好，性质温和，即使浓度很高时也不会影响蛋白质的生物学活性。鸡蛋清的主要成分是球蛋白和白蛋白（卵清蛋白），球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。蛋白质的盐析作用是可逆过程，由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，因而可初步纯化蛋白质。等电点沉淀法是利用蛋白质在其等电点时溶解度最小来分离具有不同等电点蛋白质的方法。蛋白质是两性电解质，蛋白质分子的电荷性质和数量因PH不同而变化，蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀，因此，在其他条件相同时，它的溶解度达到最低点。卵清蛋白的等电点为4.6-4.8，而球蛋的等电点是5.1。 2、蛋白质的测定根据蛋白质的物理化学性质，测定蛋白质的方法有凯氏定氮法、紫外吸收法、Folin-酚法、考马斯亮蓝G-250染色法等。由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。由于核酸在280波长处也有光吸收，对蛋白质的测定有干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm处，如同时测定260nm的光吸收，通过计算可能消除其对蛋白质测定的影响，因此溶液中存在核酸时必须同时测定280nm及260nm之光密度，方可通过计算测得

提取蛋白的常规方法

1、原料的选择早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料， - 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation 因而对提取要求更复杂一些。原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间

总蛋白质提取方法

总蛋白质提取方法（1）在研钵中预先加入0.25 g PVPP交联聚维酮和少量石英砂，在电子天平上调零后称取5g 黄皮层组织样品，用液氮研磨至细粉末状，全部转移至50 mL压口离心管中；（2）依次加入30 mL 12.5% TCA/丙酮、2 mL 1 M DTT和1 mL 100 mM PMSF 苯甲基磺酰氟化物，充分振荡混匀后冰浴振荡提取15 min，然后4℃条件下13,000×g离心15 min（重复2～3次至沉淀基本变成白色）；（3）弃上清，轻轻磕散沉淀，加入30 mL 经-20℃预冷的0.1 M乙酸铵/甲醇溶液，充分振荡混匀后冰浴低速振荡提取15min，然后4℃条件下13,000×g离心15min；（4）弃上清，轻轻磕散沉淀，加入30 mL经-20℃预冷的丙酮，充分振荡混匀后冰浴低速振荡提取15 min，然后4℃条件下13,000×g离心15 min；（5）弃上清，-20℃条件下在吸水纸上倒置30 min除去残留丙酮；（6）轻轻磕散沉淀，依次加入15 mL 提取Buffer（700 mM蔗糖+ 500 mM Tris-base + 100 mM KCl）、15 mL Tris-饱和酚（pH 7.5）、2 mL 1 M DTT和1 mL 100 mM PMSF，充分振荡混匀后冰浴低速振荡提取30 min，然后4℃条件下5,000×g 离心30 min；（7）小心吸取上层深色酚相提取液转移至新的50 mL压口离心管中，加入20 mL 0.1 M 乙酸铵/甲醇溶液，轻轻颠倒混匀后-20℃静置3～6 h沉淀蛋白，然后4℃条件下13,000×g离心30 min；（8）弃上清，加入30 mL预冷甲醇，冰浴中轻摇5 min充分洗涤管壁及沉淀，然后4℃条件下13,000×g离心15 min；（9）弃上清，加入15 mL预冷丙酮，冰浴中轻摇5 min充分洗涤管壁及沉淀，然后4℃条件下13,000×g离心15 min；（10）弃上清，用预冷小药勺将所有沉淀轻轻刮下并小心转移至2 mL灭菌离心管中（冰浴），原管用2 mL预冷丙酮快速洗涤后一并转移至2 mL灭菌离心管中，然后4℃条件下13,000×g离心15 min；（11）弃上清，-20℃条件下在吸水纸上倒置30 min除去残留丙酮；

植物蛋白酶提取纯化工艺

植物蛋白酶提取纯化工艺生物工程09-2班陈福泉学号：3090343214 一、实验目的 1、了解植物蛋白酶常用的提取纯化方法的基本原理和基本操作； 2、掌握双水相和反胶束萃取的原理和操作步骤； 3、掌握蛋白质含量和蛋白酶酶活的检测方法二、实验原理植物蛋白酶常用的提取纯化方法有缓冲盐溶液提取、初步纯化的方法有有机溶剂法、乙醇粉法、丙酮粉法、盐析法、双水相法、反胶束萃取法等以pH6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为提取溶剂所得酶活力较高，最佳工艺为：以pH6.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液25℃提取2次，料液比1∶1；应用硫酸铵盐析及透析袋透析对粗酶液进行纯化，粗酶液再以60%硫酸铵盐析24h，透析袋（14000）低温透析12h，冻干；酶学性质研究表明：生姜蛋白酶以酪蛋白为底物其最适pH值为 6.0，30℃保温30min，酶活稳定。三、实验材料材料与试剂新鲜生姜、酪蛋白（化学纯）、考马斯亮蓝G-250、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸、硫酸铵、丙酮等试剂均为分析纯。 0.01%（w/v）考马斯亮蓝G-250溶液：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 90%vol乙醇中，加入85%正磷酸100mL，蒸馏水定容至1000mL。 0.5%酪蛋白溶液：称取0.5g酪蛋白，先用少量0.55mol/L碳酸钠溶液润湿，再加少量 0.02 mol/L pH7.5的磷酸缓冲液稀释，水浴中煮沸溶解，定容至100mL。四、实验步骤方法一：生姜蛋白酶提取液制备: 取定量新鲜生姜,切成小块后加入10 倍体积的pH 6. 0, 0. 2 mol/ L 磷酸缓冲液( 4 e ) , 于粉碎机中匀桨, 8 层纱布过滤后于4000 rpm 离心10 min, 吸取上清液, 加入高饱和度的( NH4) 2SO4 液使盐析体系中( NH4) 2SO4 终饱和度为60% , 4000 rpm 离心15 min。收集上层不溶物, 用少量pH 7. 50 的柠檬酸缓冲液溶解, 在4 e 下对同种缓冲液透析8 h。透析液定容, 即为生姜蛋白酶提取液。方法二：生姜蛋白酶的提取取外形完好、无机械损伤和腐烂、富含纤维的生姜，切成小块，与磷酸缓冲液（0.03mol/L，pH7.5，内含1 mmol/L EDTA和5mmol/L L-半胱氨酸）按料液比1：2打浆，所得浆液低速搅拌20m i n，搅拌过程中缓慢加入20％（m/v）固体硫酸铵，四层纱布过滤后，将姜汁4℃下静置2h，离心（4 800rpm，5min）去除沉

蛋白质提取与制备的原理和方法

蛋白质提取与制备的原理和方法蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。蛋白质类别和溶解性质白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。真球蛋白: 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如

2019-2020学年生物人教版选修1检测：专题5课题3血红蛋白的提取和分离

如课题3 血红蛋白的提取和分离 ----- 课堂对点训练-— KF TANG DUI DIAN XUN LIAN 题型一血红蛋白的提取与分离的原理 1 ?利用凝胶色谱法分离蛋白质的原理是() A ?蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小 B. 蛋白质相对分子质量的大小 C ?蛋白质所带电荷的多少 D.蛋白质溶解度的大小答案B 解析凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法，相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程长，移动的速度慢，相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，因此相对分子质量不同的蛋白质得以分离。 2?凝胶色谱分离法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是 () A ?改变蛋白质分子通过凝胶时的路径 B?吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度 C ?将酶或细胞固定在凝胶中 D.与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度答案A 解析凝胶的种类较多，但每一种凝胶内部都有孔隙。相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离，A正确。 3?如图能正确表示相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程的是

答案B 解析相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程长，移动的速度慢；相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，B正确。 4?下列有关电泳的叙述，不正确的是（） A ?电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B. 待测样品中各种分子的形状、大小及带电性质的差异等会影响其在电泳中的迁移速度 C. 进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动 D. 常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳答案C 解析电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，在电场的作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，A正确，C错误；由于待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，会使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离，B正确；琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是两种常见的电泳方法，D正确。 5. SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入的SDS的作用是（） A .增大蛋白质的相对分子质量 B. 将蛋白质分解成单个氨基酸 C. 掩盖不同蛋白质分子间的电荷差别 D. 增加不同蛋白质分子间的电荷差别答案C 解析SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入SDS的目的是使蛋白质完全变性，解聚成单条肽链；同时SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，C正确。 6. 下列有关透析的叙述，错误的是（）

胃蛋白酶提取的分离纯化

胃蛋白酶提取的分离纯化 IMB standardization office【IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C】

干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。 2胃蛋白酶的分离技术有机溶剂法可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。 2．2盐析法盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。美国专利（2，701,228）改进后，用锌盐沉淀胃酶。当母液含醇（或酮）在50%--55%、pH在—时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀，沉淀物为胃酶的锌盐，然后用金属螯合剂除去锌盐，得15000—16000倍活力的酶，收集率为%%。此法较上述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。底物亲和法底物亲和法是利用酶（胃蛋白酶）与其底物（酪蛋白）的亲和性，从胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在的乳酸缓冲液中充分结合，然后调pH至4（底物的等电点）沉淀底物和酶的结合物，随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中，添加低浓度的SDS将底物和酶分离，得到酶—SDS复合物，再进一步分离纯化。陈躬瑞（2001）成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了实验室分离，得率大约为30%。与传统的分离方法比较，此法具有简单高效的优点，为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用，同时具有较高的特异性。【2】