分子生物学实验报告

分子生物学实验

院系：生命科学与技术学院

专业：生物科学（基地）

班级：201101班

学号：

姓名：

分子生物学基础实验

分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR 基因扩增等等。

实验一质粒DNA的小量制备

一、实验原理

要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。

质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。

质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。

所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细

菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。

质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为 2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为 1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA （covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。

二、实验目的

1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。

2．了解制备原理及各种试剂的作用。

三、实验材料和试剂

材料：大肠杆菌E.coli，含pBR322质粒。

试剂：

1.LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，用NaOH调pH至

7.3左右。如固体培养基则添加15g/L琼脂。

2.溶液Ⅰ（pH8.0G.E.T缓冲液）：50 mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L

EDTA。灭菌后存放。

3.溶液Ⅱ（0.2mol/LNaOH(内含1％SDS)）：预先配制1％SDS母液，临用前一天晚上

加入0.2mol/LNaOH，4℃保存。

4.溶液Ⅲ（pH4.8乙酸钾溶液）：5mol/L乙酸钾60mL、冰乙酸11.5mL、双蒸馏水

28.5mL。

5.酚/氯仿液(V/V＝1/1)：酚为重蒸酚，配制时，先将氯仿中加入异戊醇，使其体积比为

24:1，然后等量的加入重蒸酚，混匀，并用0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，于棕色瓶中存放，并在上面覆盖等体积的0.01 mol/LTris-HCl(pH7.6)，4℃保存。

6.无水乙醇

7.70％乙醇

8.pH8.0 TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA，其中含RNA酶20μg/mL。仪器：

恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、台式小型振荡器、EP管(1.5mL微量离心管)、加样器(20uL～lmL)、吸头。

四、操作步骤

（一）培养细菌

将带有质粒pBR322的大肠杆菌接种在含50μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。注意：添加Amp时，须待LB培养基冷却到50℃左右方可加入。

（二）从菌落中快速提取制备质粒DNA

1．取1.4mL菌液置于1.5mL Ep管中，7500rpm离心1min。

2．弃上清，加入150μL GET缓冲液，在涡旋混合器上充分混匀，在室温下放置10min。3．加入200μL新配制的0.2mol/L NaOH(内含1％SDS)，加盖，颠倒（不要振荡）2～3次，使之混匀，冰上放置4min，最多不能超过5min。

4．加入150μL冰冷的乙酸钾溶液。加盖后，颠倒数次使之混匀，冰上放置15min。5．10000rpm离心5min，上清液吸至另一干净的1.5mL Ep中，如上清液浑浊则需重新离心一次。

6．于上清液中加等体积酚/氯仿液，振荡混匀，12000rpm离心2min，小心吸取上清液，转移至另一1.5mL Ep管中，注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。

7．向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置３min。用离心机于10000rpm离心5min。倒去上清液。

8．用0.5mL 70％乙醇洗涤沉淀一次，10000rpm离心3min，除尽乙醇，室温自然干燥(将离心管倒置于一张纸巾上)，备用。

9．用30uL含无DNA酶的胰RNase(20 ug／mL)的TE重新溶解DNA，置于4℃保存，供下午电泳使用。

这里因为要检测质粒是否提取成功以及提取质粒的浓度，故在此要进行一次电泳，下面为琼脂糖凝胶电泳的原理及方法：

原理：根据DNA分子量不同，采用外加电场使其分开，用EB嵌入DNA分子后在紫外下

显荧光。而荧光强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品表2－1作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓度。电泳后的琼脂凝胶糖直接在紫外灯下拍照，只需要5－10ngDNA，就可以从照片上比较鉴别。

由于电泳时所用的样品量非常少，只要将浓度控制在几十纳克即可，所以在基因工程中经常被用做检测DNA样品。

表2－1 λDNA/ Hind Ⅲ中DNA片断

总DNA含量为100%

琼脂糖凝胶板的制备

1．琼脂糖凝胶的制备

称取1.0g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入100mL TBE缓冲液，于电炉上加热，注意：防止溢出，由于琼脂糖较难溶解，如果水分损失较大，则补充一定量的蒸馏水，使其终浓度为1％。

2．胶板的制备

将有机玻璃内槽洗净、晾干。取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好，形成一个边脚模子。注意：将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上，不能留空隙。

将有机玻璃内槽置于水平位置，放好样品槽模板(一般称之为梳子)，将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶，小心地倒在内槽上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1h左右，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，撕去胶带纸，胶板上即形成相互隔开的样品槽。

将有机玻璃内槽放入电泳槽中，加入0.5×TBE电泳缓冲液，以盖过胶板为宜。

胶板内的样品小槽

3．加样

用移液枪将上述样品分别加入胶板的样品小槽内，每次加完一个样品为了避免交叉污染，各样品用不同的枪头，以免造成限制酶被污染。加样时，枪头不要插入胶板内，防止碰坏样品槽周围的凝胶面，每个样品槽的加样量不宜过多，本实验加样为10uL左右。(每块胶板需点一个Marker，这里即为λDNA/ Hind Ⅲ)

4．电泳

加完样品后应立即通电，进行恒压电泳。在低压条件下，线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。

当溴酚蓝染料（蓝色）移动到距离胶板下沿约1～2cm处，停止电泳。

5．染色

将电泳后的凝胶浸入EB染液中，进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA带。染色20min后，用大量水冲洗。

6．观察

在波长为254nm的紫外灯下，观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处显示出红色荧光条带。用凝胶自动成像仪处理代替。

五、注意事项

1．收集菌体提质粒前，培养基要去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。

2．在添加溶液Ⅱ与溶液Ⅲ后溶液的混合一定要柔和，采用上下颠倒的方法，千万不能在旋转器上剧烈振荡。其中加入溶液Ⅱ后，溶液变成澄清，并有黏性；加入溶液Ⅲ后，出现絮状沉淀。

3．苯酚具有腐蚀性，能造成皮肤的严重烧伤及衣物损坏，使用时应注意。如不小心皮肤上碰到苯酚则应用碱性溶液、肥皂及大量的清水冲洗。

4．苯酚可以用于抽提纯化DNA，由于苯酚的氧化产物可以使核酸链发生断裂。所使用的苯酚在使用前必须经过重蒸，且都必须用0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)进行平衡。所以

取酚/氯仿/异戊醇时应取下层溶液，因为上层是Tris-HCl液隔绝空气层。

5．酚/氯仿/异戊醇抽提时，应充分混匀。经酚/氯仿/异戊醇抽提后，吸取上清液时注意不要把中间的白色层吸入，其中含有蛋白质等杂质。

6．实验中，涉及酚/氯仿溶液的操作要格外小心，而且与之接触的吸头、Ep管，全部弃用，不回收。

7．有些质粒本身可能在某些菌种中稳定存在，但经过多次移接有可能造成质粒丢失。因此不要频繁转接，每次接种时应挑单菌落。

六、实验结果与分析

提取质粒DNA后，经琼脂糖凝胶电泳，图谱如下：

图中M为Marker，4号为本人所提取的质粒

DNA凝胶电泳的检测图，本人所用的质粒为

pEGFP-N3。由跑胶结果可知，质粒DNA分子

条带较为明亮，说明所提取的DNA浓度很高；

前面原理部分提到，质粒DNA分子的结构多样，

包括超螺旋结构，开环结构以及线性结构等，它

们在凝胶中的泳动速度不同，所以在图谱中显示

有多条带；胶孔中比较亮的部分表明提取的质粒

中有大量蛋白质残留；条带非常宽而且两侧有轻

微的拖尾迹象表明点样时样品量加的过多，在质

粒检测中可以适当减少加样量，使得条带清晰均

匀一点。一般在实验室中，不会单独检测质粒

DNA，或者检测质粒DNA时不用Marker，这

主要是因为质粒DNA分子结构多样，在电泳图

谱中并不能够正确显示其大小。

七、思考题

1．裂解细菌时需注意的事项有哪些？

答：首先注意的是SDS-NaOH处理的时间。质粒制备过程中，如果质粒长时间暴露于NaOH, 质粒有可能不可逆变性，使得抽提质粒中有部分是变性质粒。这些变性质粒，不能酶切。所有一般情况下，SDS-KOH处理时间不能超过5分钟，最好在冰里处理，观察到液体变得清就可以加入中和液。其次是在添加溶液Ⅱ与溶液Ⅲ后溶液的混合一定要柔和，采用上下颠倒

的方法，千万不能在旋转器上剧烈振荡，否则会是质粒DNA断裂，影响提取的效果与浓度。2．质粒的基本性质有哪些？

答：质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，是双链闭合环状结构的DNA分子；具有自主复制和转录能力；可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中。

3．碱裂解法提取质粒DNA中各溶液的作用是什么？

答：溶液Ｉ:pH8.0 GET缓冲液，葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管EP 的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA 是Ca2＋和Mg2＋等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉。从而起到抑制DNase对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。

溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(内含1%的SDS)，NaOH是最佳溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会在瞬间溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化。SDS是离子型表面活性剂。它主要作用是：a溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜。b解聚细胞中的核蛋白。c能与蛋白质结合成为 -…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。SDS能抑制核糖核酸酶的作R-O-SO

3

用，所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便下一步试验的更好进行。

溶液Ⅲ：pH4.8乙酸钾溶液，pH4.8的乙酸钾溶液是为了把抽提液的pH调至中性，从而使变性的质粒DNA复性，且稳定存在。溶液III加入后的沉淀实际上是K+置换了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚，使得沉淀更完全。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的盐形式复合物。

酚/氯仿液(V/V＝1/1)：用苯酚处理时，能使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶，蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相，使用酚能有效变性蛋白质，抑制了DNase的降解作用；氯仿能克服酚的缺点，加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的迹量酚（酚易溶于氯仿中）；异戊醇的作用是减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡，异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生，另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含质粒DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

无水乙醇：乙醇可以以任意比和水相混溶，而DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，同时乙醇与核酸不起化学反应，因此是理想的沉淀剂。加入乙醇后，乙醇会夺去DNA周围的水分子，DNA失水聚合。

70%乙醇：将质粒DNA表面的离子洗去。

pH 8.0 TE缓冲液：由于缓冲液是TrisH+ /Tris，不存在金属离子的干扰作用，而TE缓冲

液中的EDTA更能稳定DNA的活性。酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。

4.抽提质粒DNA的方法包括哪几个步骤？

答：DNA提取分为三个基本步骤：1、破碎细菌细胞壁，加入去污剂除掉膜脂从而裂解细胞，使蛋白质与DNA变性，利用醋酸盐沉淀基因组DNA、细胞碎片与蛋白质。2、酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白。3、将DNA在冰乙醇中沉淀，因为乙醇与水互溶，而DNA 在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。

5.如何提高质粒DNA的产量？

答：第一是扩大质粒DNA的拷贝数，一般认为，培养16小时的菌液状态最好，最适合提取，可以在此基础上扩大接种量，等比例扩大LB培养基的体积，采取多次抽提的方法提高质粒DNA的产量；第二是在提取过程中小心谨慎，在加入苯酚/氯仿溶液离心之后小心吸取的同时尽量吸取完全，减少损失。

6.为什么质粒DNA不能反复在4℃、-20℃、室温中放置？为达到这一目的，需要注意些什么？

答：当质粒存放在-20℃的条件下保存时，由于TE缓冲液中含有水分，会结成冰晶插入到质粒DNA分子的间隙中，而在4℃条件下不会出现这种状况。若是质粒DNA分子反复冻溶，水溶液的反复结冰会导致环状DNA分子断裂，导致得到线性的质粒DNA，在接下来的实验中将会影响到酶切与检测。为了保护质粒DNA分子不受到损害，应当将近期需要使用的质粒存放于4℃冰箱保存，方便使用，而对于暂时不用的质粒，则应存放于-20℃冰箱，长期保存。

实验二 DNA 的含量、纯度与分子量的电泳法测定

一、 实验原理

测定核酸通常采用两种方法：即紫外分光光度法与琼脂糖凝胶电泳法。

1．紫外分光光度法

DNA 或RNA 定量时，应在260nm 和280nm 两个波长下读数。根据计算在260nm 波长下，每1ug/mL DNA 钠盐的A 值为0.20，即在A 260=1时，双链DNA 含量为50ug/mL ，单链DNA 与

RNA 含量为40ug/mL ，单链寡核苷酸的含量为33 ug/mL 。

双链DNA 含量＝A 260×50×稀释倍数（ug/mL ）

RNA 含量＝A 260×40×稀释倍数（ug/mL ）

单链DNA 含量＝A 260×33×稀释倍数（ug/mL ）

此外还可以根据260nm 和280nm 的读数间的比值（A 260/A 280）估计核酸的纯度。

2．琼脂糖凝胶电泳法

根据DNA 分子量不同，采用外加电场使其分开，用EB 嵌入DNA 分子后在紫外下显荧光。而荧光强度正比于DNA 的含量，如将已知浓度的标准样品表2－1作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓度。电泳后的琼脂凝胶糖直接在紫外灯下拍照，只需要5－10ngDNA ，就可以从照片上比较鉴别。

由于电泳时所用的样品量非常少，只要将浓度控制在几十纳克即可，所以在基因工程中经常被用做检测DNA 样品。

表2－1 λDNA/ Hind Ⅲ中DNA 片断

总DNA 含量为100%

二、实验目的

1．从以上实验中提取到的质粒DNA，为了能作下一步的酶切，连接及转化实验，必须测定DNA的纯度、含量以及分子量大小。

2．本实验旨在学习水平式琼脂糖凝胶电泳，学习检测DNA、含量与相对分子质量大小。

三、实验材料和试剂

材料：自制的质粒DNA、λDN A/ Hind Ⅲ、。

试剂：

1．标准DNAmarker(λDNA/ Hind Ⅲ)

2．限制性内切酶E co RⅠ或HindⅢ和10X缓冲液

3．酶反应中止液：0.2 5％溴酚蓝(含40％蔗糖)，已配好。

4．溴化乙锭染液（EB）：使用前稀释1000倍，母液已配好。注意：EB是一种诱变剂，配制和使用时应戴好手套，并且不能将该染液洒在桌面或地面上！使用后立即用大量的水冲洗干净。

5．0.5×TBE缓冲液：Tris 2.18g、硼酸1.10g、EDTA-Na20.14g用蒸馏水定容至400mL。可配成5×TBE母液，使用时稀释10倍即可。

6．0.7％琼脂糖

仪器：37℃水浴锅、微波炉、稳压电泳仪、凝胶成像系统、电泳槽、Eppendorf架、恒温摇床、台式小型振荡器、Ep管(1.5mL)、加样器(20uL～lmL)、吸头。

四、实验操作

（一）质粒DNA的酶解

1．新提的质粒，在10uL的体系中用单一酶（如E co RⅠ）进行处理，即：

质粒DNA 5μL

10×缓冲液 1μL

E co RⅠ 0.5μL

ddH

O 4μL

2

2．37℃，保温30min。

3．加入1/10体积的酶反应终止液，混匀以停止酶解反应。各酶解样品于冰箱中贮存备用。（二）琼脂糖凝胶板的制备

1．琼脂糖凝胶的制备

称取1.0g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入100mL TBE缓冲液，于电炉上加热，注意：

防止溢出，由于琼脂糖较难溶解，如果水分损失较大，则补充一定量的蒸馏水，使其终浓度为1％。

2．胶板的制备

将有机玻璃内槽洗净、晾干。取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好，形成一个边脚模子。注意：将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上，不能留空隙。

将有机玻璃内槽置于水平位置，放好样品槽模板(一般称之为梳子)，将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶，小心地倒在内槽上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1h左右，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，撕去胶带纸，胶板上即形成相互隔开的样品槽。

将有机玻璃内槽放入电泳槽中，加入0.5×TBE电泳缓冲液，以盖过胶板为宜。

胶板内的样品小槽

3．加样

用移液枪将上述样品分别加入胶板的样品小槽内，每次加完一个样品为了避免交叉污染，各样品用不同的枪头，以免造成限制酶被污染。加样时，枪头不要插入胶板内，防止碰坏样品槽周围的凝胶面，每个样品槽的加样量不宜过多，本实验加样为10uL左右。(每块胶板需点一个Marker，这里即为λDNA/ Hind Ⅲ)

4．电泳

加完样品后应立即通电，进行恒压电泳。在低压条件下，线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。

当溴酚蓝染料（蓝色）移动到距离胶板下沿约1～2cm处，停止电泳。

5．染色

将电泳后的凝胶浸入EB染液中，进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA带。染色20min后，用大量水冲洗。

6．观察

在波长为254nm的紫外灯下，观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处显示出红色荧光条带。用凝胶自动成像仪处理代替。

五、注意事项

1．基因工程是微量操作技术，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的正确性，确认样品确实被加入反应体系。

2．酶应在－20℃冰箱中保存，取酶的操作必须严格在冰浴条件下进行，用完后立即放回－20℃冰箱，不要将酶在冰浴中放置过久，或放在高于0℃以上的环境中，以防止酶失活。3．酶切加样次序为水、缓冲液和DNA，然后混匀。酶永远是最后加入的，如将酶直接加入浓缩的缓冲液中会引起严重的失水。酶切反应体系的溶液加完后，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底，不要用振荡器。此步操作是整个实验成败的关键，注意防止错加、漏加。

4．为了避免交叉污染，各样品用不同的吸头，且每次取酶时务必换吸头，以免造成限制酶被污染。

5．溴化乙锭是一种强烈的诱变剂，有毒性，使用含有这种染料的溶液时，应戴手套进行操作。勿将溶液滴洒在台面或地面上，用后用水彻底冲洗干净。

六、实验结果与分析

如图所示，M为Marker，泳道1为被酶Eco R I 所切

后的质粒跑出来的条带。因为质粒在酶切之前大都以

超螺旋的形式存在，在酶切之后以线性形式存在，所

以泳道1只有一条条带。查资料知道pEGFP-N3质粒

的大小为4729bp，大小基本符合。2号泳道为未酶切

的对照组质粒，因为状态不同，所以显示出比酶切之

后的条带跑的慢。分子量相同的超螺旋环状、带切口

环状以及线状DNA通过琼脂糖凝胶时速度不一。由

图中看，酶切后的质粒条带及未经酶切的质粒条带都

不明亮，且对照组质粒的三条带不明显，说明提取的

质粒浓度较小。这三种DNA的相对迁移率主要取决于

凝胶浓度，但也受所用电流强度、缓冲液的离子强度

及超螺旋度的影响。

七、思考题

1.简述EB显色的原理。

答：溴化乙锭（EtBr，EB），是芳香族荧光化合物，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的核酸。是一种核酸染料，常在琼脂糖凝胶电泳中用于核酸染色，是一种强的诱变剂，可能也是一种致癌物或致畸剂。EB分子可以嵌入核酸双链的配对的碱基之间，在紫外线激发下，未与核酸结合的溴化乙锭可被激发出橙红色萤光。在与DNA或双股RNA结合时，萤光强度会增强20倍，使得核酸电泳后的胶片可以辨识核酸的相对位置。在核酸分子中，EB分子插入到两层碱基对之间，发出红色荧光。在凝胶中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况，这种方法使用于一般性的核酸检测。

2.使用溴化乙锭时应注意什么？

答：不慎与眼睛接触后，立即用大量清水冲洗并征求医生意见；穿戴适当的防护服、手套和护目镜或面具；若发生事故或感不适，立即就；避免皮肤接触；吸入有极高毒性，避免吸入。

3.说明不同电压对电泳结果的影响是什么？

答：限制性内切酶消化后的DNA分子片段，低电压时，迁移率与所用电压成正比。在电场强度增加时，不同分子量的DNA 段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。原则上场强度不要超过5V~8V/cm，高电压可明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。使用50V左右的低电压可以让DNA分子片段沉降到胶孔中的适当位置，分散更加均一后缓慢泳出加样孔，条带整齐集中，对于微量珍贵样本（1~50ng）和小片段样本（容易在凝胶中扩散消失，显色不清）尤其有利于观察到清晰结果。为了提高效率，节省时间，在核酸条带浓缩集中后（10~20min），可以转换高电压100V，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约0.5~1.0cm时，停止电泳。综上，两种电压交替使用既提高分离效果，又较好节余时间。

4．如何判断DNA的纯度？

答：DNA纯度的判断根据OD260/OD280的比值判断，符合要求纯度高的纯化DNA其OD260/OD280在1.6-1.8之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA。

实验三感受态细胞的制备及转化

一、实验原理

感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。转化的基本原理是细胞处于0℃，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸混合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在选择性培养基平板上培养，可选出所需的转化子。

二、实验目的

1．学习和理解影响细胞感受态的因素，掌握感受态细胞的制备方法。

2．掌握质粒的转化方法。把体外DNA引入受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出转化子。

三、实验材料和用具

材料：自制的质粒DNA、大肠杆菌(E.coli)菌种(DH5α菌株)。

试剂：

LB琼脂平板(无抗生素)、

LB琼脂平板(含50μg/L卡那霉素)、

LB液体培养基5mL(无抗生素)、

LB液体培养基100mL(无抗生素)、

LB液体培养基5mL(含50μg/L卡那霉素)、

0.1mol/LCaCl2溶液(灭菌备用)。

仪器：

恒温培养箱、恒温摇床、接种环、涂布器、冷冻离心机、离心管、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅。

四、操作步骤

(一)大肠杆菌感受态细胞的制备

1．从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于5mL液体培养基中，37℃振荡培养过夜，直至对数生长期。将该菌悬液以1：50接种于50mL LB液体培养基中，37℃快速振荡培养3～4h。

2．取5mL培养液放入离心管中，在冰上放置10min，于4℃5000rpm离心10min。3．可用移液枪将残余液体尽量去净，用1mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15～30min。

4．于4℃，5000rpm离心10min。

5．弃上清，加入200μL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻，即制成了感受态细胞悬液。

6．制好的感受态细胞可在冰上放置。

(二)细胞转化

取200μL摇匀后的感受态细胞悬液，进行下一步的转化，转化如下（单位：μL）：样品组即为我们的转化组：100μL感受态细胞＋2μL质粒DNA

对照1为受体菌对照组：100μL感受态细胞＋2μL无菌水

对照2为质粒DNA对照组：100μL0.1mol/LCaCl2＋2μL质粒DNA

将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42℃水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却3～5min。上述各管中分别加入400μL LB液体培养基，使总体积为500μL，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37℃振荡培养30min，使受体细胞恢复正常生长状态，并使转化体产生抗药性。

(三)平板培养

取各样品培养液100μL分别接种于含卡那霉素和不含卡那霉素的LB平板培养基上（分别记为Kan—和Kan＋），涂匀。37℃培养24h，待菌落生长良好且未相互重叠时停止培养。

(四)检出转化体

不含抗生素培养基含抗生素培养基结果分析

受体菌对照组有大量菌落长出无菌落长出本实验未产生抗药性菌株质粒对照组无菌落长出无菌落长出质粒DNA不含杂菌转化实验组有大量菌落长出有菌落长出质粒进入受体菌中产生抗

药性

五、注意事项

1．这一个实验中的所有操作均要为无菌操作，在超净工作台内进行。

2．细胞转化中，42℃水浴90s要准确操作。

3．制备感受态细胞过程中，需要在冰上放置的一定不要在室温中放置。

六、实验结果与分析

经过一夜培养后，第二天上午9点从烘箱中取出培养皿观察结果如下图所示，实验比较成功，转化实验组的不含卡那的平板有大量菌落长出，含卡那的平板有少许菌落长出；对照组1即受体菌对照组不含卡那的平板有大量菌落长出，含卡那的平板没有菌落；对照组2即质粒对照组不含卡那的平板上发现一个菌落，含卡那的平板没有菌落。

转化实验组

受体菌对照组

质粒对照组

思考题

1．感受态细胞制备好后，为什么在转化前还要在冰上放置？

答：感受态细胞制备后在冰上放置一段时间后再进行转化可提高转化率。在0摄氏度的氯化钙低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42摄氏度短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。所以需要先冰上放置30min，以增强其转化效率。

2．思考转化后平板培养应有的结果、分析自己培养的情况。

答：培养结果如上图所示。对照组1为受体菌，因为受体菌为DH5α菌株，并未导入含有卡那霉素抗性的质粒，所以在含有卡那霉素的培养基上不会生长，而在不含卡那霉素的培养基上则生长良好，由受体菌对照组图可知，菌体大部分存活，形成菌苔；对照组2为质粒，因为既不含有受体菌，也不含有经过转化的菌体，所以涂板之后应该在Kan﹣与Kan ﹢的平板上未长出菌落，但由于无菌操作的不过关，以致于在不含卡那霉素的平板上长了一个菌落，如质粒对照组图所示；至于转化的实验组，因为感受态细胞中有一部分转入了含有卡那抗性的质粒，一部分没有转入，在Kan﹣的平板上所有的大肠杆菌都可以生长，而在Kan﹢的平板上只有转入质粒的大肠杆菌能够生长，如转化实验组图所示，因此在Kan ﹣的平板上生长状态良好，长出菌苔，而在Kan﹢的平板上，部分转化成功的大肠杆菌生长，所以形成菌斑。

综上来说，实验总体还算成功，但还有一些实验细节需要注意，像对实验进程的把握、

无菌操作技术等这些方面都是有待提高的。

附录：

1. pH8.0 G.E.T.缓冲液(灭菌后使用) ：

葡萄糖0.991g

EDTA-Na20.372g

Tris-HCl 0.303g

H2O 100mL

2. 5mol/L KAc：49.08g KAc溶于100mL H2O。

3. PH

4.8乙酸钾溶液：取60mL 5mol/L KAc,11.5mL 冰醋酸，28.5mL H2O即可。

4. 0.2mol/LTris-Cl：2.422g溶于100mL H2O。

5. 0.2mol/LHCl：取1.724mL浓HCl稀释到100mL。

6. pH8.0 0.1mol/L Tris-HCl：取0.2mol/LTris-Cl 50mL加入29.2mL 0.2mol/LHCl，

补H2O至100mL即可。

7．pH8.0 10mmol/LEDTA-Na2：3.722g EDTA-Na2溶于一定量的H2O中，用固体NaOH调节其pH值，最后定容至100mL。

8．pH8.0TE：取10mL pH8.0 0.1mol/L Tris-HCl，10mL pH8.0 10mmol/L EDTA -Na2，最后定容至100mL，调节pH至8.0。含RNA酶（RNaseA）20ug/mL。9．pH7.6 0.1mol/L Tris-HCl：取0.2mol/LTris-Cl 50mL加入38.5mL 0.2mol/L HCl，补H2O至100mL即可。用于饱和酚/仿混合物。

10．酚/仿溶液（按如下体积和顺序加入试剂）

饱和酚：重蒸酚12.5mL

三氯甲烷12mL

异戊醇0.5mL

用pH7.6 0.1mol/L Tris-Cl平衡2～3次，在饱和酚/仿上，加入等体积的pH7.6

0.01mol/L Tris-Cl保护，棕色瓶保存，4℃存放。

11．5×TBE：称取Tris-Cl 21.8g，硼酸11.0g和EDTA-Na2 1.4g用蒸馏水溶解，定容至400mL。临用时稀释为0 .5×TBE。

12．0.1 mol/LCaCl2：5.5g CaCl2溶于500mL H2O。灭菌后备用。

13．无菌水。