微生物实验指导书

微生物实验指导书

实验一普通光学显微镜的使用维护

一、实验目的：

1、掌握显微镜的构造原理及性能。

2、熟练掌握显微镜的操作方法

3、初步了解血球计数板的使用方法。

二、实验原理：

1、显微镜的实验原理：普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因：

①增加照明亮度②增加显微镜的分辨率。

2、血球计数板的构造原理：血球计数板是一块特制的厚的载玻片，其上由四条竖槽构成三个平台，中间较宽的平台又被一短的横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大

计数室的刻度有两种规格即16×25或25×16的。现在常用25×16的，即计数室（一个大方格）分成25个中方格，每个中方格由分为16个小方格。

1、仪器：显微镜、载玻片、盖玻片、牙签、血球计数板

2、材料：擦镜纸、元葱

四、实验步骤：

（一）显微镜练习：

1、制片：用牙签挑少许元葱表皮放在载玻片上，然后加盖盖玻片。

2、观察：低倍镜高倍镜

（二）血球计数板的练习：先用低倍镜查找中方格，再用高倍镜查找小方格，按照左上、左下、右上、右下、中心格练习。

实验二革兰氏染色法

一、目的要求

了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。

二、基本原理

革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

三、器材

大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌；

革兰氏染色液、载玻片、盖玻片、接种环、显微镜、擦镜纸等。

四、操作步骤

1．涂片：将培养14—16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

2．染色

（1）初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。

（2）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。

（3）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒钟，立即用水冲净酒精。

（4）复染用番红液染1—2分钟，水洗。

（5）镜检干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。

五、报告：大肠杆菌为______、枯草芽孢杆菌为______、

金黄葡萄球菌为________

实验三霉菌形态的观察

一、目的要求：

1、学习观察霉菌的方法。

2、掌握几种常用霉菌的形态特征。

3、学会霉菌制片技术。

4、了解霉菌的形态构造及菌落特征。

二、基本原理：

霉菌是具有分枝的菌丝体，菌丝体及孢子的形态是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝较粗大，一般在低倍镜下即可观察到，观察霉菌常用的方法有：

1、直接制片观察法：将培养物置于乳酸石炭酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片镜检，用此染液制成的霉菌制片的特点是细胞不变形，具有防腐作用，不易干燥，能保持较长时间，防止孢子飞散。必要时，可用树胶封固，制成永久标本长期保存。

2、载玻片培养观察法：

用无菌操作将培养基薄层置于载玻片上，接种欲观察物，然后盖上盖玻片，霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿着玻片横向生

长，培养一定时间后，直接将载玻片放在显微镜下观察，这种方法可以保持霉菌的自然生长状态，这便于观察不同发育期的培养物。

三、实验材料：

1、菌种：根霉、毛霉、曲霉、青霉培养物。米曲霉、毛霉平皿菌

落

2、以载玻片培养法制成的上述霉菌标本

3、乳酸石炭酸棉蓝溶液

4、显微镜、载玻片、接种环、吸水纸、镊子

四、实验方法及步骤：

1、曲霉形态的观察

曲霉的营养菌丝体是由具有横隔的分枝菌丝构成，无色或有明亮的颜色。分生孢子梗是从足细胞生出，并略垂直于足细胞的长轴。分生孢子梗大都无横膈，常在顶部膨大成为顶囊，顶囊表面产生小梗，放射生出，分生孢子自小梗顶端相继形成，最后成为不可分枝的链。由顶囊小梗以及分生孢子链构成分生孢子穗，形如菊花，具有各种不同的颜色。

①用肉眼观察曲霉的斜面或平皿上的生长情况。

②用低倍镜观察长于培养皿上的曲霉的分生孢子形状。

③制片（或用悬滴培养片）用针挑取菌落边缘的嫩菌丝，小心放在

载玻片上，观察菌丝有无横膈及分生孢子着生等细微结构。

2、毛霉形态的观察：

毛霉的菌丝体大多为单细胞，在培养基上或培养基内，能广泛的蔓延，无假根和匍匐丝。菌丝体直接生出孢子梗，一般单生，分枝或较少不分枝，分枝顶端都产生孢子囊梗，孢子囊球形，椭圆形。大多数种类子囊成熟后，其壁易消失或破裂，但留有残迹，囊内部有囊轴。

①用肉眼观察毛霉在斜面或平皿中的生长情况。

②将插片培养的血盖片一面擦干净另一面向上放在载玻片上在低

倍镜下观察孢子囊大小形态、色泽、孢子囊梗的粗细。

③将血盖片翻过来压在载玻片上，在高倍镜下观察毛霉的细微结

构，观察孢子囊梗、囊轴、孢子囊、孢子及厚垣孢子的形态。

3、菌落形态的观察：用肉眼或低倍镜观察霉菌形态。

压滴法观察：取一大头针挑出一完整菌体放于洁净载玻片上，用高倍镜观察，并绘图。

实验四悬滴培养

（曲霉菌孢子发芽率测定）

一、目的要求：

1、了解悬滴培养的概念。

2、掌握曲霉菌孢子发芽率的测定方法。

二、基本原理：

曲霉菌用于酿造发酵的菌株较多，主要利用它在生产繁殖过程中分泌的蛋白酶，淀粉酶等作用发酵原料中的蛋白质、淀粉等成分生成发酵产品的有效成分及中间成分。

曲霉菌的繁殖方式主要是无性孢子繁殖。繁殖生长的过程：分生孢子遇到适宜的条件（温度、水分、养分）即开始吸水，体积膨胀（约是原体积1~2倍）继而开始发芽产生菌丝。菌丝生长到一定程度即会产生足细胞，足细胞上会产生分生孢子梗，在梗的顶端产生顶囊。顶囊又生出小梗，在小梗上会生出一串串的分生孢子，完成一个生长周期。

曲霉菌孢子发芽率的测定是将成熟休眠的曲霉菌的分生孢子，接种到培养基上控制一定温度（300C）培养4~5小时，在显微镜下观察发芽孢子和未发芽总孢子数的百分比。在发酵生产用菌的培养过程中具有很重要的意义。

三、仪器材料：

显微镜、培养箱、培养皿、凹玻片、培养基（米汁）、米曲霉种曲（固体粉末）、无菌稀释液

四、操作步骤：

1、将培养基放在搪瓷缸的水浴中于电炉上加热熔解（每四个小组做一份）。

2、取米曲霉种少许（约达拇指盖大小）放入盛有50ml无菌水的三角瓶内（内有4-5粒玻璃珠）充分振荡，使其孢子散成个体悬浮液。（全班做一份）。

3、用吸管吸取1ml孢子悬浮液，放入盛有9ml无菌水的试管内，充分振荡晃匀做10倍梯度稀释。（每四个小组做一份）

4、取一片血盖片擦干净，另取一支1ml吸管，取一滴试管内的孢子稀释液放在血盖片上，另取一只玻璃棒蘸取一滴加热融化的培养基快速与血盖片上的孢子稀释液混合均匀，并使其涂布面积的直径控制在10mm以内，在10秒内完成。

5、待血盖片上的培养基涂布层冷却凝固后，取一凹玻片，将血盖片上的涂布层扣在凹玻片上的凹窝内。然后将凹玻片放在显微镜下用高倍镜观察。在每个视野内应有10个左右的孢子，若不符合要求应重新按第四条操作至符合要求。（每人做一份）

6、在培养皿内加入2ml左右的水，将制备好的培养基涂片放在培养皿内的小导管上，不要使涂片与水面接触。（每组2个人的涂片放在

一个培养皿内分别作好标记）盖好盖，放在