菌种保存实验过程
菌种保存实验过程文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）
菌种保存
一、保存时间：2014.3.2
二、待保存菌种：
KJNN-6(400mg/L)、KJSN-3(400mg/L)、KJNN-1(400mg/L)、KJSW-4(350mg/L)、KJNN-
4(400mg/L)、KJNN-3(400mg/L)、KJNN-2(白)(400mg/L)、KJSW-5(350mg/L)、KJSN-
2(400mg/L)、KJNN-5(400mg/L)、KJSW-7(350mg/L)、KJSW-2(400mg/L)、LJX1、KJSW-
3(350mg/L)、KJSN-1(400mg/L)、KJSW-8(400mg/L)
三、保存材料与工具：50%甘油、EP管、镊子、试剂盒等
四、保存菌种原理
①由于纯甘油十分粘稠，很难定量，一般配成终浓度50%的水溶液，高压灭菌后室温保存即可。使用时按50%甘油:菌液=1:1混合均匀，然后迅速冻结。
②加甘油是为了避免水结冰产生冰晶损伤细菌
③细菌具有容易变异的特性，在保存过程中需使细菌的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使细菌代谢能力降低的重要因素。
五、保存菌种步骤：
①将待使用的镊子、EP管、枪头放入高压灭菌锅灭菌
②在超净工作台将待保存的菌种、实用工具紫外表面灭菌
③用酒精清洁完手后，在酒精灯上灼烧镊子消毒
④用镊子取10支EP管于试剂盒（防止碰到EP管口）
⑤用移液枪取500μL50%甘油于EP管，另取500μL菌种于EP管
⑥将EP管取出（防止碰到EP管口）盖好盖子，盖上写明菌种类型及保存人,震荡均匀后装袋
⑦将记录菌种类型、保存人、日期的字条放入小袋中
⑧所有菌种袋装入一个大袋中进行统一保存，贴上标签，写明类别并置于-20℃冰箱保存（注意：操作过程中手及衣袖不要在试剂盒上EP管上晃动）
六、后期检测方法
一定时间后（如三个月），取出一套冻存菌种,37℃水浴中快速解冻,然后进行平板划线将菌种复苏,检测细菌的存活情况,并观察菌落形态、菌体形态,检测有关生化指标,比较各菌株的生物学特性是否发生变化。
七、预期结果
观察在存活期内,各菌株的形态、染色特性、生化反应等均无明显变化,也就是说这些菌在保存期内未发生变异。
微生物实验报告(微生物形态观察、分布、灭菌消毒)
微生物实验 微生物实验 细菌形态观察 细菌分布 消毒灭菌
细菌形态观察 一、实验目的 1.掌握光学显微镜（油镜）的使用及日常维护 2.掌握细菌的三种形态 3.掌握临床常见细菌的形态及染色 4.掌握细菌的特殊结构 5.了解支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体及真菌的结构特点 二、实验原理 1. 普通光学显微镜（油镜）的使用 1. 在标本欲检部位滴一滴香柏油，然后转换油镜头 2. 从侧面观察并慢慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时 停止转动，以免碰撞玻片，用双眼观察目镜，同时调节细调节器，直至细菌清晰 3. 根据需要调节显微镜亮度 2. 普通光学显微镜的维护 1.移动显微镜时，用右手持镜壁，左手托镜座，平端于胸前 2.油镜用毕后，要立即用擦镜纸擦去香柏油；再用滴有二甲苯的擦镜纸擦油镜头；最 后，用干净擦镜纸将镜头上的二甲苯擦去，以免损伤油镜头 3.镜头擦净后，降低接物镜并将其转成八字形，罩好镜罩放入柜内 4.做好使用记录 3．微生物知识 1．细菌按形态分类： 球菌：球形（包括双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌、链球菌等） 杆菌：杆状（包括单杆菌、双杆菌、链杆菌、分枝杆菌、双歧杆菌等） 螺旋菌：螺旋状（包括螺旋菌、弧菌等） 2．细菌的基本结构 细胞壁、细胞膜、细胞质、核质、核蛋白体 3．细菌的特殊结构 荚膜：如肺炎双球菌 鞭毛：又分单毛菌、双毛菌、丛毛菌、周毛菌。如：变形杆菌为周毛菌 菌毛 芽胞：如破伤风梭菌、炭疽芽胞杆菌、肉毒梭菌 4．微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称，包括原核类、真核类和非细胞类。 原核类：细菌、放线菌、蓝藻、衣原体、支原体、立克次氏体 真核类：真菌、原生动物、显微藻类 非细胞类：病毒、亚病毒 5．真菌 单细胞：圆形、芽生孢子。如：酵母菌
菌种活化保存法
附件： 新菌株（乳酸菌）斜面培养法 1.购买新菌株（安瓿瓶装冻干粉） 2.菌种管开启方法一：按购买菌种上的说明进行操作即可。 3.菌种管开启方法二（本次实验方法均在水平层流台进行）： 3.1水平层流台开启风机跟紫外灯，半个小时 3.2 用浸过75 ％酒精的脱脂棉擦净菌种管。 3.3将菌种管顶端在火焰上加热，注意避免直接加热菌体或加热过度。 3.4 将无菌水滴至加热过的菌种管顶端，使玻璃开裂。 3.5 用锉刀或镊子敲下已开裂的菌种管的顶端。 4.用玻璃三角瓶121.0℃灭菌约10-30ml的生理盐水20分钟 5.将开封后的冻干粉倒入生理盐水中，摇匀 6.用接种环沾取生理盐水，转接与MRS培养基平板上，在36.5℃中恒温培养48-72小时 后，得到二代菌。 7.此时可以使用二代菌进行菌株扩大培养，或对其进行保存菌种。 注意事项： 1 菌种活化前，请将冻干菌种管冷藏保存在5 ℃-10 ℃环境下。 3 菌种经过冷冻干燥后，生长延迟期较长，需连续两次继代培养才能正常生长。 4 菌种活化及使用过程应做好安全防护工作。 第二代第2 代)观察是否具有典型的菌落形态,然后挑取单一的纯菌落,进行革兰染色、镜检,观察其染色特征及菌体形态,并进一步做生化鉴定实验以确定菌种。第三代为工作用菌。 乳酸菌菌种保存法 方法一：斜面保存法（略） 方法二：20%甘油保存法 器材：冻存盒、冻存管(2ml装)、甘油（丙三醇）、MRS肉汤培养基、1ml移液器及枪头、酒精灯、水平层流台、高压灭菌锅 操作步骤： 1.在水平层流台中用接种环挑取所需保存的的菌株放于灭菌过的MRS肉汤培养液，进行 36.5℃恒温培养48小时 2.配制40%的甘油，用移液器移取0.5ml于冻存管中，放于冻存盒 3.用报纸将冻存盒包扎好，放于灭菌锅中灭菌（121.0℃、20Min） 4.在水平层流台中，用移液器移取0.5ml培养后的MRS肉汤培养液加入到冻存管中，拧 紧盖子，摇匀，标识。 5.在冻存盒外也做好操作人，日期，所保存的菌种等信息标记 6.将冻存盒放于保鲜袋中，放入冰箱的冷冻室层进行保存，一般可以保存至两三年。 7.若是需用，那一冻存管样进行培养即可。 实验室菌种激活方法
菌种鉴定手段
菌种鉴定手段 （1）常规鉴定 常规鉴定内容有形态特征和生理生化特征。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应等。 （2）BIOLOG碳源自动分析鉴定 BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。 该系统已获美国FDA认可，已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。 BIOLOG是一种微生物菌种快速鉴定系统，涉及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微生物。 （3）分子生物学鉴定 应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。CICC拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学实验室，配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。目前CICC可采用核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科学的鉴定结果。（4）API细菌数值鉴定系统
API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种生化反应，目前已可鉴定超过600种的细菌。鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参比，得出鉴定结果。 CICC目前可应用API 50CH系列、API 20 E系列、API Staph系列对乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）和相关细菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）和库克菌属（Locuria sp.）进行鉴定。 （5）功能性分析及功能基因 CICC不断致力于工业微生物资源的功能及其功能基因研究，目前通过木聚糖酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、β-甘露聚糖酶等功能基因的克隆进行菌种产酶的功能性分析。应用gyrA、atpD及pheS等看家基因于微生物菌种鉴定，在某些种、亚种、株间有较好的分辨效果。 （6）RAPD、SSCP技术 随着微生物菌种应用的进一步发展，在食品安全管理、生物产品出口认证、知识产权保护等行业需求日益增加，微生物菌种株水平的鉴别技术成为一个迫切需要解决的问题。 CICC采用随机扩增多态性DNA（Randomly amplified polymorphism DNA，RAPD）技术和单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）技术对微生物菌株进行鉴别。如采用RAPD技术能够对同一菌种原始菌株与诱变菌株进行鉴别，对诱变菌株知识产权保护具有重要意义；采用SSCP技
真菌学实验报告
真菌学实验报告 一.实验目的： 1.1了解真菌形态的基本特征。 1.2掌握丝状真菌制片方法。 1.3掌握内生真菌的分离方法 1.4掌握真菌的鉴定方法。 二.前言： 真菌广泛分布于地球表面,从高山、湖泊到田野、森林，从海洋、高空到赤道、两极，到处都有真菌。真菌虽然不在空气中生长繁殖，但它的孢子却成群的漂浮在天空，只要稍微注意你会发现人类原来生活在真菌的汪洋大海中。 当今世界，生物技术已迈入世界经济的支柱产业，真菌学在生物技术的大潮中得到了长足的发展。真菌是原始的真核生物，具有广泛的多样性，真菌生长我繁殖迅速，在很短的时间内就可以得到比动物和植物多得多的后代，能够直接、快速地进行遗传性状分离的
分析。因此，真菌可以作为研究基础生物学过程中的一个重要工具，真菌基因的多样性以及真菌分子生物学的发展，为生物技术产业提供了一个广阔的天地。 植物的生长环境直接影响内生真菌的生物多样性，植物物种的年代越久远，其生物内生真菌的多样性越丰富：抗病原性能越强的植物，其所含的内生真菌具有抗菌活性的可能行就越大；其所含的内生真菌有可能产生与植物相同或相似的抗菌无知或产生抗菌活性物质可能参与了药用植物的抗菌过程，本实验通过植物病原真菌和G+、G-细菌的抑制实验发现茎，根，花，种子或果实内生真菌的代谢产物具有不同程度的抑菌能力，并且对G+、G-有普片遍的抑菌作用。研究和开发内生真菌的寻找新的抗菌活性物质具有广泛的应用前景。 三.材料与方法： 3.1.1材料： 在校园内采集银杏、喜树、桂花树样品包括叶、茎、根、花、种子或果实。 3.1.2.药品与试剂： 葡萄糖、蛋白胨、KH2P04·3H2O、MgSO4·7H2O，马铃薯、琼脂。孟加拉红，青霉素，链霉素，甲基蓝，蛋白胨，酵母膏，蔗糖，磷酸盐，葡萄糖，琼脂条，无菌水等。消毒剂：75%的乙醇，0.1%升汞（HgCl2），次氯酸钠溶液（含活性氯10%），30%双氧水。双
实验室菌种的使用和管理【内容充实】
xxx食品检测中心作业指导书 1.目的 规范实验室菌种的收集、使用、保管程序；确保实验室的安全。 2.范围 本管理细则适用于实验室菌种的使用和管理。 3.职责 3.1菌种保管员：按照本指导书做好菌种的收集、转种、使用、保存和发放以及销毁工作。 3.2科室负责人：负责监督菌种的使用及管理。 4.管理细则 本实验室保存的菌种仅包括一部分致病性较弱的三类细菌、一部分无致病能力的普通细菌和常见真菌。不包括病毒、螺旋体、衣原体、立克次体；保存的菌种主要用于各类培养基、检测试剂的性能测试和质量控制。 4.1在本实验室保管的菌种名 4.1.1保留工作菌种：大肠杆菌ATCC25922、鼠伤寒沙门氏菌50013、福氏志贺氏菌2a ATCC12022、副溶血性弧菌200904-1、金黄色葡萄球菌ATCC25923、表皮葡萄球菌ATCC12228溶血性链球菌23310、铜绿假单胞菌10211、普通变形杆菌，克雷伯氏杆菌，小肠结肠炎耶森氏菌ATCC 23715 、单核增生李斯特菌ATCC19111、枯草芽胞杆菌ATCC6633b 、蜡状芽胞杆菌A TCC11778、白色念珠菌A TCC10231、酿酒酵母ATCC9763、黑曲霉菌、展青霉菌、黄曲霉菌。 4.1.2常规检测,科研分离得到的有保留价值的三类/四类菌种根据需要可继续保留；如果在食品中分离到二类/一类菌种,及时送上级单位进一步鉴定,并按规定立即销毁。本实验室不保存一类、二类菌种。 4.2 菌种的保管 4.2.1实验室菌种保存于专用的菌种室。 4.2.2菌种保管员及科室负责人双人双锁负责保管菌种。 4.2.3使用菌种需提出申请、经科室负责人批准后，向菌种保管员领用。 4.2.4菌种应按规定的时间定期转种，一般每转种3代做一次鉴定，如发现污染或变异应及时处理。 4.2.5保管人员工作变动时应作好交接工作。 4.3 菌种的使用和保存 4.3.1菌种的类别 4.3.1.1实验室内的标准菌种根据用途不同，分为储存菌种、传代用菌种和工作用菌种。 ①储存菌种：以冷冻干燥保藏为主，用于菌种的长期保存，一般是从菌种保藏中心或专业实验室购买得到的标准菌株，用符号S表示。一般可保存5年。 ②传代用菌种：采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡覆盖保藏法，用于菌种的传代，用符号G 表示。甘油冷冻管保藏法一般可保存2年； ③工作菌种：保存于半固体内或琼脂斜面培养基中，作为工作用菌种，用符号W表示。一般可保存1～2个月。 4.3.1.2实验室从样品中分离得到的菌株用符号Y表示。
菌种保藏的主要方法
菌种保藏 （一）、菌种保藏的目的 微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退，并有可能使优良菌种丢失。菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。 （二）、菌种保藏的原理 无论采用何种保藏方法，首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次，应根据微生物生理、生化特点，人为地创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。 （三）、菌种保藏的方法 1、斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右，无芽孢的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4℃冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。这一改进可使菌种的保藏期延长。该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。 2、石蜡油封藏法 此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端lcm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。 由于液体石蜡阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，而且又防止了水分挥发，使培养物不会干裂，因而能使保藏期达1～2年，或更长。这种方法操作简单，它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等，对霉菌和酵母菌的保藏效果较好，可保存几年，甚至长达10年。但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差，尤其不适用于某些能分解烃类的菌种。 3、砂土管保藏法
菌种鉴定方法
1. 菌落形态观察 观察菌落的大小、形状、隆起度、边缘、表面性状、颜色与透明度、质地和干湿度。 2. 革兰氏染色 按照革兰氏染色方法进行制片、初染、媒染、脱色、复染、干燥、镜检；干燥后，用油镜观察。 3. 鞭毛染色 挑取18~30 h新鲜平板培养物制备菌悬液，制片，室温自然干燥。滴加硝酸银染色A液覆盖3~5 min，用蒸馏水充分洗去A液，再滴加B液染色约1 min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。自然干燥后用油镜观察。菌体呈深褐色，鞭毛显褐色。 4. 糖类分解试验 将被检菌接种于糖发酵培养基中，37℃培养2－3天。如果培养基变黄，说明产酸；如变黄的同时，还有气泡，说明既产酸又产气。培养基仍呈蓝色，说明未产酸。选取木糖、葡萄糖、半乳糖和蔗糖。 5. 吲哚（靛基质）试验 将待检菌种接种于邓享氏蛋白质的胨溶液中，37℃培养1－2天。于培养液中加入戊醇或二甲苯2－3ml，摇匀，静置片刻后，沿管壁加入试剂2ml，如出现红色沉淀，表示为阳性。 6. 淀粉水解试验 将LB琼脂加热融化，使冷到50℃，加入淀粉溶液，混匀后，倾注平板。将细菌划线接种于平板上，37℃培养24小时，生长后取出，在菌落处滴加革兰氏碘液少许，培养基呈深蓝色，能水许解淀粉的细菌菌落周围有透明环。 9. V－P试验 将被检菌接种于试验培养基中（葡萄糖、K2 HPO4、蛋白胨各5g，溶于1 000ml 水中，分装于试管中，0.075MPa灭菌10分钟），培养2－7天后，于培养物中加入1ml 10％的NaOH，混匀，再加入3－4滴2%氯化铁溶液。数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性。 10.甲基红（M.R）试验 接种细菌，于37℃培养2－7天后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液（0.1g 甲基经溶于300ml 95%乙醇中，加蒸馏水至500 ml），如呈红色，表示阳性。 11. 柠檬酸盐利用试验 将被检菌接种到Simmons固体柠檬酸盐培养基上，37℃下培养2－4天，能利用柠檬酸盐的细菌表现为有细菌生长，培养基变为蓝色，不能利用柠檬酸盐的细菌不生长，培养基不变色。 12. 硝酸盐还原试验 将被检细菌接种于硝酸盐培养基中，37℃培养1－2天，每管中先加入甲试剂0.1ml，再加乙试剂数滴，如出现红色，表示阳性。 13. 接触酶试验 将1ml 3%的H2O2倾注于生长物（菌落或菌苔）上，有气泡（O2）发生者为阳性。也可于清洁小试管中加少量H2O2（30%），再用清洁无菌的细玻棒（或火焰封口的毛细管或镍铬做成的接种环）醮细菌少许，插入H2O2液面下，有气
微生物室菌种和毒种保管流程
检验科 微生物实验室菌种、毒株管理规定与流程 1．目的 对本实验室菌种、毒种的申购、保存、保管、领用、处理等各个环节实行有效的监督控制，防止意外事故发生，确保疾病预防与控制检验业务及科研教学工作。 2．适用范围及菌种、毒种专职管理人员 适用于本科微生物实验室菌种、毒株的管理； 菌种、毒种专职管理人员： 纽琼xx 3．职责 3．1微生物实验室负责菌、毒种的出入库保管、保存及处理等日常管理。 3．2科室指定纽琼、刘芹2名菌种、毒种库管理人员承担菌、毒种日常管理。 3．3科室负责人负责一、二类菌、毒种的出入库和向上级索取及对下级发送的审核。 3．4技术管理层批准本实验室一、二类菌、毒种的出入库和向上级索取及对下级发送的审批。 4．工作程序 4．1报送及入库 4．1．1当微生物实验室检出菌、毒株应及时报送市疾病预防控制中心。 4．1．2新发现的菌、毒种，要做好原始记录，逐级报送进行复
核确认，报送时xx、xx2人参加。 4．1．3一、二类菌、毒种入库前，科室审核，技术管理层批准后入库 4．1．4个人不得擅自保留菌、毒种，必须由科室进行统一编号、登记入库管理 4．1．5菌、毒种入库时，纽琼、刘芹2名菌、毒种保管人员须认真做好菌毒种的编号、登记工作。 4．2日常管理 4．2．1保管人员由纽琼、刘芹2名检验人员组成。 4．2．2菌、毒种入库时，保管人员应及时验收，统一编号，填 写《菌、毒种登记表》 4．2．3严禁随意将菌、毒种置于非菌、毒种专用保存场所，应 做到三专（专室、专柜、专锁）。 4．2．4菌、毒种库由2名保管人员双锁管理，铁门与锁必须牢固有效，发现损坏须及时报修。未经各科室负责人同意，不得擅自将钥匙委托他人代管。 4．2．5菌、毒种保管人员应定期对库内温度、湿度、通风及冰箱、冰柜等菌、毒种保藏设备运转情况进行检查，并做好记录。 4．2．6菌、毒种保管人员根据菌、毒种的保存期限，及时通知 分管病种的检验人员进行传代，定期鉴定，并详细记录在《菌、毒种登记表》 4．2．7菌、毒种保管人员发现菌、毒种发生变异和死亡，应及 时向科室负责人报告，并填写《菌、毒种登记表》。科室须将变异及死亡的一、二类菌、毒种通报技术管理层。 4．3索取、领用和发放
菌种保存方法-
菌种保存方法： 一.菌种保藏方法大致可分为以下几种： 1．传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。 2．液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3．载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4．寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5．冷冻保藏法 可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。常用的有甘油菌保存： 取灭过菌的1.5ml EP管，按照60%—80%甘油的加入量，保存零下80度。例：取37°培养过夜的菌液2-4ml甘油6-8ml，充分混匀后分装于1.5ml EP管中，置于-80°冰箱即可。 6．冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。 有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。二.常用的器材 所要保存的微生物； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙； 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。 三.各操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 1．斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、
细菌鉴定方法
1.2.1 形态学特征 按照东秀珠和蔡妙英编《常见细菌系统鉴定手册》（1999），中科院微生物所编著《一般细菌常用鉴定方法》（1978）的方法进行鉴定。芽孢杆菌属鉴定到种，参照了蔡妙英等译《芽孢杆菌属》（1980）的方法。 （1）革兰氏染色：挑选少许菌苔，涂布于干净玻片的蒸馏水中，风干固定，结晶紫染色（结晶紫2g，草酸铵0.8g，95%乙醇20 ml，加水至100 ml）1min，水洗后碘液（碘1g，碘化钾2g，水300 ml）作用1min，水洗，脱色，用番红O 液染3min，水洗，风干，光学显微镜观察。 （2）鞭毛染色：将16~24h菌龄的菌苔在载玻片上的水滴中轻蘸几下，将玻片倾斜，使菌液缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。干燥后滴甲液（丹宁酸5g，FeCl3 1.5g，15%福尔马林2ml，1%NaOH 1ml，蒸馏水100 ml）染6~10min，水洗，干燥后，用乙液（2%AgNO3溶液）加热复染30min，蒸馏水冲洗，干燥，镜检，菌体为深褐色，鞭毛为褐色。 （3）运动性：半固体琼脂穿刺法，将菌种接在可使鉴定菌生长良好的培养基中，其中含0.3~0.6%的琼脂。适温培养，运动性可用透射光目测，如生长菌只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表明鉴定菌无运动性；如生长菌由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状，则表示鉴定菌有运动性。 （4）芽孢染色：孔雀绿染色法。按革兰氏染色涂片后，用饱和的孔雀绿水溶液（约7.6%）染20 min，水冲洗后在用0.5%番红O复染20~30s，水洗，吸干，镜检。芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。 （5）抗酸染色：常规涂片，石碳酸复红（10%碱性复红乙醇饱和液10 ml，5%石碳酸水溶液100 ml）加热染色5 min，倾去染液用酸性乙醇脱色，吕氏美蓝（2%亚甲基蓝乙醇饱和液30 ml，0.01%KOH 100 ml。）复染2min，水洗，吸干，镜检。 （6）荚膜染色：在载片一端滴一滴无菌水，取少许菌苔在水滴中制成悬液。取一滴墨汁与菌悬液混合，并用另一载片之一端将此水滴在载片上刮成薄膜风干。用纯甲醇固定1min，加0.5%番红O液数滴滴于涂片上，冲去残余甲醇，并染30s，然后倾去染液，立即吸干，镜检。 1.2.2 培养及生理特性 （1）菌落形态：用划线法将菌种接在平板培养基上，适温培养1~2d，出现单菌落开始观察，包括形状和大小，边缘，表面，隆起形状，透明度，菌落和培养基的颜色等。 （2）生长温度和耐热性：将菌种转接到几支试管中，分别在不同温度下培养，每处理2管，目测生长情况。
实验室菌种管理规程
实验室菌种管理规程 目的：保证菌种合理、有效地使用和保存，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，保证实验室和社会的生物安全。 职责：主管负责菌种的出入库保管、保存、分发，组员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 范围：本规程适用于实验室菌种的管理，包括菌种的保存、传代、使用及销毁等。 1菌种的保存 工作用菌种的保存 工作用菌种采用平板低温保存法。将菌种接种在适宜的固体培养基上，待菌生长充分以后，转移至2?8C冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间为 1 周，超过该期限前挑取单菌落重新于琼脂平板划线活化，若菌落活力下降则从-80 C冰箱中取用甘油冷冻管。 传代用菌种的保存 采用甘油冷冻管保藏法。 甘油冷冻管保存法 用无菌接种环轻轻刮平板上的单菌落并接种至适宜的液体培养内，置 于适宜的培养条件下培养，菌液充分振荡后取适宜体积加入到已灭菌的冷冻管内，再加入等体积的无菌甘油（浓度40%），即为20%甘油菌悬液，轻轻振摇，使内容物充分混合，在-80 C冷冻条件下保存，保存期限为3年。 每个菌株保存至少30 个无菌冷冻管。使用时，取出一支放至室温，接种增菌
培养或接种至琼脂平板复苏，挑取纯菌落传代或工作用。 2菌种的传代 工作用菌种的传代 当工作用菌种代数小于 5 时，在规定保存期限内，可直接用上一代工 作用菌种转接下一代工作用菌种。取在冰箱2?8 C保存的工作用菌种用普通琼脂平板传代，并将新传代的培养物替代原有的菌种，作为工作用菌种。 也可取用“甘油冷冻管保藏法”保存的菌种，进行复苏，直接作为工作用菌种。菌种每 1 周传代一次，当超过 5 代，须用“甘油冷冻管保藏法”保存的原始菌种传代。 传代用菌种的传代 首先划线接种确认，根据日常检验工作的需要量，挑取纯菌落转接平 板，作为工作用菌种；同时，结合菌种的代数和最长保存期限，挑取纯菌落制成菌悬液，按“”的方法制备甘油冷冻管数支，作为传代用菌种。 传代时注意事项 无菌操作，使菌株不死亡，不污染、不丢失。同时实验人员也要采取有效的预防措施进行自我保护，如工作时必须穿工作服，佩带无菌手套，实验完成以后消毒实验进行的区域、实验仪器和器具。如发生意外，如菌种泄漏或人员受伤，应立即向主管报告以便及时进行处理。 3菌种的保管 实验室全部菌种都应由菌种负责人记录在册，并输入电脑以电子版形式存 档，以便查找。菌种上应贴上明显的标签，标明名称、培养基、保种人、日期、编号等。菌种设专人加锁保管，并对所保存的菌种建立《菌种保存、领用登记台账》（附表3）。 菌种的定期检查 在菌种的保存期间，应每天检查保存菌种冰箱的温度、菌种管的塞子是否松动或生霉，如有异常应及时处理。
真菌学实验指导
本课程，本课程是大学本科生物技术、生物科学专业的选修课程。介绍真菌分类现状、分类方法（包括传统与现代分类方法的比较）、分类依据及其原则。本课程的教学不限于介绍研究的成果，重在介绍分析和解决问题的方法，以培养学生分析问题和创新的能力。所以在理论学习的同时开设综合性实验，培养学生观察、分析和动手能力。基本掌握真菌分离、鉴定的方法，并应用于真菌其它领域的研究。 本指导书适用于生物技术和生物科学专业。
1、实验：内生真菌的分离及鉴定 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????3 2、实验报告基本内容要求 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????7 3、实验报告格式????????????????????????????????????????????????????????????????8
实验内生真菌的分离及鉴定 实验学时：18 实验类型：综合 实验要求：选修 一、实验目的 1.了解真菌形态的基本特征。 2.掌握丝状真菌制片方法和真菌鉴定方法。 二、实验内容 采集植物样品包括叶、茎、根、花、种子或果实，然后对分离样品的内生真菌，并进行形态和分子生物学方法的鉴定。 三、实验原理、方法和手段 （一）实验原理 根据真菌的形态特征和ITS序列等分子证据对分离到真菌进行归类和鉴定。 （二）实验手段和方法 1、内生真菌分离纯化方法 1.1样品的表面消毒及预处理 分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自来水下洗净。 老树皮用75%酒精进行表面消毒后，用镊子取出，于酒精灯上烧灼15秒至表面焦糊，切成1×1cm2大小置于PDA固体培养基上。 对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒： 75%的酒精漂（浸）洗2-3min→无菌水冲洗4-6次→0.1%升汞不同的消毒时间（共设置7个梯度）→无菌水冲洗4-6次→用灭菌滤纸吸干多余水分→无菌刀片将材料切成小块 将根、茎的表皮、韧皮部、木质部大致分开，并切成0.5×0.5cm2大小。将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。 灭菌时，沥干的植物材料转放到烧杯中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻
设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定 以及保藏技术
设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定以及保藏技术 一．实验目的 1.学习大肠菌群分离纯化、鉴定的原理。 2.掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。 3.学习掌握菌种保藏的原理和方法。 二.实验原理 菌种的分离纯化 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1.涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。 2.平板划线法 最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。 大肠菌群的培养鉴定 大肠菌群能在乳糖胆盐液体培养液中生长，并且产气产酸，使培养液变色。还能在伊红美兰固体培养上生长，形成黑紫色的菌落，有的还有金属光泽。其他病原菌的菌落呈粉红色。再做镜检观察是无芽孢的革兰氏阴性杆菌（呈红色）。即可鉴定是有大肠菌群的菌存在。 菌种保藏 菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。 保藏菌种一般是选用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要创造一个低温；干燥；缺氧；避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，从而达到长期保存的目的 三.实验器材 1.菌种：污水中的大肠菌群、酵母菌和霉菌 2、培养基：乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、麦芽汁固体斜面培养基 和马铃薯固体斜面培养基。 3.器材：接种环、安培瓶、干燥器、冰箱、产气管、试管、培养皿、无菌平皿、无菌玻璃涂棒移液管、电炉、双目显微镜、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅、恒温干燥箱等。 4.试剂：革兰氏一(草酸铵结晶紫)、革兰氏二(路哥氏碘液) 、革兰氏三（95%乙醇）、 革兰氏四（蕃红）；试剂：医用液体石腊（比重0.83～0.89）。 四．试验方法及步骤 1.大肠菌群的分离纯化 第一天 a．涂布平板法：将已熔化的营养琼脂培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的含大肠菌群的污水滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，置培养箱中37℃培养24小时。经培养后挑取单个菌落。 第二天 b．平板划线法：经培养后挑取单个菌落，接种环以无菌操作沾取少许菌落，在无菌伊红美兰琼脂培养基平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果
菌种保存方法
菌种保存方法 未知 微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。 保藏方法大致可分为以下几种： 1．传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。 2．液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3．载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4．寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5．冷冻保藏法 可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。 6．冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水 分（真空干燥）。
有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。 三、器材 细菌、酵母菌，放线菌和霉菌； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙； 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。 四、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。 1．斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。 2．液体石蜡保藏法 （1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。 （2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。 （3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准（图Ⅶ-12），使菌种与空气隔绝。
实验12-微生物菌种常用简易保藏法
实验15 微生物菌种保藏方法 一、实验原理 为了保持微生物菌种原有的各种优良特征及活力，使其存活，和丢失，不污染，不发生变异。根据微生物自身的生物学特点，通过人为的创造条件，使微生物处于低温、干燥、缺氧的环境中，以使微生物的生长受到抑制，新陈代谢作用限制在最低范围内，生命活动基本处于休眠状态，从而达到保藏的目的。 常用简易保藏法包括常规转接斜面低温保藏法、半固体穿刺保藏法、液体石蜡保藏法、含甘油培养物保藏法及沙土管保藏法等。由于这些保藏方法不需要特殊实验设备，操作简便易行，故为一般实验室及生产单位所广泛采用。 常规转接斜面低温保藏法和半固体穿刺保藏法是将在斜面或半固体培养基上已生长好的培养物置于4-5℃冰箱中保藏，并定期移植。这两种方法都是利用低温抑制微生物生长繁殖，从而延长保藏时间。 液体石蜡保藏法是在新鲜的斜面培养物上，覆盖一层已灭菌的液体石蜡，再置于4-5℃冰箱中保藏。液体石蜡主要起隔绝空气的作用，使外界空气不与培养物直接接触，从而降低对微生物氧的供应量。培养物上面的液体石蜡层也能减少培养基水分的蒸发。故此法是利用缺氧及低温双重抑制微生物生长，从而延长保藏时间。 含甘油培养物保藏法是在液体的新鲜培养物中加入15%已灭菌的甘油，然后再置于-20或-70℃冰箱内保藏。此法是利用甘油作为保护剂，甘油透入细胞后，能强烈降低细胞的脱水作用，而且，在-20或-70℃条件下，可大降低细胞代谢水平，但却仍能维持生命活动状态，达到延长保藏时间的目的。 沙土管保藏法，将待保藏菌种接种于适当的斜面培养基上，经培养后，制后孢子悬浮液，无菌操作将孢子悬浮液滴入已灭菌的沙土管中，孢子即吸附在沙土上，将沙土管置于真空干燥器中，通过抽真空达到吸干沙土管中水分，然后将干燥器置于4℃冰箱中保存。此法利用干燥、缺氧、缺乏营养、低温等因素综合抑制微生物生长繁殖，从而延长保藏时间。 二、操作步骤 (一) 斜面传代保藏法 l．贴标签取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距试管口2～3cm处。 2．斜面接种将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上，细菌和酵母菌宜采用对数生长期的细胞，而放线菌和丝状真菌宜采用成熟的袍子。 3．培养细菌37℃恒温培养18～24h，酵母菌于28～30℃培养36～60h，放线菌和丝状真菌置于28℃培养4～7d。 4．保藏斜面长好后，可直接放入4℃冰箱保藏。为防止棉塞受潮长杂菌，管口棉花应用牛皮纸包扎，或换上无菌胶塞，亦可用熔化的固体石蜡熔封棉塞或胶塞。
微生物实验室常用的标准菌种管理及、保存SICOLAB整理
微生物实验室常用的标准菌种管理及、保存SICOLAB整理 在微生物实验室中，常需保存-些实验中常用的标准菌种及菌株，如金黄色葡萄球菌，致病性大肠杆菌，几种常见的沙门氏菌，痢疾杆菌等，以供学生进行细菌涂片染色检查、细菌接种培养、制备凝集抗原、免疫动物制备诊断血清及测定诊断血清效价等。在做抗菌药物敏感试验时，也需常备-套对各种抗菌药物“敏感”的对照菌株，使学生学会判断细菌对药物的敏感性。对这些菌种的妥善保管和保存，是良好的实验室管理和实验质量的重要保证。 一、保管 由于实验室中保存的菌种大多对人体具有致病性，经多次移种又易被污染和发生变异，做好安全及质量管理至关重要，主要应做到以下几点。 1.1专人负责菌种保管应指定专人负责，存放于加锁的冰箱中。保管人应具备高度的责任心，明确职责，严格执行有关的规章制度，以确保菌种安全。 1.2详细登记实验室应备有-本详细登记本，对各种菌种进行详细登记，内容包括菌种的名称，编号，数量，分离日期，鉴定者，细菌的形态染色，培养生化特性，抗原结构，动物致病力等，并注明使用、移种及销毁的情况和原因。 1.3定期移种对菌种的保管不仅要求菌种不死，还要力求其生物学性状等不发生变异。各种菌种应按规定时间定期移种。细菌在人工培养基上经数代培养后，其形态、菌落、毒力等均易发生变异，因此，在每移种3次后应做-次全面鉴定，检测菌种有无污染和变异，如发现污染和变异时，应及时处理。 二、保存 保存菌种应根据细菌的培养特性、抵抗力等选择适合的培养基，微生物实验室常用菌种的-般保存方法有以下几种： 2.1科面保存法 2.1.1普通肉汤琼脂斜面：肠道杆菌、葡萄球菌等营养要求不高的细菌可接种于普通琼脂斜面上，斜面底部应加少许无糖肉膏液，以防干涸(但变形杆菌“OX”及伤寒杆菌“O’’菌株宜接种于斜面底部无肉汤的干燥的琼脂斜面，以防变异)，用橡皮塞塞紧，置37℃培养18-24h 后，放于4℃冰箱中，可保存1个月，每经1个月需接种传代1次。 2.1 .2血液琼脂斜面：链球菌及肺炎球菌的营养要求较高，在普通培养基上生长不良或不生长，应接种于血液琼脂斜面上，37℃培养生长后，放4℃冰箱保存，链球菌需半个月-1个月接种1次;肺炎球菌因能产生自溶酶而导致自溶现象，需4d移种1次。肺炎球菌在人工培养基上经数代培养后，其形态、菌落、毒力均易发生变异，在人工培养基上肺炎球菌很快失去荚膜，经多代培养后其光滑型菌落可变为粗糙型，毒力也大为降低。 2.1.3鸡蛋斜面：成分为新鲜全蛋、1%葡萄糖肉汤及甘油。少数沙门氏菌当新从病人检材中分离出来时，常具有Vi抗原，具有Vi抗原的细菌，有抵抗吞噬的作用，并保护细菌不被相应抗体在补体参与下所溶解，故毒力较强。含有Vi抗原的沙门氏菌等，可接种于鸡蛋斜面上，37℃培养18-24h，加无菌液体石蜡至斜面浸没，再超出约1cm，置4℃冰箱，可保存3-6个月，Vi抗原经长期人工培养，也易消失。 2.1.4吕氏血清斜面：白喉杆菌可保存在该培养基上，其成分为l%葡萄糖肉汤(pH7 .4)1份，牛血清或兔血清(无菌)3份。白喉杆菌在此培养基上生长迅速、旺盛，菌体形态典型，如在培养基中再加人5%-10%的中性甘油，则培养出的白喉杆菌的异染颗粒更为明显，但24h后即衰老成为多形态，很少有异染颗粒，菌体粗大3-4倍，置4℃冰箱可保存2周-1个月。2.2半固体穿刺保存法 2.2.1普通半固体：大肠杆菌、葡萄球菌、绿脓杆菌等可穿刺接种于普通半固体培养基内，37℃培养18-24h后，加1层无菌的液体石蜡，厚度约为1cm，置4℃冰箱可保存3-6个月。传代移种时，将半固体菌种管倾斜，使液体石蜡流至-边，再取菌移种于新的培养基。将沾
常用菌种保藏方法
微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 素而设计的。 一、保藏方法大致可分为以下几种： 1、传代培养保藏法 2、液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3、载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4、寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5、冷冻保藏法 6、冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。 有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。 二、器材: 细菌、酵母菌，放线菌和霉菌； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙； 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。 三、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。 1、斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保