生物化学讲义(3)

第三章核酸（6学时）

核酸是生命最重要的分子，最简单的生命仅含有核酸（病毒）。1868年首次在绷带上的脓细胞核中发现一种富含磷酸呈酸性又不溶于酸溶液的分子，命名为核素，其实是核蛋白，1898年从小牛的胸腺中提取了一种溶于碱性溶液中的纯净物，这才是真正的核酸，从此，对核酸的研究全面展开，揭开了生物化学领域惊天动地的一页。1944年Avery等所完成的著名肺炎双球菌转化试验，证明了DNA是遗传物质，而不是蛋白质。1953年Watson-Crick提出DNA的双螺旋结构模型，从分子结构上阐明了DNA的遗传功能。

核酸（nucleic acid）是重要的生物大分子，它的构件分子是核苷酸（nucleotide），天然存在的核酸可分为脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）两类。DNA贮存细胞所有的遗传信息，是物种保持进化和世代繁衍的物质基础。RNA中参与蛋白质合成的有三类：转移RNA（transfer RNA，tRNA），核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）和信使RNA（messenger RNA，mRNA）。20世纪末，发现许多新的具有特殊功能的RNA，几乎涉及细胞功能的各个方面。

第一节碱基、核苷和核苷酸

一、核酸的种类、分布和化学组成

核酸分为两大类：脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）。

98％核中（染色体中）

真核mDNA）

核外

叶绿（ctDNA）

DNA 拟核

原核

核外：质粒（plasmid）

病毒：DNA病毒

RNA主要存在于细胞质中。

信使RNA －－mRNA

核糖体RNA－－rRNA

转移RNA－－tRNA

核酸的化学组成：对核酸的水解发现

（脱氧）核酸—--→（脱氧）核苷酸—------→P+（脱氧）核苷----→戊糖+碱基

由上面可知，核酸的结构单位是（脱氧）核苷酸，核苷酸由戊糖、磷酸和含氮碱三部分构成。

核酸分类的依据：戊糖的差异。另外碱基亦不同。

列表比较脱氧核糖核酸DNA和核糖核酸RNA的基本化学组成：

二、核苷酸组成元素

主要元素组成：C、H、O、N、P(9~11%)；与蛋白质比较，核酸一般不含S，而P的含量较为稳定

占9-11%；通过测定P 的含量来推算核酸的含量（定磷法）。

三、核酸基本组成单位：核苷酸

（一）含氮碱基（base）：构成核苷酸中的碱基是含氮杂环化合物，有嘧啶（pyrimidine）和嘌呤（purine）两类。核酸中嘌呤碱主要是腺嘌呤和鸟嘌呤，嘧啶碱主要是胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。DNA和RNA中均含有腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶，而尿嘧啶主要存在于RNA中，胸腺嘧啶主要存在于DNA中。

在DNA和RNA中，尤其是tRNA中还有一些含量甚少的碱基，称为稀有碱基（rare bases）稀有碱基种类很多，大多数是甲基化碱基。tRNA中含稀有碱基高达10%。

1）.嘌呤碱基：嘌呤（Pu）的结构及编号

A（腺嘌呤）的结构、G（鸟嘌呤）的结构2）.嘧啶（Py）碱基：嘧啶（Py

C（胞嘧啶）、T（胸腺嘧啶）、U（尿嘧啶）：以上各具体碱基的结构必须掌握要结合记忆。（二）戊糖pentose

核酸中有两种戊糖

DNA中为D-2-脱氧核糖（D-2-deoxyribose），RNA中则为D-核糖（D-ribose）。在核苷酸中，为了与碱基中的碳原子编号相区别核糖或脱氧核糖中碳原子标以C-1’，C-2’等。脱氧核糖与核糖两者的差别只在于脱氧核糖中与2’位碳原子连结的不是羟基而是氢，这一差别使DNA在化学上比RNA 稳定得多。

（三）磷酸phosphate

（四）核苷（碱基与戊糖结合物nucleoside ）

核苷是戊糖与碱基之间以糖苷键（glycosidic bond）相连接而成的糖苷。戊糖中C-1’与嘧啶碱的N-1或者与嘌吟碱的N9相连接，戊糖与碱基间的连接键是C-N糖苷键，一般称为N-糖苷键。

C-N糖苷键:嘧啶的N1位和嘌呤的N9位与戊糖的C1'原子共价相连。

RNA中含有稀有碱基，并且还存在异构化的核苷。如在tRNA和rRNA中含有少量假尿嘧啶核苷（用ψ表示），在它的结构中戊糖的C-1不是与尿嘧啶的N-1相连接，而是与尿嘧啶C-5相连接。

（五）核苷酸（核苷与磷酸结合nucleotide）

核苷与磷酸形成的酯。磷酸出羧基，戊糖出羟基。

1.戊糖有2’、3’、5’位自由-OH，因此可以形成2’、3’、5’-核苷酸，其中5’-核苷酸为默认的核

苷酸。

2.磷酸的个数可以有1、2、3，这是指TP、DP、MP与核苷形成的酯。表示为NMP、NDP、NTP，脱氧时加“d”，如ATP、dATP。

3.可以形成环状的核苷酸：一个磷酸以二个羧基与戊糖上的两个-OH形成酯，称为磷酸二酯键，这种键可以处在3’、5’之间（默认的环核苷酸），也可以处在2’、3’之间，没有处在2’、5’之间的。表示为c，如cAMP环腺苷酸，dcAMP。

所以遇到核苷酸时要注意是否脱氧，有几个磷酸，是否成环。

核苷酸在体内除构成核酸外，尚有一些游离核苷酸参与物质代谢、能量代谢与代谢调节，如三磷酸腺苷（A TP）是体内重要能量载体；三磷酸尿苷参与糖原的合成；三磷酸胞苷参与磷脂的合成；环腺苷酸（cAMP）和环鸟苷酸（cGMP）作为第二信使，在信号传递过程中起重要作用；核苷酸还参与某些生物活性物质的组成：如尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+），尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。

第二节磷酸二酯键与多核苷酸

一、核苷酸的连接方式

核苷酸之间是通过一个核苷酸的3'-OH 与另一分子核苷酸的5'-磷酸基形成3',5'-磷酸二酯键相连。二、多聚核苷酸

多聚核苷酸是通过核苷酸的5’-磷酸基与另一分子核苷酸的C3’-OH形成磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。

由脱氧核糖核苷酸聚合而成的称为DNA链；

由核糖核苷酸聚合而成的则称为RNA链。

多聚核苷酸的特点：

1.核苷酸之间的连接键:3′—5′磷酸二酯键。

2.两个末端：5′-磷酸端（常用5’-P表示）；3′-羟基端（常用3’-OH表示）

3.多聚核苷酸链的方向:5′→3′。

三、核酸的水解

碱基与戊糖形成N-糖苷键和磷酸之间形成的3',5'-磷酸二酯键都可以被水解。

（一）核酸的酸水解

糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解。嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸不稳定。水解嘧啶糖苷键，常需要较高的温度。

DNA 无嘌呤的DNA分子（pH4）

DNA（RNA）→碱基+戊糖+磷酸（强酸高温）

（二）核酸的碱水解

RNA易被碱水解，产生核苷酸；RNA→2'-核苷酸+ 3'-核苷酸。

DNA对碱稳定，但在l mol/L NaOH中加热100℃4 h，可得到小分子寡聚脱氧核苷酸。

DNA →DNA变性（但不被水解）

RNA的磷酸酯键易被碱水解（在RNA水解时，2′-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物）。DNA的磷酸酯键不易被碱水解。

（三）核酸的酶水解

磷酸二酯酶：非特异性水解磷酸二酯键的酶。

核酸酶：专一水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶。

限制性内切酶：能在特定部位限制性地切割DNA分子的核酸内切酶。

第三节碱基的性质

一、碱基的结构特征

碱基都具有芳香环的结构特征。嘌呤环和嘧啶环均呈平面或接近于平面的结构。

碱基的芳香环与环外基团可以发生酮式—烯醇式或胺式—亚胺式互变异构。

二、碱基的紫外吸收特征

由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，一般在260nm左右有最大吸收峰。

第四节核酸的结构

一、核酸的一级结构

核酸是由核苷酸聚合而成的生物大分子。组成DNA的脱氧核糖核苷酸主要是dAMP、dGMP、dCMP 和dTMP，组成RNA的核糖核苷酸主要是AMP、GMP、CMP和UMP。核酸中的核苷酸以3’，5’磷酸二酯键构成无分支结构的线性分子。核酸链具有方向性，有两个末端分别是5’末端与3’末端。5’末端含磷酸基团，3’末端含羟基。核酸链内的前一个核苷酸的3’羟基和下一个核苷酸的5’磷酸形成3’,5’磷酸二酯键，故核酸中的核苷酸被称为核苷酸残基。通常将小于50个核苷酸残基组成的核酸称为寡核苷酸（oligonucleotide），大于50个核苷酸残基称为多核苷酸（polynucleotide）。

DNA一级结构的研究方法

DNA测序的实验方法（20世纪70年代三大进展促进了DNA的测序工作——限制性核酸内切酶的发现；改进多核苷酸片段的电泳分离法；DNA的克隆技术）：酶法和化学法（Sanger和Gilbert法）

二、DNA高级结构（空间结构）

（一）DNA储存遗传信息的证据

1. 1944年O.T.Avery等人通过实验证明DNA是一个携带遗传信息的分子;

美国细菌学家埃弗里等(1944) 用肺炎双球菌转化实验首次证实了DNA是遗传物质，被誉为“现代DNA 研究历史平台”的构建者。

2. 1952年，A.Hershy和M.Chase通过噬菌体感染实验也证实DNA是遗传物质。

1952年，美国学者赫尔希(A·D·Hershey)和蔡斯(Chase) 分别用32P和35S标记噬菌体的DNA的磷酸基团和蛋白质衣壳的含硫氨基酸，然后感染大肠杆菌，证明DNA提供了遗传信息完成了病毒的复制。

用35S标记噬菌体的蛋白质外壳，使标记的噬菌体感染大肠杆菌，经短期保温后，噬菌体就附着在细菌上。然后用搅拌器（10000转/分）搅拌几分钟，使噬菌体与大肠杆菌分开，再用高速离心机使细菌沉淀，分析沉淀和上清中的放射性;用32P标记噬菌体DNA ，进行同样的验证实验。

结果：子代噬菌体外壳蛋白质没有35S标记；子代噬菌体DNA有32P标记；

(二)DNA的碱基组成是有规律的

DNA的碱基组成具有种属的特异性；碱基组成没有组织和器官的特异性；碱基定量关系：不管种属如何不同，但在所有的DNA中，A＝T，G＝C。从这些关系中可以得出，A＋G＝T＋C。

（三）DNA二级结构

提出的DNA双螺旋模型的依据：目前公认的DNA双螺旋结构模型的建立，主要有两方面的根据：

一是对各种DNA碱基组成的定量分析；二是对DNA纤维进行X光衍射结构分析。

对各种DNA碱基组成的定量分析（Chargaff规则）：

嘌呤与嘧啶的摩尔数相等：A=T；G=C；A+G=C+T；DNA的碱基组成具有种的特异性；DNA的碱基组成没有组织的特异性；年龄、营养状态、环境的改变不影响DNA的碱基组成。

对DNA纤维进行X光衍射结构分析：由Franklin和Wilkins提供，来源不同的DNA的二级结构非常相似。前者早逝，后者与Watson、Creck分享了诺贝尔奖。

1953年由Wilkins研究小组的Rosalind Franklin获得了高质量的X线衍射照片，发现了DNA晶体的X 线衍射图谱中存在两种周期性反射，并证明DNA是一种螺旋构象。

Watson-Creck的DNA二级结构模型（B-DNA，线状DNA）:美国Watson、英国Creck在1953/5的《Nature》上合作了一篇文章，第一次科学的提出了DNA二级结构模型。

1.双螺旋模型要点

①DNA分子是由两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴缠绕形成的右手双螺旋结构。②由脱氧核糖和磷酸间隔相连而成的亲水骨架在螺旋分子的外侧，而疏水的碱基对则在螺旋分子内部，碱基平面与螺旋轴垂直。③螺旋旋转一周正好为10个碱基对，螺距为3.4nm，这样相邻碱基平面间隔为0.34nm并有一个36?的夹角，直径为2 nm。④两条DNA链依靠彼此碱基之间形成的氢键而结合在一起。根据碱基

结构特征，只能形成嘌呤与嘧啶配对，即A与T相配对，形成2个氢键；G与C相配对，形成3个氢键。

⑤DNA双螺旋的表面存在一个大沟（major groove）和一个小沟（minor groove），彼此相间排列。小沟较浅；大沟较深，是蛋白质识别DNA碱基序列的基础。

2．DNA双螺旋的稳定因素

氢键:横向靠两条链间的互补碱基的氢键维持

碱基堆积力:纵向靠邻近碱基对之间的疏水的相互作用和范德华力构成碱基堆积力（主要作用力）。

离子键：介质中的阳离子（如Na+、K+和Mg2+）与磷酸基团的负电荷形成离子键，降低了DNA链磷酸基之间的静电排斥力

改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性

3.DNA双螺旋结构提出的生物学意义

该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征，最重要的是确认了碱基配对原则，这是DNA复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础。该模型的提出是本世纪生命科学的重大突破之一，它奠定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速发展的基石。

（四）DNA二级结构的多态性：B型、A型、Z-DNA

在Watson和Crick 的DNA双螺旋模型公布之后，通过对合成的已知序列的寡核苷酸的X-射线晶体衍射图的研究发现，存在着B型、A型和Z型DNA。B-DNA和A-DNA都是右手双螺旋结构，而Z-DNA 是左手双螺旋结构。生理条件下，DNA双螺旋大多以B型形式存在。

<1>A-DNA：B-DNA脱去部分结晶水而形成的，属粗短型DNA，仍为右手双股螺旋，螺距25?，直径26?，11bp/圈，进一步脱水可形成C-DNA。

<2>Z-DNA：左手双股螺旋，人工合成的d（GC）n，属瘦长型，螺距46?，直径18?，12bp/圈，大小沟不明显。用免疫学方法探得人体内有存在，是DNA分子局部的二级结构，意义在于封闭基因表达，使复制和转录的酶找不到大沟。

三、RNA的种类和结构

绝大部分RNA分子都是线状单链，但是RNA分子的某些区域可自身回折进行碱基互补配对，形成局部双螺旋。在RNA局部双螺旋中A与U配对、G与C配对，除此以外，还存在非标准配对，如G与U 配对。RNA分子中的双螺旋与A型DNA双螺旋相似，而非互补区则膨胀形成凸出（bulge）或者环（loop），这种短的双螺旋区域和环称为发夹结构（hairpin）（图3-19）。发夹结构是RNA中最普通的二级结构形式，二级结构进一步折叠形成三级结构，RNA只有在具有三级结构时才能成为有活性的分子。RNA也能与蛋白质形成核蛋白复合物，RNA的四级结构是RNA与蛋白质的相互作用。

RNA的种类：

mRNA：信使RNA，是从基因上转录下来去指导蛋白质合成的RNA。

tRNA：转运RNA，在蛋白质合成过程中运输aa。

rRNA：核糖体RNA，是核糖体的组成部分。

它们都是单链分子

（一）RNA的一级结构

1.tRNA的一级结构

tRNA占全部RNA的16%，细胞内tRNA的种类很多，估计有50多种。每一种氨基酸都有与其相对应的一种或几种tRNA。

tRNA一级结构的共同点: （1）由74～95个核苷酸组成。（2）含10～20% 稀有碱基。如DHU、I （3）3′末端为—CCA,5′末端大多pG，少数为pC。（4）分子中约20多个位置上的核苷酸是保守的。2.rRNA的一级结构

rRNA占细胞总RNA的80%左右，rRNA分子为单链，局部有双螺旋区域（图3-22）具有复杂的空间结构，原核生物主要的rRNA有三种，即5S、16S和23S rRNA。真核生物则有4种，即5S、5.8S、18S 和28S rRNA。rRNA分子作为骨架与多种核糖体蛋白（ribosomal protein）装配成核糖体。

所有生物体的核糖体都由大小不同的两个亚基所组成。原核生物核糖体为70S，由50S和30S两个大小亚基组成。30S小亚基含16S的rRNA和21种蛋白质，50S大亚基含23S和5S两种rRNA及34种蛋白质。真核生物核糖体为80S，是由60S和40S两个大小亚基组成。40S的小亚基含18S rRNA及33种蛋白质，60S大亚基则由28S、5.8S和5S ３种rRNA及49种蛋白质组成。

3.mRNA的一级结构

mRNA占细胞总量的3~5%，由特定的DNA区域转录合成。mRNA种类多，但每一种mRNA的数

量少。mRNA的更新速度快。

原核生物中mRNA转录后一般不需加工，直接进行蛋白质翻译。mRNA转录和翻译不仅发生在同一细胞空间，而且这两个过程几乎是同时进行的。真核细胞成熟mRNA是由其前体核内不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA）剪接并经修饰后才能进入细胞质中参与蛋白质合成。所以真核细胞mRNA的合成和表达发生在不同的空间和时间。mRNA的结构在原核生物中和真核生物中差别很大。

1. 原核生物mRNA结构特点

原核生物的mRNA结构简单，往往含有几个功能上相关的蛋白质的编码序列，可翻译出几种蛋白质，为多顺反子。在原核生物mRNA中编码序列之间有间隔序列，可能与核糖体的识别和结合有关。在5’端与3’端有与翻译起始和终止有关的非编码序列（图3-21），原核生物mRNA中没有修饰碱基，5’端没有帽子结构，3’端没有多聚腺苷酸的尾巴（polyadenylate tail，polyA尾巴）。原核生物的mRNA的半衰期比真

核生物的要短得多，现在一般认为，转录后1min，mRNA降解就开始。

2. 真核生物mRNA结构特点

真核生物mRNA为单顺反子结构，即一个mRNA分子只包含一条多肽链的信息。在真核生物成熟的mRNA中5’端有m7GpppN的帽子结构（图3-22），帽子结构可保护mRNA不被核酸外切酶水解，并且能与帽结合蛋白结合识别核糖体并与之结合，与翻译起始有关。3’端有polyA尾巴，其长度为20~250个腺苷酸，其功能可能与mRNA的稳定性有关，少数成熟mRNA没有polyA尾巴，如组蛋白mRNA，它们的半衰期通常较短。

真核生物成熟mRNA一级结构特点：（1）大多数真核mRNA的5′末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C′2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-；（2）大多数真核mRNA的3′末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾；（3）mRNA分子中每3个核苷酸为一组，决定肽链上某一个氨基酸，称三联体密码。

（二）RNA的二级结构

1.tRNA的二级结构——三叶草形

tRNA二级结构为三叶草型。配对碱基形成局部双螺旋而构成臂，不配对的单链部分则形成环。三叶草型结构由4臂4环组成。

氨基酸臂由7对碱基组成，双螺旋区的3’末端为一个4个碱基的单链区-NCCA-OH 3’，腺苷酸残基的羟基可与氨基酸α羧基结合而携带氨基酸。

二氢尿嘧啶环以含有2个稀有碱基二氢尿嘧啶（DHU）而得名，不同tRNA其大小并不恒定，在8-14个碱基之间变动，识别氨酰-tRNA合成酶。二氢尿嘧啶臂一般由3~4对碱基组成。

反密码环由7个碱基组成，大小相对恒定，其中3个核苷酸组成反密码子（anticodon），在蛋白质生物合成时，可与mRNA上相应的密码子配对。反密码臂由5对碱基组成。

额外环在不同tRNA分子中变化较大可在4~21个碱基之间变动，又称为可变环，其大小往往是tRNA 分类的重要指标。

TψC环含有7个碱基，大小相对恒定，几乎所有的tRNA在此环中都含TψC序列，识别核蛋白体（核糖体）上5SrRNA 。TψC臂由5对碱基组成。

（三）RNA的三级结构

二十世纪七十年代初科学家用X线射衍技术分析发现tRNA的三级结构为倒L形（图3-20b）。tRNA 三级结构的特点是氨基酸臂与TψC臂构成L的一横，-CCAOH3’末端就在这一横的端点上，是结合氨基酸的部位，而二氢尿嘧啶臂与反密码臂及反密码环共同构成L的一竖，反密码环在一竖的端点上，能与mRNA上对应的密码子识别，二氢尿嘧啶环与TψC环在L的拐角上。形成三级结构的很多氢键与tRNA

中不变的核苷酸密切有关，这就使得各种tRNA三级结构都呈倒L形的。在tRNA中碱基堆积力是稳定tRNA 构型的主要因素。

第五节核酸的性质

一、核酸的一般性质

1.DNA白色纤维状固体，RNA白色粉末状固体，都微溶于水，不溶于乙醇，因此常用乙醇来沉淀。DNA 溶于苯酚而RNA不溶，故可用苯酚来沉淀RNA。

2.DNA难溶于0.14mol/L的NaCl溶液，可溶于1—2 mol/L的NaCl溶液，RNA则相反，可据此分离二者。

3. DNA、RNA糖的颜色反应区别

核糖：苔黑酚法D－核糖＋浓盐酸＋苔黑酚→绿色

脱氧核糖：二苯胺法D－2－脱氧核糖＋酸＋二苯胺→蓝紫色

4．粘度大小：DNA>RNA，粘度由分子长度/直径决定，DNA为线状分子，RNA为线团。

二、两性解离

核酸含酸性的磷酸基团，又含弱碱性的碱基，为两性电解质，可发生两性解离；由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5。

RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2′-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNA没有这种作用。

三、核酸的紫外吸收

DNA和RNA溶液均具有260nm紫外吸收峰，核酸的λm＝260nm，碱基展开程度越大，紫外吸收就越厉害。

DNA或RNA的定量：当A＝1时，DNA：50ug/ml，RNA和单链DNA：40ug/ml，寡核苷酸：20ug/ml。根据A260/A280的比值判断核酸样品的纯度：：

DNA：A260/A280≈1.8 纯品；＞1.8 RNA 污染；＜1.8 pro 污染。

RNA：A260/A280≈2.0 纯品。

四、核酸的变性、复性与杂交

（一）核酸的变性

1.DNA的变性：在外界因素的影响下，维持DNA双螺旋的碱基堆积力和氢键遭到破坏，使DNA发生解链，物化性质随之改变，生物活性丧失的现象。

引起核酸变性的常见理化因素有加热、酸、碱、尿素和甲酰胺等。在变性过程中，核酸的空间构象被破坏，理化性质发生改变。由于双螺旋分子内部的碱基暴露，其A260值会大大增加。A260值的增加与解链程度

有一定比例关系，这种关系称为增色效应（hyperchromic effect）。

增色效应--核酸变性时，随着变性程度的增加，它的紫外吸收值A260显著增高的现象。

2．变性后的变化：一级结构不变，空间结构解体(双链解体成为两条单链); 生物活性丧失; 分子量不变；增色效应;粘度降低。

3.ＤＮＡ分子的热变性：如果缓慢加热DNA溶液，并在不同温度测定其A260值，可得到“S”形DNA 解链曲线（melting curve）。从DNA解链曲线可见DNA变性作用是在一个相当窄的温度内完成的。

解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260值作图，所得的曲线称为解链曲线。

DNA热变性是在一很窄的温度范围内进行，这个温度范围的中点叫解链温度。用Tm值表示。它表示有50％的DNA分子解链时的温度。

紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称熔解温度

当A260值开始上升前DNA是双螺旋结构，在上升区域分子中的部分碱基对开始断裂，其数值随温度的升高而增加，在上部平坦的初始部分尚有少量碱基对使两条链还结合在一起，这种状态一直维持到临界温度，此时DNA分子最后一个碱基对断开，两条互补链彻底分离。通常把加热变性时DNA溶液A260升高达到最大值一半时的温度称为该DNA的熔解温度（melting temperature Tm）。Tm是研究核酸变性很有用的参数。Tm一般在85～95℃之间，Tm值与DNA分子中G C含量成正比。

影响Tm的因素：（1）DNA 的均一性越高,Tm的温度范围越小。（2）G-C含量越高, Tm的值越大，当GC 的含量上升1%，则Tm上升0.4℃。马默多蒂（Marmur-Doty）关系式：Tm = 69.3+0.41(G-C)%，

或GC%=（Tm-69.3）×2.44 。（3）介质的离子强度较高时, Tm的值较大。（4）酸性条件下,核酸容易脱嘌呤,碱性条件下,核酸容易变性,通常加NaOH 降低Tm的值。（5）尿素,甲酰胺等化学试剂可以降低Tm的值,称作变性剂。

（二）DNA的复性

复性：DNA变性后，当温度缓慢下降时，解开的双链可以重新締合形成双螺旋的过程。

当热变性的DNA经缓慢冷却后复性称为退火（annealing）。

变性DNA分子复性形成双螺旋结构时其紫外吸收降低的现象称为减色效应。

DNA复性是非常复杂的过程，影响DNA复性速度的因素很多：（1）DNA大小。DNA片段越大，复性越慢。（2）DNA复杂程度。复杂程度越低,复性越快;（3）DNA浓度。DNA浓度越大，复性越快。（4）离子强度。增加盐浓度，两条互补链重新结合的速度加快。（5）复性温度。比Tm低25℃为DNA复性的最佳条件。一般在60℃左右。离子强度一般在0.4mol/L以上。

（三）核酸分子的杂交

具有互补序列的不同来源的单链核酸分子，按碱基配对原则结合在一起称为杂交（hybridization）。杂

交可发生在DNA-DNA、RNA-RNA和DNA-RNA之间。杂交是分子生物学研究中常用的技术之一，利用它可以分析基因组织的结构，定位和基因表达等，常用的杂交方法有Southern印迹法，Northern印迹法和原位杂交（insitu hybridization）等。

第六节DNA的超螺旋和染色质结构

一、DNA的三级结构--超螺旋

1 、双螺旋DNA分子在二级结构基础上进一步扭曲折叠形成的特定构象。

2 、环形双链DNA分子可以进一步扭曲成超螺旋结构，超螺旋是DNA三级结构的一种类型。超螺旋即DNA双螺旋的螺旋。分为负超螺旋、正超螺旋

细胞中的环状DNA一般呈负超螺旋.

二、DNA 拓扑异构酶

拓扑学:是数学的一个分支,专门研究物体变形后仍然保留下来的结构特征.

DNA的拓扑研究就是研究DNA发生变形后所形成的结构特征.

(一)DNA拓扑异构酶(DNA Topisomerase):DNA的拓扑异构体之间的转变是通过拓扑异构酶实现的。J.Wang 和W.Gellert首先发现了这种酶。

1.拓扑异构酶?：使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转录区，同转录有关。例：大肠杆菌中的ε蛋白.

2.拓扑异构酶Π：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。同复制有关。例：大肠杆菌中的DNA旋转酶.

（二）DNA在真核生物细胞核内的组装

真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是核小体。

核小体：由真核细胞的DNA与组蛋白结合成的核蛋白。组蛋白是碱性蛋白，富含Arg 和Lys。分为五类：H1 、H2A、H2B 、H3 、H4。

核小体由H2A 、H2B 、H3 、H4各两分子组成的八聚体和DNA的200个碱基对构成。146bp绕组蛋白八聚体外围盘绕1.75圈构成核小体核心，剩余DNA连接在相邻核小体核心之间，组蛋白H1结合其上，看起来似一串珠子。