PCR实验报告

pcr实验报告

7月19日高遄

实验目的：了解pcr技术原理，掌握最基础的pcr实验步骤。

实验试剂：模板dna，mg2+，buffer，dntps，taq dna聚合酶，引物，h2o，石蜡油。实

验原理：

? pcr全称聚合酶链反应，是体外快速扩增特定基因或dna序列最常用的方法。

? 基本原理：首先将双链dna分子在临近沸点的温度下加热分离成2条单链dna分子，

dna聚合酶以单链dna为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新的dna互补

链。pcr反应时，只要在试管内加入模板dna、pcr引物、四种核苷酸及适当浓度的mg2+，dna

聚合酶就能在数小时内将目标序列扩增100万倍以上。

（1）双链模板dna分子首先在高温下解开成长的单链，短链引物分子立即与该模板dna 两端的特定序列相结合，产生双链区。

（2） dna聚合酶从引物处开始复制其互补链，迅速产生与目标序列完全相同的复制品。

（3）在后续反应中，无论是起始模板dna还是经复制的杂合dna双链，都会在高温下

解

开成为单链，体系中的引物分子再次与其互补序列相结合，聚合酶也再度复制模板dna。

（4）由于在pcr反应中选用的一对引物，是按照与扩增区域两端序列彼此互补的原则

设计

的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始并朝反方向延伸的，每一

条新合成的dna链上都有新的引物结合位点。

（5）整个pcr的反应全过程，即dna解链（变性）、引物与模板dna结合（退火）、dna 合成（链的延伸）三步可以被不断重复。经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链

dna分子数，即两条引物结合位点之间的dna区段的拷贝数，理论上的最高值应该是2^n，能

进一步满足遗传分析的需要。

? 试剂作用：

（1）引物：dna复制的起始点，针对复制dna片段的两端，有5’引物和3’引物

（2） taq dna聚合酶：促进dntps与模板结合。

（3） buffer：tris-hcl反应缓冲液，taq dna聚合酶提供一个最适酶催反应条件。

（4） mg2+：对pcr扩增效率影响很大，浓度过高可降低pcr扩增的特异性，浓度过低

则

影响pcr扩增产量甚至使pcr扩增失败而不出扩增条带。

（5） dntps：底物，在引物引导下合成与模板互补的dna新链。

（6）石蜡油：防止pcr加热过程中dna蒸发。

? 试剂配置体积：

（1）热启动：94℃，5~10min （2）变性：94℃，45~60s。

（3）退火：50~65℃，1min。退火温度计算：tm-（5℃~10℃），tm（解链温度）=4（g+c）

+2（a+t）。

（4）延伸：72℃，1~1.5min。

（5）步骤（2）~（4）热循环25~30个周期

（6）保温：延伸72℃，10min ? 产物检测：凝胶电泳。

实验步骤：

（1）设计20μl体系各试剂配比：

（2）按照预先设计的20μl体积配置6管试管量，实际加入量如下表

（3）完成后分6管加入pcr管中，每管15μl体积，标注1-6号码。

（4）在前1-~4号pcr管中加入模板dna，在5号管中加入c3h模板作为阳性参照，6

号中不加任何模板dna，作为阴性参照。

（5）在加完模板的6管试剂中各加入20μl石蜡油

（6）将pcr管放入

pcr仪，按之前设定的加热温度与时间设置

a．热启动：94℃，2min；80℃，1min；

此时在各管中加入dntps 4μl b．变性：94℃，30s；

c．退火：65℃，1.5min；

d．延伸：72℃，2min 步骤b~d循环40次

e．保温：72℃，10min （7）完成后用3%琼脂糖凝胶（60ml）电泳进行检测。

实验结果：

pcr目标产物约为295bp 琼脂糖凝胶电泳结果如下图所示

1 2 3 4 5 6 marker 1、2号泳道为♂性小鼠dna模板的pcr产物

3、4号泳道为♀性小鼠dna模板的pcr产物

5号泳道为c3h阳性参照

6号泳道为阴性参照

由marker参照可知，pcr产物大小约为290~300bp篇二：聚合酶链式反应pcr实验报告

实验二聚合酶链式反应（pcr）

一、实验原理

聚合酶链式反应（pcr）是利用dna片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异

dna片段的技术。它应用热稳定的聚合酶，通过双链dna模板的热变性、引物退火和引物延

伸的重复循环，dna片段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的dna甚至单个细胞所含有

的dna起始，可产生ug量的pcr产物。

二、器材与试剂

1.器材：移液器，ep管，热盖pcr仪，电泳仪，量筒，锥形瓶，微波炉，电子天平，紫

外照色仪

2.试剂：引物，模板，taq dna聚合酶，原料（dntps），缓冲液与mg2+，h2o, 2*pcrmix

溶液，dna染料

三、实验步骤

pcr反应体系的建立

取离心管，依次加入试剂混匀

1．h2o 12μl

2．模板 1μl

3．引物t7 1μl

4．引物 sp6 1μl

5．2*pcrmix 15μl

pcr仪的热循环反应

把离心管放入pcr仪中，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成

1. 模板dna的变性：模板dna经加热至94℃左右一定时间后，使模板dna双链或经pcr

扩增形成的双链dna解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

2. 模板dna与引物的退火(复性)：模板dna经加热变性成单链后，温度降至56℃左右，

引物与模板dna单链的互补序列配对结合；

3. 引物的延伸：经加热至72℃左右dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下，

以dntp为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模

板dna链互补的半保留复制链。重复该循环30次，每次需要2-3分钟。

电泳检测结果

扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中，电泳结束后，放到紫外照射仪中进行透射，电泳明胶显

示清晰的条带，如下图所示加入的为1号样，出现在500bp左右条带，而预算结果为扩增出

492bp条带，故实验成功。

四、讨论

1. mg2+离子浓度对pcr扩增效率影响很大，浓度过高可降低pcr扩增的特异性浓度过

低则影响pcr扩增产量甚至使pcr扩增失败而不出扩增条带。

2. 变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增

而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低pcr扩增效率。

3. eb：溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖中的dna，可与dna结

合，用标准302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号。

4. 溴酚蓝：电泳指示剂，相当于300bp的dna的电泳速度。

5. 100bp dna markerⅰ是由单独的pcr扩增产物混合而成，已含有1xloading buffer,

可以直接电泳。包括11条双链dna片断：100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、

800bp、900bp、1000bp和1500bp。特异性加强500bp。每次上样4～5μl。

6. 模板一般采用50ng-1ug或102--105 拷贝，浓度过高反而会抑制反应的进行。

7. 引物的与模板的互补程度决定了pcr的特异性，常用0.1—0.5um，浓度过高则特异

性下降，会形成引物二聚体影响试验结果。

五、结果及结论：

经电泳检测到pcr扩增产物中出现500bp左右条带，pcr扩增成功。篇三：pcr扩增反应

的操作实验报告1 pcr扩增反应的操作实验报告

实验原理:

以单链dna为模板，4种dntp为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行

互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板dna得到极大程度的扩增。在微量离心管中，

加入与待扩增的dna片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的dna膜

板、四种dntp溶液、耐热taq dna聚合酶、mg2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板dna

在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列

配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在taq dna聚合酶的催化下，以

dntp为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的dna片段，该片段又可作为下一轮反应的

模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使

目的基因得以迅速扩增。因此pcr循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定dna

聚合酶在适当温度下催化dna链延伸合成。

实验步骤:一、pcr反应的条件

pcr反应条件为温度、时间和循环次数。

1．温度与时间的设置

（1）变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致pcr失败的最主要原因。

一般情况下，93℃～94℃ lmin足以使模板dna变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或pcr产物完全变性，就会导致pcr失败。

（2）退火（复性）温度与时间：退火温度是影响pcr特异性的较重要因素。变

性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板

dna比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，g+c含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。

（3）延伸温度与时间：taq dna聚合酶的生物学活性：70～80℃，150核苷酸

/s/酶分子；70℃，60核苷酸/s/酶分子；55℃，24核苷酸/s/酶分子；高于90℃时，dna 合成几乎不能进行。

（4） pcr反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高

的延伸温度不利于引物和模板的结合。pcr延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的dna片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10kb需延伸至15min。延伸进间过长

会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

2．循环次数

循环次数决定pcr扩增程度。pcr循环次数主要取决于模板dna的浓度，一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

二、pcr扩增产物分析

pcr产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。pcr产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。 1．凝胶电泳分析：pcr产物电泳，eb溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。pcr产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重pcr，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。

（1）琼脂糖凝胶电泳：通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。

（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。

2．酶切分析：根据pcr产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。实验结果：无篇四：dna提取+pcr+电泳实验报告

题目：水稻dna提取，扩增与电泳实验

组别：第三组

一、1掌握dna的提取技术2掌握pcr的相关操作3掌握了解电泳操作方法和步骤

二、实验原理：1、提取dna一般用水稻幼叶，先用机械方法液氮研磨植物组织使组织细胞破碎，然后加tps抽提液水浴提取dna，最后用无水乙醇沉淀dna即可。（dna提取原理） 2、dna在高温时可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。（pcr原理）3、琼脂糖凝胶电泳：借助琼脂糖凝胶的分子筛作用，核酸片段因其分子量或分子形状不同，电泳移动速度有差异而分离。

三、实验仪器和药品

液氮、镊子、手套、移液枪、枪头2ml和1.5ml离心管、水稻幼叶、研磨棒、琼脂糖、天平、pcr仪、loading buffer染色剂、灭菌双蒸水、摇床、离心仪、taq酶、mg2+buffer、dntp溶液、引物、tps抽提液、无水乙醇、电泳槽、goldview、tbe溶液、微波炉、锥形瓶、

量筒、pcr板、pcr盖、水浴箱、marker

四、实验步骤

1、dna提取

（1）取水稻叶子少量置于2ml离心管内，加入液氮研磨，带磨成粉状后，加1mltps抽

提液，然后将离心管放入75℃恒温水浴箱中至少半小时。同时将无水乙醇放入-40℃下冷冻（2）水域结束后，取出离心管放入离心仪中，13600r/min离心12min，然后小心的取出

离心管，将上清液转移到1.5ml离心管中0.5ml，加入600ul冷冻的无水乙醇，放入-80℃下

冻10min，拿出放入离心仪13600r/min离心5min （3）到处上清液，倒置，晾干约3h （4）加入双灭菌水60ml，放入摇床中振荡一夜。

2、pcr

（1）按所需配料表，向pcr板中加入双蒸水,mix,前引物，后引物，然后加入提取的dna，

混匀

（2）将pcr板放入pcr仪中运行ssr程序

3、电泳

（1）称取0.3g琼脂糖和30mltbe溶液。混匀倒入锥形瓶中，加热溶解混匀。