生化实验
一，酪蛋白的制备
1原理
等电点沉淀（选择性沉淀）
利用蛋白质在等电点时溶解度最低的性质。
注意：
调节溶液到蛋白质等电点时，可以使蛋白质溶解度最低，但是并不意味着蛋白质会沉淀出来。
2 步骤
牛乳2ml
40℃水浴预热10分钟（HAC缓冲液同时
预热）用滴管加入HAC缓冲液约2ml
（pH4.8）离心，3000转/分，15分钟
清液沉淀
用4ml蒸馏水洗涤离心，
3000转/分，15分钟
清液沉淀
95%乙醇洗涤离心，
2500转/分，10分钟
清液沉淀
乙醚2ml洗涤离心，
2500转/分，10分钟
清液沉淀
0.1NNaOH2ml
加水至10ml
待测
蒸馏水洗涤离心：出去沉淀中的可溶部分
95%乙醇洗涤离心，2500转/分，10分钟：除去沉淀中的脂类物质
乙醚2ml洗涤离心，2500转/分，10分钟：脱水
0.1NNaOH2ml加水至10ml：酪蛋白是酸性蛋白质，溶解于碱性溶液中，方便下次双缩脲法
测定
二，分光光度计的使用
“方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式
“100%T/0ABS”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)
“0%T”键：用于自动调整零透射比
“波长设置”旋钮：用于设置分析波长
步骤：
①打开电源开关，使仪器预热20分钟
②用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上
③打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉入光路
④盖好样品室盖，按“0%T”键调透射比零
⑤取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射比
⑥按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式(A)
⑦将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中
⑧打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖
⑨将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A
⑩将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数
实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布
三，Folin-吴宪法测血糖
原理
葡萄糖＋Cu(OH)2 Cu2O↓
Cu2O ＋磷钼酸钼蓝
钼蓝的蓝色深浅与葡萄糖的含量成正比
用比色法可测定血糖的含量
方法
1给试管编号1,2,3分别为标准管、测定管、空白管
2标准管加葡萄糖溶液，测定管加无蛋白滤液，空白管加蒸馏水
3混匀，在沸水中准确煮沸8min，取出勿摇，置冷水浴中冷却
4向三支试管中2ml磷钼酸试剂，混匀放置3min
5最后向三支试管均加入3ml蒸馏水定容，摇匀
6试管摇匀后，在620nm波长下，以空白管校零点，比色
四，质粒DNA的提取
试剂：
1. LB液体培养基（1L）
胰蛋白胨10g
酵母提取物5 g
NaCl 10 g
加去离子水至800ml 搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。
LB固体培养基（1L）
在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g
2. SolutionⅠ
50 mmol/L 葡萄糖
25 mmol/L Tris.·Cl (pH 8.0)
10 mmol/L EDTA (pH 8.0)
高压灭菌后，4℃保存备用。
3. SolutionⅡ(现用现配制)
0.2 mol/L NaOH
1% SDS
4. Solution Ⅲ（100 ml）
5mol/L KAc 60 ml
冰醋酸11.5 ml
水28.5 ml
配制成的溶液Ⅲ含3 mol/L钾盐、5 mol/L醋酸（pH 4.8）。
5. 氨苄青霉素（Amp）
用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20℃冰箱保存备用。
6.胰RNA酶
将胰RNA酶（RNA 酶A）溶于10 mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成10 mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。
7. 氯仿，乙醇，70%乙醇。
8.TE缓冲液
10mM Tris.HCl (pH7.4)
1mM EDTA (pH8.0
实验步骤：
1. 用灭菌的牙签挑取单菌落放入50ml LB液体培养基（含Amp 0.1 mg/ml ）中，37℃
振荡培养过夜。
2. 将菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中，12,000 rpm离心2min，去掉上清液。将EP管口
朝下，用滤纸吸干水分。
3.沉淀悬于100μL SolutionI 中, 涡旋使充分悬浮，盖子打开，室温放5分钟。
4. 加入200μL SolutionII，混匀（注意动作轻），冰浴5分钟。
5. 加入1μL RNase和150μL SolutionIII，上下颠倒5-10次，冰浴10分钟。
6. 12,000rpm，离心5min，将上清移至1个新EP管中，注意所取体积。
7. 加入2倍体积无水冰乙醇混匀（注意动作轻），-20℃沉淀10min。
8. 12,000 rpm离心3 min，加入1ml 70%乙醇振荡漂洗一次，再10000 rpm离心，去上清。
9.沉淀于-20℃保存备用。
五，PCR技术
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原
料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
步骤
1. 在0.2ml Eppendorf管内配制20μl反应体系
ddH2O：8.5ul
10x PCR buffer：2ul
dNTPs（2.5mM）：4ul
引物1 (2uM)：1ul
引物2 (2uM)：1ul
模板：1ul
MgCl2 2ul
Taq 酶：0.5ul
Taq聚合酶（置于冰盒上）应最后加入，尽量减少室温接触机会。加酶时吸头深入不可过深，酶量不能过多。
2按下述循环程序进行扩增
94℃5分钟，1个循环；（预变性）
94℃30秒（变性），52℃30秒（退火），72℃30秒（延伸），30个循环；
72℃延伸10 分钟（延伸）。
4℃保温。
六，a—互补与蓝白筛选
α-互补现象：
因为许多载体都带有一个β半乳糖苷酶（Lac Z）基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。当这种载体转入可编码β－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-β-D 硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为α-互补现象。
由互补产生的β－半乳糖苷酶(Lac Z)能够作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成Lac Z(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。
七，琼脂糖凝胶电泳
影响泳动率的四大因素：分子大小，电荷多少，颗粒形状，空间结构
不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA＞直线DNA＞开环的双链环状DNA
步骤：
1，用胶带将洗净，干燥的制胶板的两端封好，水平放在工作台上
2，调整好梳子的高度
3，取0.24克琼脂糖于30ml 0.5 X Tris硼酸中,在微波炉中使琼脂糖完全溶解，冷却到45~50度时倒入制胶板中
4，凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带
5，将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液
6，将待测样品与上样缓冲液混合后将样品依次加入样孔中：Loading buffer 5ul+待测样品2ul混合后点样
7，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动
8，电泳完后切断电源
八，双倒数作图法（米氏方程）
V=VmaxS/Km+Vmax
两边各做倒数，以1/Vmax为纵坐标，1/s为横坐标作图得出Km值和Vmas
九，蛋白质测定五种方法原理及优缺点
（一）凯式定氮法
蛋白质是含一定量氮的有机化合物。样品在凯氏烧瓶中经硫酸消化后，蛋白质分解，其中的氮与硫酸作用生成硫酸铵，再在强碱条件下蒸馏出氨，用硼酸吸收，以标准酸滴定，根据标准酸消耗的量，乘以一定系数，即可计算样品中蛋白质的含量。
缺点：
操作比较复杂、费时（8-10小时）
灵敏度低，适用于0.2-1.0mg氮测定。
优点：
测定结果准确、干扰少
常用于标准蛋白质含量的准确测定
（二）双缩脲法（Biuret法）
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
紫色络合物在540nm处有最大吸收，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
缺点：
灵敏度低1-20mg
优点：
快速（20-30min）、干扰物质少
不同蛋白质产生颜色的深浅相近
（三）紫外吸收法
此法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定280nm处的吸光度值可用于蛋白质含量的测定。
缺点：
准确度较低、干扰物质多
优点：
简便、灵敏、快速（5-10min）
不消耗样品，测定后仍能回收使用
此法适用于只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值
（四）Folin-酚试剂法（Lowry法）
此法是双缩脲法的发展，在碱性溶液中铜-蛋白质复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂），产生深蓝色（钼蓝和钨蓝混合物）。在一定的条件下，蓝色深浅与蛋白质的量成正比。
缺点：
费时（40-60min）、干扰物多
优点：
灵敏度高~ 5μg
这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一，应用比较广泛。
（五）考马斯亮蓝法（Bradford法）
考马斯亮蓝G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也有棕黑色变为蓝色，在595nm下测定的吸光度值与蛋白质的浓度成正比。
缺点：
费时（40-60min）、干扰物多
优点：
灵敏度高~ 5μg
这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一，应用比较广泛。
八种常用生化实验步骤
实验一基因的PCR扩增技术 一、实验目的与原理简介 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。 常规PCR反用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。二、复性。降低温度使DNA单链分子同引物结合。温度为55℃，时间1min。三、延深。升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。 PCR反应包含的七种基本成分： 1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg. 2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。 3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关。 4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。 5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。 6）一价阳离子：标准PCR缓冲液内含有50mmol/L的KCl，它对扩增大于500bp长度的DNA是有益的。 7）模板DNA：含有靶序列的模板DNA可以以单链或双链形式加入到PCR混合液中，闭环DNA的及增效率略低于线性DNA。 学习PCR反应的基本原理和基本技术。 了解引物设计的一般要求。 二、材料和试剂 10Х扩增缓冲液 4种dNTP贮存液（20mmol/L，PH 8.0） Tap DNA 聚合酶 5端引物（20μmol/L）及3端引物（20μmol/L） 模板DNA 琼脂糖凝胶 PCR仪（Bio-Rad公司）移液枪（0.5-10μL 5-50μL）枪头微量移液管 一、实验操作 1）按照以下次序，将各成分加到微量离子管内混合： 10Х扩增缓冲液2.5μl M g2+1.5μl 5端引物1μl
基础生物化学实验.
生物化学实验 实验基本原理 1 有效数字计算（结合电子天平的应用等） 加减法： 进行数字加减时，最后结果所保留的小数点后的位数应与参与运算的各数中小数点后位数最少者相同，其尾数“四舍五入”。如：0.124+1.2345+12.34=13.6979，应取13.70。 乘除法： 进行数字乘除时，最后结果的有效数字应与参与运算的各数中有效数字位数最少者为准，而与小数点的位数无关，其尾数“四舍五入”。如：1.23×0.12=0.1476,应取0.15。 2 误差分析 误差为实验分析的测定值与真实值之间的差值。误差越小，测定值越准确，即准确度越高。误差可用绝对误差和相对误差表示。 绝对误差= 测定值- 真实值 相对误差= 绝对误差÷真实值×100% 一般用相对误差表示结果的准确度，但因真实值是并不知道的，因此实际工作中无法求出分析的准确度，只得用精确度来评价分析的结果。 3 偏差分析（结合“可溶性蛋白或赖氨酸实验”要求掌握） 精确度表示在相同条件下，进行多次实验的测定值相近的程度。一般用偏差来衡量分析结果的精确度。偏差也有绝对偏差和相对偏差两种表示方法。 绝对偏差= 单次测定值- 算术平均值（不计正负号） 相对偏差= 绝对偏差÷算术平均值×100%
例如：分析某一材料糖含量，共重复测定5次，其结果分别为：16.1%，15.8%，16.3%，16.2%，15.6%，用来表示精确度的偏差可计算如下： 分析结果算术平均值个别测定的绝对偏差（不计正负） 16.1% 0.1% 15.8% 0.2% 16.3% 16.0% 0.3% 16.2% 0.2% 15.6% 0.4% 平均绝对偏差=（0.1%+0.2%+0.3%+0.2%+0.4%）÷5 = 0.2% 平均相对偏差= 0.2÷16.0×100% = 1.25% 在实验中，有时只做两次平行测定，这时就应用下式表达结果的精确度： 两次分析结果的差值÷平均值×100% 4 实验结果的表述：实验结果可用列表法（“影响酶作用的因素”常用）和作图法（综合实验用）表示。 第1章分光光度技术 分光光度技术是光学（光谱）分析技术的一种，它是利用物质的特征吸收光谱来对不同物质进行定性和定量分析的一项技术。我们将重点介绍紫外光-可见光分光光度法。 一、紫外光-可见光分光光度法的基本原理 1、讨论的波长范围：200～400nm的紫外光区和400～760nm的可见光区。 人肉眼可见的光线称可见光，波长范围在400～760nm；
生化实验操作考核要点(新)
【实验操作考核要点】 一、目的要求 1．掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。 2．了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。 3．正确操作使用刻度吸管和可调微量移液器。 4．熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。 5．正确掌握溶液转移的操作。 6．正确操作使用分光光度计。 二、操作考核内容 按百分制计。 1．吸量管操作（20分）； 2．可调式微量移液器操作（20分）； 3．溶液混匀操作（视具体情况，采用合适的混匀方法）（15分）； 4．溶液转移操作（10分）； 5．分光光度计比色操作（25分）。 6．整体表现（10分）。 三、操作考核标准 （一）吸量管操作（20分，每项操作5分） 1．执管 要求右手拿吸量管，左手拿橡皮球，只能用食指而不能用拇指按压吸量管上口来调节吸取液量的刻度；吸液、排液整个操作过程吸量管应始终保持垂直。 2．坐姿 要求腰、背保持竖直，看刻度时眼睛保持平视。 3．吸取溶液 吸量管插入液面深度约0.5cm，不能一插到底，也不能插入过浅而吸进空气致使溶液进入橡皮球内；调控吸量管吸取液量的刻度时，吸量管尖应离开液面靠在容器内壁上。 4．排出液体
吸量管尖应靠上受纳容器内壁，让管内溶液自然流出。不能用橡皮球吹压，而且在流净后吸量管尖停靠受纳容器内壁至少3秒。 （二）可调式微量移液器操作（20分，每项操作5分） 1．设定容量值 转动加样器的调节旋钮，反时针方向转动旋钮，可提高设定取液量。顺时针方向转动旋钮，可降低设定取液量。在调整设定移液量的旋钮时，不要用力过猛，并应注意使取液器显示的数值不超过其可调范围。 2．吸液 （1）选择合适的吸头安放在取液套筒上，稍加扭转压紧吸嘴使之与套筒之间无空气间隙； （2）把按钮压至第一停点，垂直握持加样器,使吸头浸入液面下2~3毫米处,然后缓慢平稳地松开按钮，吸入液体，等一秒钟，然后将吸头提离液面，贴壁停留2-3秒，使管尖外侧的液滴滑落。 3．放液 （1）将吸头口贴到容器内壁底部并保持100°~40°倾斜； （2）平稳地把按钮压到第一停点，等一秒钟后再把按钮压到第二停点以排出剩余液体； （3）压住按钮，同时提起加样器，使吸头贴容器壁擦过，再松开按钮。按吸头弹射器除去吸头。 4．压放按钮时保持平稳；加样器不得倒转；吸头中有液体时不可将加样器平放。取液器吸嘴为一次性使用。实验完毕，将取液器读数调至最大量程值，竖立放于支架上。 （三）溶液的混匀（操作流程中下划实线的三处，每项操作5分，共15分）1．肝糖原的提取与鉴定操作中，肝匀浆上清液中加5ml 95%乙醇后的混匀最好用倾倒混匀，也可用滴管或吸量管吸、吹混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。 2．肝糖原定量测定中，肝组织消化液沸水浴后全部转入100 ml容量瓶，加水至刻线后的混匀应采用倒转混匀。 3．肝糖原定量测定中，加蒽酮溶液后的混匀，可将试管倾斜约45o再作旋转混匀。因蒽酮溶液（浓硫酸配制）比重大于样品水溶液很多，一加入便沉于管
基础生化实验-蛋白质纯化
蛋白质纯化
一、目的: 利用金属亲和性管柱(metal affinity column)来大量纯化带有affinity tag的基因重组蛋白。 二、原理: 由于六个Histidine 所组成的His Tag (metal affinity tag)可与Ni2+ bind，所以利用基因重组技术在表现的蛋白质加上His Tag，再以金属亲和性管柱 (Ni-NTA) (此His- tag序列可与带二价正电的阳离子相螯和)及liquid chromatography来大量纯化蛋白质。 三、试剂与器材: 1.loading(binding) buffer (10mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl Ph7) ?细菌回溶成为蛋白质的载体以保持活性 2.wash buffer (20mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7) 3.elution buffer (20mM EDTA,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7) 上课补充: ?蛋白质很脆弱，需要在特殊的buffer里。
四、仪器与设备: FPLC(速液相色谱仪) 五、步骤: 1.将管柱架在铁架上，把亲和性胶体悬浮装填于管柱内。 2.以2~3倍CV loading buffer清洗管柱后，注入蛋白质样本。 3.以wash buffer梳洗，2到3倍column体积。 4.用wash buffer和elution buffer进行线性梳洗，并收集流出液体，以 FPLC UV monitor上的OD280数据读取样品流出与否，并观察冲离液之 曲 线图。 上课补充: ?胞内型分泌需要用超音波破菌，因为会放热所以要放在冰中使用。 ?线性梳洗为加入elution buffer会有颜色变化会把镍离子跟imidazole冲 洗掉，剩下胶体溶液。 ?其中imidazole和Histidine类似也会和镍离子结合所以会竞争，可拿来 洗涤蛋白质。(可详见问题一及补充资料2) 六、问题:
华中农业大学《生物化学实验》试卷
华中农业大学本科生课程考试试卷 考试课程与试卷类型：植物生理学实验原理与技术（A）姓名： 学年学期：2008－2009－1 学号： 考试时间：2009－－班级： 一、名词解释 ( 每题 4 分 , 共 12分 ) 1. 聚丙烯酰胺凝胶 2. 离心技术 3．可见光分光光度法/反相纸层析 二、填空题 ( 每空 2 分 , 共 42分 ) 1. 反相纸层析法分离油菜不饱和脂肪酸的实验中 ,分离后的不饱和脂肪酸经红氨酸溶液显色后 , 其最终产物颜色是（1）,从点样端起层析谱带所对应的脂肪酸依次是 (2) 、（3）、（4）、（5）、（6）。 2. 圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物酶同工酶的实验中 , 电泳时上槽接电源（7）极 ,下槽接电源 (8) 极 , 电泳开始电流应调节至每管（9）mA, 十分钟后电流调节至每管 (10) mA; 在上槽或样品中加入溴酚蓝是起（11）的作用。 3. 核酸提取过程中 , 将含有 DNA 的溶液置72℃处理 3 分钟，其目的是（12）；在淀粉酶活性测定过程中将淀粉酶液置于 70℃下处理 15 分钟的目的是（13）。 4．在微量凯氏定氮法测定植物组织中的总氮和蛋白氮，有三个主要的实验阶段，它们分别是（14）、（15）和（16）。在第二阶段，若收集三角瓶中的溶液颜色由_（17）变为（18），表明反应完全。第三阶段所用的标准浓度的滴定溶液名称是（19）。 5. DNA 提取研磨时加入的研磨缓冲液的NaCl浓度是（20），研磨时加入SDS的作用是（21）
三、是非判断题 (判断对错，对的标T，错的标F，每题 2 分，共 10 分 ) 1．萌发的小麦种子中含有很高活性的淀粉酶，其中α－淀粉酶不耐热，在70℃迅速钝化。（） 2．本学期测定还原性糖和可溶性蛋白含量时都用到了斐林试剂，这两个实验中所用的斐林试剂的配方是相同的。（） 3．DNA提取中，加入冷乙醇是为了使DNA分子复性变粗。（） 4．离心机使用中，要求同一台离心机所用的离心管都有相同的重量。（）5．油菜种子硫甙葡萄糖苷的快速分析法中，反应的实质是测定水解硫苷产生的葡萄糖的数量。（） 四、问答题（共36分） 1．试述维生素C测定的基本原理及其实验过程中的注意事项（12分） 2．简述凯氏定氮法测定蛋白质含量的基本原理。为什么一些不法商人要在蛋白质制品中加入三聚氰胺？（12分） 3．凝胶电泳法测定同工酶的原理是什么？为什么本学期所作的胶条染色后显示的谱带就是过氧化物同工酶带？（12分）
生化实验实验三蛋白质颜色反应及沉淀反应
实验三蛋白质颜色反应及沉淀反应 一、目的 1、掌握鉴定蛋白质的原理及方法。 2、熟悉蛋白质的沉淀反应。 3、进一步掌握蛋白质的有关性质。 二、原理 蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸种类不同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同的颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物质是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。 多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定性被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。 三、实验器材 1、鸡蛋白 2、试管 3、吸管 4、滴管 5、水浴锅等 四、实验试剂 1、卵清蛋白液：将鸡蛋白用蒸馏水稀释20-40倍，2-3层纱布过滤，滤液冷藏备用。 2、%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100ml。 3、10%氢氧化钠溶液：10g氢氧化钠溶于蒸馏水并稀释至100ml。 4、浓硝酸：比重。 5、1%硫酸铜溶液：硫酸铜1g溶于蒸馏水，稀释至100ml。 6、饱和硫酸铵溶液：蒸馏水100ml加硫酸铵至饱和。 7、95%乙醇。 8、结晶氯化钠。 9、1%醋酸铅：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml。 10、饱和苦味酸溶液。 11、1%醋酸溶液：冰醋酸1ml用蒸馏水稀释至100ml。 五、操作 1、颜色反应： A、双缩脲反应：蛋白质分子中含有肽键，与两分子尿素经过加热形成的双缩脲的结构相似，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物。 取一支试管，加蛋白质溶液10滴，再加10%NaOH溶液10滴及1%CuSO4溶液2滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。 B、黄色反应：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸。遇硝酸可硝化成黄色物质，此物质在碱性环境中变为橘黄色的硝苯衍生物。
生化实验
1．火 （1）酒精及其它可溶于水的液体着火时，可用水灭火 （2）汽油、乙醚、甲苯等有机溶剂着火时，应用石棉布或砂土扑灭，绝对不能用水，否则反而会扩大燃烧面积。 （3）电起火，不能用水和二氧化碳灭火器，应切断电源或用四氯化碳灭火器。 2．烧伤 （1）强碱烧伤：先用大量水冲洗，再用5%的硼酸溶液和2%的乙酸溶液冲洗。 （2）强酸烧伤：先用大量水冲洗，再用5%的碳酸氢钠或5%的氢氧化铵冲洗。 氨基酸的分离鉴定纸层析法 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层 析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的： 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大 小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量 和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨 基酸。 在操作过程中，手不要摸滤纸。 点样直径不超过3mm 。 点样的一端朝下, 扩展剂的液面需低于点样线1cm。 即时取出滤纸, 以免出现氨基酸层析跑到滤纸的外面不能检测。 蛋白质及氨基酸的呈色反应 双缩脲反应 紫红色肽键可用于蛋白质的定性或定量测定一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。 茚三酮反应 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH 条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。 与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。该反应十分灵敏，1∶1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。 黄色反应 含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。
生化实验基本原理及技术
生物化學實習 1 緒論 (一) 原理 1. 光依據其波長來分類： (1) 200nm~400nm 短波屬於紫外光 (2) 400nm~700nm 可見光波長 (3) 700nm~900nm 長波屬於近紅外光 2. 光通過溶液時，特定波長的光被吸收，眼睛察覺到的是沒有被吸收的波長。 核黃素會吸收450nm 的光，紅光與黃光會通過溶液而被肉眼所見。
第一單元 生化實驗基本原理及技術 2 圖1-1光譜儀 光譜儀可用來鑑定及定量純或不純的溶液中所含有的特定化合物，主要原理是基於兩個物理定律：1.柏朗定律；2.比爾定律 。 1. 柏朗定律：每單位厚度溶液其吸收入射光的比率為定值，被溶液吸收的入射光量與入射光強度無關。被每單位厚度溶液吸收的入射光比率為定值，每一單位厚度溶液若吸收10%的光，則光經過每一單位厚度溶液時，其強度即減少10%。 I ＝I 0 ? e -αι I ：穿透光強度 I 0：入射光強度 α ：溶液吸光係數 ι：光路徑長度 柏朗定律中以對數為底轉換公式，將吸光係數α轉換成比例常數K → log 10 I 0 / I ＝K ι log 10 I 0 / I ＝ 吸光值(absorbance ；A) 或光密度值(optical density ； OD)
生物化學實習 3 2. 比爾定律：光經過吸光物質所產生的吸光值，與溶液中每單位面積所含的吸光物質數目成比例。 比爾定律描述比例常數K 與待測吸光溶液中溶質的濃度有關。 K ＝εc ε：消光指數 c ：吸光物質濃度 I ＝ I 0? 10-εc ι log 10 I 0 / I ＝ A ＝log 1010εc ι＝ εc ι 當ι（光路徑長度）＝1 cm 時 log 10 I 0 / I ＝ A ＝log 1010εc ＝ εc 特定溶質在特定波長下，消光係數ε為一常數。因此，當吸光物質的濃度變成兩倍，於相同的光路徑下，被吸收的光量也會變成兩倍。 圖1-2 22 μM 溶於0.1M 磷酸鈉，pH 7.06，1公分 光路徑(light path)的條件下測定 波長 吸 光 值
2015高级生物化学及实验技术试题答案
高级动物生化试题 问答题： 1. 简述非编码RNA（non-coding RNA）的种类、结构特点及其主要功能。 非编码RNA的种类结构和功能 1tRNA转运RNA（transfer RNA，tRNA） 结构特征之一是含有较多的修饰成分，核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发现的。修饰成分在tRNA分子中的分布是有规律的，但其功能不清楚。5’末端具有G（大部分）或C。3’末端都以ACC的顺序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。有一个胸腺嘧啶环。tRNA具有三叶草型二级结构以及“L”型三级结构，tRNA 的不同种类及数量可对蛋白质合成效率进行调节。tRNA负责特异性读取mRNA中包含的遗传信息，并将信息转化成相应氨基酸后连接到多肽链中。 tRNA为每个密码子翻译成氨基酸提供了结合体，同时还准确地将所需氨基酸运送到核糖体上。鉴于tRNA在蛋白质合成中的关键作用，又把tRNA称作第二遗传密码。tRNA还具有其他一些特异功能，例如，在没有核糖体或其他核酸分子参与下，携带氨基酸转移至专一的受体分子，以合成细胞膜或细胞壁组分；作为反转录酶引物参与DNA合成；作为某些酶的抑制剂等。有的氨酰-tRNA还能调节氨基酸的生物合成。 2rRNA核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA） 核糖体RNA是细胞中最为丰富的RNA，在活跃分裂的细菌细胞中占80%以上。
他们是核糖体的组分，并直接参与核糖体中蛋白质的合成。核糖体是rRNA 提供了一个核糖体内部的“脚手架”，蛋白质可附着在上面。这种解释很直接很形象，但是低估了rRNA在蛋白质合成中的主动作用。较后续的研究表明，rRNA并非仅仅起到物理支架作用，多种多样的rRNA可起到识别、选择tRNA以及催化肽键形成等多种主动作用。例如：核糖体的功能就是,按照mRNA的指令将氨基酸合成多肽链。而这主要依靠核糖体识别tRNA 并催化肽键形成而实现。可以说核糖体是一个大的核酶( ribozyme)。而核糖体的催化功能主要是由rRNA来完成的,蛋白质并没有直接参与。 3 tmRNA tmRNA主要包括12个螺旋结构和4个“假结”结构，同时还包括一 个可译框架序列的单链RNA结构。tmRNA中H1由5’端和3’端两个末端形成，与tRNA的氨基酸受体臂相似。H1和H2的5’部分之间有一个由10-13nt 形成的环，类似tRNA中的二氢尿嘧啶环，称为“D”环。H3和H4，H6和H7，H8和H9，H10和H11之间分别形成Pk1，pK2，pK3，pK4。H4和H5之间则由一段包含编码标记肽ORF的单链RNA连接。H12由5个碱基对和7nt 形成的环组成，类似tRNA中的TΨC臂和TΨC环，称为“T”环。tmRNA 结构按照功能进行划分可分为tRNA类似域（TLD）和mRNA类似域（MLD），TLD主要包括H1,H2,H12,“D”环和“T”环，MDL则包括ORF和H5，这两部分分别具有类似tRNA和mRNA的功能。tmRNA是一类普遍存在于各种细菌及细胞器（如叶绿体，线粒体）中的稳定小分子RNA。它具有mRNA分子和tRNA分子的双重功能，它在一种特殊的翻译模式——反式翻译模式中发挥重要作用。同时，它与基因的表达调控以及细胞周期的调控等生命过程密切相关，是细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的重要分子之一。识别翻译或读码有误的核糖体，也识别那些延迟停转的核糖体，介导这些有问
基础生化实验 第三个实验 双缩脲
基础生化实验--双缩脲法测定蛋白质含量 双缩脲法测定蛋白质含量（考核实验） 一、教学目的与要求： ①加强对蛋白质的有关性质的认识； ②掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法； ③对学生所学进行综合的测试。 二、教学实验原理： 蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量氨基酸成分无关，因此利用此进行比色测定蛋白质含量。 在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540—560nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知的蛋白质浓度，标准蛋白溶液可以用结晶的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。 除-CONH-有此反应外，-CONH2-，-CH2-，NH2-，-CS-CS-NH2，等基团亦有此反应。 三、考核主要内容 1、标准曲线的制作 取6支干净的试管，按0→5编号，然后按下表依次加入试剂，充分混匀，在室温下放置半小时，以管为空白，在550nm波长处测定消光值（OD），以各管蛋白质含量（毫克）横坐标，OD值为坐标，画出标线。 编号0 1 2 3 4 5 蛋白质标准液（毫升）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（毫升） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 双缩脲试剂（毫升） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 2、样品测定：取样品液1.0 ml，同法进行，测其OD值，对照标准曲线求得未知液蛋 白质浓度。 3、分光光度计的使用：规定每组在10min以内全部完成操作（共测6支管）；同时注意 操作是否规范。
4、成绩的计算：此次的实验占30%（包括平时的表现及实验报告的完成情况和完成质 量），平时的五次实验共占70%，每次实验按总分为5分为满分进行打分，总评折合 成百分制。 四、实验注意事项： ①标准样品的浓度为：10μg/ml； ②实验过程中不得过问他人，同组人可以配合进行； ③实验报告在课堂上独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他人数据，一 旦发现以零分处理； ④实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； ⑤对实验结果进行简单的分析. 一、实验目的： 1.掌握分光光度计的使用方法。 2.掌握标准管法测物质含量的方法。 3.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法。 二、实验原理： 双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物，此反应即为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫红色化合物。其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，可以用比色法进行测定。双缩脲法最常用于需要快速但并不需要十分精确的测定。 三、试剂和器材 （一）试剂: 1.标准蛋白溶液（5mg/ml）:准确称取已定氮的酪蛋白(干酪素或牛血清白蛋白)用0．05mol/L氢氧化钠溶液配制，冰箱存放备用。 2.双缩脲试剂:溶解1.5g硫酸铜晶体(CuSO4·5H2O)和6.0g酒石酸钾钠晶体 NaKC4H4O6·4H2O)溶于500ml蒸馏水中，在搅拌下加入300ml10％氢氧化钠溶液，用水稀释到1000ml，贮存于内壁涂以石蜡的瓶内。此试剂可长期保存。
生物化学实验理论考试题答案
生物化学实验理论考试题答案 1.醋酸纤维薄膜电泳时点样端应靠近电极的哪一端，为什么？ 答；电泳时点样端应靠近负极，因为血清中各种蛋白质在PH为8.6的环境中均带负电，根据同性相吸，异性相斥原理，点样端在负极时蛋白质向正极泳动从而实现蛋白质分离。 2.用分光光度计测定物质含量时，设置空白对照管的作用,为什么？ 答；空白对照是为了排除溶剂对吸光度的影响。溶液的吸光度表示物质对光的吸收程度，但是作为溶剂也能吸收，反射和透射一部分的光，因此必须以相同的溶剂设置对照，排除溶剂对吸光度的影响。 3.简述血清蛋白的醋酸纤维薄膜的电泳原理？ 答；血清蛋白中各种蛋白质离子在电场力的作用下向着与自身电荷相反的方向涌动，而各种蛋白质等电点不同，且在PH为8.6时所带电荷不同，分子大小不等，形状各有差异，所以在同一电泳下永动速度不同从而实现分离。 4.何谓Rf值？影响Rf值的因素？ 答;Rf是原点到层析中心的距离与原点到溶剂前沿的距离之比。Rf的大小与物质的结构，性质，溶剂系统，层析滤纸的质量和层析温度有关，对同一种物质来讲Rf是一个常量。 5.什么是盐析？盐析会引起蛋白质的变性吗？一般用什么试剂? 答;盐析是指当溶液中的中性盐持续增加时，蛋白质的溶解度下降，当中性盐的浓度达到一定程度的时候，蛋白质从溶液中析出的现象。盐析不会引起蛋白质的变性，因为蛋白质的结构并未发生改变，去掉引起盐析的因素蛋白质仍能溶解；一般用饱和硫酸铵溶液进行盐析 6.简述DNS法测定还原糖浓度的实验原理？ 答;还原糖与DNS在碱性条件下加热被氧化成糖酸，而DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内还原糖的量与3-氨基-5硝基水杨酸颜色的深浅成正比，用分光光度计测出溶液的吸光度，通过查对标准曲线可计算出3-氨基-5硝基水杨酸的浓度，从而得出还原糖的浓度。 7.影响蛋白质沉淀的因素是什么？沉淀和变性有什么联系？ 答;水溶液中的蛋白质分子由于表面形成水化层和双电层从而形成稳定的亲水胶
基础生化实验内容2012版
实验一、考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白质含量 【实验目的】 学习、掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。 【实验原理】 考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合则呈现蓝色。染料的最大吸收从465nm变为595nm，蛋白质－染料复合物在595nm具有很大的光吸收值，蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为1ug蛋白质。本方法操作简便快捷，灵敏度高，测定范围1-1000ug。 【实验材料、仪器及试剂】 1．材料：新鲜的植物材料 2．仪器：722分光光度计，天平，离心机，研钵，容量瓶，试管，移液管，漏斗 （1）标准牛血清蛋白质溶液：0.1mg/ml （2）考马斯亮蓝G-250溶液： 【实验步骤】 1．样品的提取：准确称取鲜样2克，用2ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，转移到25ml容量瓶中并定容。在8000rpm冷冻离心10min，取上清液待测。 2．标准曲线的绘制：取8支具塞试管，按表1加入试剂。 将上面8支试管摇匀，放置5分钟后，用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。根据样品吸光值在标准曲线查得蛋白质含量。【结果计算】 C × V T 样品中蛋白质含量（ug/g.FW）＝ V S×W F×1000 式中： C为查标准曲线值（ug）； V T为提取液总体积（ml）； V S 为测定时加样量（ml）； W F为样品鲜重（g）。
实验二植物激素的酶联免疫吸附测定法（ELISA）免疫测定是利用抗原、抗体特异性反应而建立的，根据可视化方法的不同可分为：酶联免疫、放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、浊度免疫测定法等。由于酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assays, 简称ELISA）具有灵敏性、特异性高，且方便、快速、安全、成本低廉的特点，而日益被广泛应用于植物激素测定。目前，几大类植物激素IAA,ABA, GA3、GA4、iPA、ZR、DHZR等都建立了相应的ELISA方法并有试剂盒出售。 植物激素的酶联免疫检测方法有两种形式，一种是在固相载体上包被抗体（直接法），另一种是包被抗原（间接法）。 直接法利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进行竞争。间接法利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体进行竞争。 间接法的原理可用下式表示： Ab+H+HP=AbH+AbHP 其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素－蛋白质复合物。根据质量作用定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，结合物AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，即结合在板上的抗体就越少，通过酶标二抗检测结合物AbHP的多少，就可以确定游离H量的多少。 材料、试剂及设备 1 材料 各种新鲜植物材料 2 仪器设备 研钵，冷冻离心机，台式快速离心浓缩干燥器或氮气吹干装置，酶联免疫分光光度计，吸水纸，恒温箱，冰箱，酶标板（40孔或96孔），可调微量液体加样器（10μl，40μl,200μl,1000μl），带盖瓷盘（内铺湿纱布）。 3 试剂 (1) 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4 , 2.96g Na2HPO4 ·12H2O，用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为7.5。 (2) 样品稀释液：500 ml PBS中加0.5 ml Tween-20，0.5g明胶（稍加热溶解）。 (3) 底物缓冲液：称取5.10g C6H8O7·H2O（柠檬酸）， 18.43g Na2HPO4·12H2O，用量筒加1 000ml 蒸馏水，再加1 ml Tween-20，pH为5.0。 (4) 洗涤液：1000ml PBS加1mlTween-20。 (5) 终止液：2mol/L H2SO4。 （6）提取液：80％甲醇，内含1 mmol/L BHT(二叔丁基对甲苯酚，为抗氧化剂，先用甲醇溶解BHT，再配成80%的浓度))。 操作步骤 1．样品中激素的提取 （1）称取0.5-1.0g新鲜植物材料（若取样后材料不能马上测定，用液氮速冻半小时后，保存在-20℃的冰箱中），加2ml样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，转入10ml试管，再用2ml提取液分次将研钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后放置在4℃冰箱中。 （2）4℃下提取4h，3500转/min离心8min, 取上清液。沉淀中加1ml提取液，搅匀，置4℃下再提
大学生生物化学实验技能大赛初赛试题及答案
大学生生物化学实验技能大赛初赛试题及答案 一、选择题 1、下列实验仪器中，常用来取用块状固体药品的仪器是（）。 A. 药匙 B. 试管夹 C. 镊子 D. 坩埚钳 2、托盘天平调零后，在左盘衬纸上置氧化铜粉末，右盘衬纸上置1个5g砝码，游码标尺示数如下，此时天平平衡。则被称量的氧化铜质量为（）。 A. 8.3 g B. 7.7 g C. 3.3 g D. 2.7 g 3、用减量法从称量瓶中准确称取0.4000 g分析纯的NaOH固体，溶解后稀释到100.0 mL，所得NaOH溶液的浓度为（）。 A. 小于0.1000 mol/L B. 等于0.1000 mol/L C. 大于0.1000 mol/L D. 三种情况都有可能 4、已知邻苯二甲酸氢钾（KHC8H4O4）的摩尔质量为204.2 g/mol，用作为基准物质标定0.1 mol/L NaOH溶液时，如果要消耗NaOH溶液为25 mL左右，每份应称取邻苯二甲酸氢钾（）g左右。 A. 0.1 B. 0.2 C. 0.25 D. 0.5 5、NaHCO3纯度的技术指标为≥99.0%，下列测定结果哪个不符合标准要求？（）。 A. 99.05% B. 99.01% C. 98.94% D. 98.95% 6、精密称取马来酸氯苯那敏对照品12 mg，应选取（）的天平。 A. 千分之一 B. 万分之一 C. 十万分之一 D. 百万分之一 7、实验室标定KMnO4溶液，常用的基准物质是（）。 A. Na2CO3 B. Na2S2O3 C. Na2C2O4 D. K2Cr2O7 8、标定氢氧化钠常用的基准物质是（）。 A. EDTA B. K2Cr2O7 C. 草酸 D. 邻苯二甲酸氢钾 9、下列物质可以作为基准物质的是（）。 A. KMnO4 B. Na2B4O7·7H2O C. NaOH D. Na2S2O3 10、下列物质中，可以用直接法配制标准溶液的是（）。 A. 固体NaOH B. 浓HCl C. 固体K2Cr2O7 D. 固体Na2S2O3
实验三细菌生理生化鉴定-LOPAT试验
菌落圆形，污白色，全缘，微凹，光滑 实验三细菌生理生化鉴定-LOPAT试验 一、实验目的： 1）了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定lopat实验方法 二、实验材料： 猕猴桃溃疡病病原菌（分类地位薄壁菌门Gracilicutes，Proteobacteria纲假单胞菌科Pseudomonadaceae假单胞杆菌属Pseudomonas）、SPA培养基：蔗糖20g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000ml 对照SPA培养基：葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000ml Thornley培养基配方：蛋白胨1g，精氨酸10g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，酚红0.01g，琼脂6g，蒸馏水1000ml 1%二甲基对苯二胺盐酸盐，3×108 /ml的菌液（病原菌），烟草，马铃薯； 灭菌培养皿及培养基（平板）110套、未灭菌培养皿110套，接种针15个，试管110支，接种针55把，滤纸55张，试剂瓶55个，胶头滴管55支，喷壶55个 三、试验方法： 果聚糖试验（Levan formation）： 用细菌悬浮液，在SPA培养基上，再用葡萄糖代替蔗糖培养基平板上分别划线。在25℃条件下培养3–7 d，形成白色、粘稠、圆顶、隆起而有闪光的菌落为阳性反应。 在此条件下，在SPA培养基上可形成前述菌落，果聚糖试验为阳性；而在用葡萄糖代替蔗糖培养基上，不形成前述菌落。 氧化酶试验（oxidase reaction）： 在培养皿内放一张滤纸，滤纸上加3–4滴1%二甲基对苯二胺盐酸盐，使其湿润。用玻棒挑取生长24 h的菌苔涂在滤纸上，若菌苔在10 s内变成紫色，为阳性反应；在60 s以后变色或一直不变色，为阴性反应。 在此条件下，菌苔的氧化酶试验为阴性反应 氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶 马铃薯软腐试验（potato erroring capacity）： 在马铃薯上做刺伤伤口，将细菌接到伤口上，几天后观察，是否出现软腐。 精氨酸双水解酶检验（argine reaction）： 配制Thornley培养基。每试管装3–4 ml培养基灭菌，冷却，针刺接种细菌至培养基底部，立即用凡士林封管，在27℃条件下培养7 d。 在此条件下，精氨酸双水解酶为阴性，颜色不变。 细菌的精氨酸双水解作用是将精氨酸经过两步水解，生成有机胺和无机氨。鉴定细菌的精氨酸试验，无论发酵菌还是非发酵菌，革兰阳性菌还是革兰阴性菌，测的都是精氨酸双水解酶，使用脱羧酶试验培养基。所以，赖氨酸脱羧酶，鸟氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶用同一种基础培养基，为Moeller配方或Falkow配方，均须加盖石蜡油。对于发酵菌，细菌生长后，培养基变黄为阴性，变紫为阳性；对非发酵菌，培养基颜色不变为阴性，变黄为阳性。另有一种精氨酸双水解酶专用培养基，其中使用的是酚红指示剂。这种配方目前已不使用。细菌生化反应表中的精氨酸双水解酶的阳性百分率也不是在这种培养基上做的，所以，该配方实际已淘汰。 烟草过敏性反应（tobacoo hypersensitivity）：
生化试验基本技术
第二章生化实验基本技术 第一节离心分离技术 离心是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离的最常用的方法之一，也是生化实验室中常用的分离、纯化的方法。尤其是超速冷冻离心已经成为研究生物大分子实验室中的常用技术方法。离心机(centrifuge)是实施离心技术的装置。离心机的种类很多，按照使用目的，可分为两类，即制备型离心机和分析型离心机。前者主要用于分离生物材料，每次分离样品的容量比较大，后者则主要用于研究纯品大分子物质，包括某些颗粒体如核蛋白体等物质的性质，每次分析的样品容量很小，根据待测物质在离心场中的行为(可用离心机中的光学系统连续地监测)，能推断其纯度、形状和相对分子质量等性质。这两类离心机由于用途不同，故其主要结构也有差异。 一、离心原理 离心技术的主要原理就是将样品放入离心机转头的离心管内，离心机驱动时，样品液就随离心管做匀速圆周运动，于是就产生了一个向外的离心力。由于不同颗粒的质量、密度、大小及形状等彼此各不相同，在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不相同，由此便可以得到相互间的分离。 (一)离心力和相对离心力 离心力的单位为g，即重力加速度(980.6cm/S2)，离心力的大小可根据离心时的旋转速度V(r/min 每分钟转数，revolution per minute)和物体离旋转轴中心的距离r(cm)按下式计算：g=r×V2×1.118×10或按下式计算所需的转速：()r 89445 =。 ? V／ g 离心技术是根据微小颗粒物质在离心场中的行为建立并发展起来的。离心机的转头能够以稳定的角速度做圆周运动，从而产生一个强大的辐射向外的离心力场，它赋予处于其中的任何物体一个离心加速度，使之受到一个外向的离心力，其定义为： F = mω2r 式中：F为离心力的强度；m为沉降颗粒的有效质量；ω为离心转子转动的角速度，其单位为rad/s；r为离心半径(cm)，即转子中心轴到沉降颗粒之间的
医学检验生物化学考试复习题
2012年上半年生化考试复习题 一：单选题 1．琼脂糖凝胶电泳用pH8.6的巴比妥缓冲液可以把血清蛋白质分成五条区带，由正极向负极数起它们的顺序是：（ B ） A．白蛋白、β-球蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、γ-球蛋白 B．白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白 C．白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、γ-球蛋白、β-球蛋白 D．α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白、白蛋白 E．白蛋白、β-球蛋白、α1-球蛋白、γ-球蛋白、α2-球蛋白 2．已经确定的稳定而均一的物质，它的数值已由决定性方法确定，所含杂质也已经定量，该物质为:（ A ） A.一级标准品 B.二级标准品 C.校准品 D.控制物 E.参考物 3．从结构上看能较好的避免交叉污染的自动生化分析仪是:( B ) A.流动式 B.分立式 C.离心式 D.单通道式 E.多通道式 4．临床生物化学检验中应用最广泛的一类分析技术是：（ C A. B. C. D. E.原子吸收分光光度法 5．离心机砖头的旋转速度为20000γ/min的离心为：（ C ） A．低速离心 B．平衡离心 C．高速离心 D．超速离心 E．等密度离心 6．反映神经系统疾病最好的测定标本是：（ C ） A.血清 B.全血 C.脑脊液 D. E.溶血血清 7．由实验室自己配置或为商品，其中有关物质的量由参考方法定值的标准品为（ B ）A．一级标准品
B．二级标准品 C．控制物 D．参考物 E．原级参考物 8．经过详细的研究，没有发现产生误差的原因或在某些方面不够明确的方法为（ A ）A．决定性方法 B．推荐方法 C．参考方法 D．常规方法 E．对比方法 9．影响电泳的因素包括：（ D ） A.电场强度 B.电泳缓冲液的PH值 C.电泳缓冲液的离子强度 D.以上都是 E.以上均不是 10.干化学自动生化分析仪的光学系统是：（ B ） A.分光光度计 B.反射光分析仪 C.比色计 D.浊度计 E.原子吸收光谱仪 11.下列哪项不属于NCCLS所规定的纯水等级标准的特性指标：（ C ） A.微生物含量 B.电阻率 C.钙离子 D.PH值 E.硅 12.有关比浊测定法的描述哪项是错误的：（ D ） A.比浊法不是比色分析 B.比浊法分为化学比浊法和免疫比浊法 C.免疫比浊法分为透射比浊法和散射比浊法 D.分立式自动生化分析仪不能做散射比浊分析 Ｅ.干片式生化分析仪不能做比浊分析 13.临床生化实验室用水一般采用：（ B ） A.一级水 B.二级水 C.三级水 D.次级水 E.自来水 14. 生化质控目的是:（ E ） A.使随机误差逐渐缩小 B.消灭随机误差 C.使随机误差得到监测和及时发现
生化实验报告资料
生物化学实验报告 姓名：吴瑞 学号： 3120016004 专业年级： 2012级临床医学（妇幼保健) 组别：第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
一、实验室规则 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。