雨生红球藻农杆菌转化体系的建立
第３９卷第９期
２０１６年９月合肥工业大学学报（自然科学版）ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＨＥＦＥＩＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ）Ｖｏｌ．３９Ｎｏ．９ Ｓｅｐｔ．２０１６ 收稿日期：２０１５‐０５‐０７；修回日期：２０１６‐０２‐２５
基金项目：安徽省皖江禽产业研究院公共服务平台资助项目（１４０１０３２００６）；国家大学生创新创业训练计划资助项目
（２０１４１０３５９０５６）
作者简介：侯善茹（１９９０－），男，安徽涡县人，合肥工业大学硕士生；刘永胜（１９６４－），男，重庆市人，博士，合肥工业大学教授，博士生导师．ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００３‐５０６０．２０１６．０９．０２３
雨生红球藻农杆菌转化体系的建立
侯善茹， 冯兴标， 李光伟， 陈丹阳， 袁浏欢， 刘永胜
（合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥 ２３０００９）
摘 要：文章以植物表达载体ｐＢＩ１２１、农杆菌ＥＨＡ１０５为体系，建立了农杆菌介导的雨生红球藻转化方法，通过筛选羧苄青霉素、Ｇ４１８等抗生素对雨生红球藻生长的影响，确定了以２００μｇ／ＬＧ４１８和５００ｍｇ／Ｌ羧苄青霉素为筛选体系。转化的雨生红球藻以ＣａＭＶ３５Ｓ和来源于番茄的八氢番茄红素脱氢酶基因的启动子（ＰＤＳ启动子）成功表达了报告基因ＧＦＰ和ＹＦＰ，拓宽了ｐＢＩ１２１载体的应用范围，为雨生红球藻的转化提供了一个新的遗传转化途径。番茄来源的ＰＤＳ启动子能够启动报告基因的表达，表明植物源的启动子能够在雨生红球藻中表达，为植物源的启动子验证及基因瞬时表达提供了一个新的方法。
关键词：雨生红球藻；农杆菌；遗传转化；ＰＤＳ启动子
中图分类号：Ｑ７８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００３‐５０６０（２０１６）０９‐１２７１‐０７
ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓ
ＨＯＵＳｈａｎｒｕ， ＦＥＮＧＸｉｎｇｂｉａｏ， ＬＩＧｕａｎｇｗｅｉ， ＣＨＥＮＤａｎｙａｎｇ， ＹＵＡＮＬｉｕｈｕａｎ， ＬＩＵＹｏｎｇｓｈｅｎｇ（ＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＦｏｏｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＨｅｆｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｅｆｅｉ２３０００９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ‐ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓ（Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）ｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｕｓｉｎｇｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＢＩ１２１ａｎｄＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＥＨＡ１０５．ＴｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＧ４１８ａｎｄｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎｗａｓ２００μｇ／Ｌａｎｄ５００ｍｇ／Ｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｂｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎａｎｄＧ４１８ｏｎａｌｇｅＨ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓｇｒｏｗｔｈ．ＲｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅＧＦＰｏｒＹＦＰｄｒｉｖｅｎｂｙＣａＭＶ３５ＳｏｒｔｏｍａｔｏＰＤＳｐｒｏｍｏｔｅｒ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＨ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅａｐｐｌｉｃａ‐ｔｉｏｎｏｆｐＢＩ１２１ｖｅｃｔｏｒｗａｓｂｒｏａｄｅｎｅｄ，ａｎｄｔｈｅｒｅｂｙｐｒｏｖｉｄｉｎｇａｎｅｗｗａｙｆｏｒｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＨ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ．Ｔｏｍａｔｏ‐ｄｅｒｉｖｅｄＰＤＳｐｒｏｍｏｔｅｒｉｓａｂｌｅｔｏａｃｔｉｖａｔｅｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｂｏｔａｎｉｃａｌｐｒｏｍｏｔｅｒｃａｎｂｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＨ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ，ｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｓａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｍｏｔｅｒｓｆｒｏｍｐｌａｎｔｓａｎｄｔｒａｎｓｉｅｎｔｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓ（Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ；ｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＰＤＳｐｒｏｍｏｔｅｒ
雨生红球藻（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓ）属于
绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科、红球藻属。雨
生红球藻能够进行光合自养和化能异养方式生
长，在弱光、氮磷丰富的条件下以绿色游动营养细
胞状态存在，这种状态下生长旺盛；在胁迫条件
下，以不动厚壁孢子形态存在，该阶段能够产生虾青素，虾青素的质量可高达细胞干重的３％～４％。虾青素具有较高的抗氧化性能，广泛地应用于食品、化妆品及医药等领域，雨生红球藻已被批准作为新资源食品，因此对雨生红球藻的资源开
万方数据
虾青素的最佳来源—密闭式培养的雨生红球藻
虾青素的最佳来源—密闭式培养的雨生红球藻 雨生红球藻（Haematococcus Pluvialis)又被叫做雨生血球藻，是一种普遍存在的藻类，这种藻类广泛存在于自然界中，从炎热的赤道到寒冷的北极雪域均有它的分布。在与雨生红球藻相关的文献中没有任何有毒性的报道。当前，雨生红球藻被公认为自然界中生产天然虾青素的最好生物，因此，利用这种微藻提取虾青素无疑具有广阔的发展前景，已成为近年来国际上天然虾青素生产的研究热点。 雨生红球藻的生命力非常强，但是只有在特定的环境下，其藻体中才会生成虾青素，完成虾青素的积累。在积累虾青素的过程中对光照、温度以及生长环境的要求非常高，生长环境一旦不符合要求，雨生红球藻就会停止生成虾青素（Astaxanthin），甚至迅速的死亡。因此在雨生红球藻的人工培养中，如何对雨生红球藻的生长进行优良的控制，即其培养技术的要求一直是生产公司的优秀程度与否的很重要的评价指标。 在目前雨生红球藻的培养当中，世界上所有的公司采用的培养技术分为了两种，即Closed Incubation（密闭式培养）和Opening Incubation(开放式培养)两种。下面简单介绍一下这两种技术的一些特点。Opening Incubation(开放式培养)由于技术要求和成本低，对于培养环境的要求不是十分苛刻，因此能够进行大量化的培养，但是培养过程中无法保证其生长环境的稳定性，极易受到外来物种的污染和影响。
开放式培养红球藻虽然有成本低，易于大规模生产的优点，但由于其生产过程中的开放式的特点，极易受到外来物种的污染，导致其他微生物的繁殖，产生抑制甚至导致雨生红球藻种群的退化，使其成品的纯度无法达到满意的效果。并且由于在开放式培养的过程当中受到的外来物种的污染，由此方法培养出的红球藻粉经过萃取加工后的虾青素产品应用于一般食品及饮料上时，很难取除掉其他受污染的不纯物质的特有异味，影响添加虾青素的美味食品的开发。 Closed Incubation(密闭式培养)则不然，由于在培养的整个过程中采用了密闭容器，可以很好的阻止外来物种对雨生红球藻的侵蚀和影响，而且便于对培养环境的调节和控制。密闭式培养能为雨生红球藻提供稳定和优质的生长环境，其成品中虾青素的纯净度可以达到很高的程度。 由于在雨生红球藻的生长过程中对光源的要求很重要，因此密闭容器大多设计成造型特殊的透明密闭容器，也称为Photoreactor(光反应器)。容器的形状常设计成柱状、细管状、平板状、曲面板状等等，力求密闭容
非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法与相关技术
本技术公开了非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，在室内培养和室外诱导培养之间，增加如下步骤：步骤一、改变培养条件，将室内培养得到的雨生红球藻游动营养细胞转变为不动营养细胞；步骤二、收集并浓缩步骤一中所得藻液，加入抗生素和/或防腐剂，低温冷藏；步骤三、除去冷藏后的藻液中的抗生素和/或防腐剂，加入稀释的培养基，在弱光照条件下通气培养，对所述不动营养细胞进行活化。本技术的方法能够在室外诱导培养中断的情况下，将室内培养的营养细胞进行浓缩储藏，在气候适宜的时候，将储藏的营养细胞快速活化并进行室外诱导培养，以大幅缩短整体培养周期，提高设备利用率和生产率，从而提高生产的稳定性。 权利要求书 1.非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，在室内培养和室外诱导培养之间，增加如下步骤： 步骤一、改变培养条件，将室内培养得到的雨生红球藻游动营养细胞转变为不动营养细胞；步骤二、收集并浓缩步骤一中所得藻液，加入抗生素和/或防腐剂，低温冷藏； 步骤三、除去冷藏后的藻液中的抗生素和/或防腐剂，加入稀释的培养基，在弱光照条件下通气培养，对所述不动营养细胞进行活化。 2.如权利要求1所述的非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，所述室内培养具体为：将雨生红球藻藻种置于BG11培养基中进行培养，初始接种量为5～30万个细胞/ml，培养温度为15～25℃，白色荧光灯24小时连续单侧光照，光照强度为50～ 100μE/m2/s，pH为7.0～8.0，培养7～15天，游动营养细胞比例为80～100％。 3.如权利要求1所述的非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，所述步骤一，具体为：将室内培养的温度提升至28-35℃和/或将pH提高至8.5-9.5，继续培养1-5