罗丹明荧光探针的设计、合成及光谱研究
罗丹明荧光探针的设计、合成及光谱研究
【摘要】：罗丹明类荧光染料具有独特的结构特性和突出的光物理性质,即在螺环状态下表现为非颜色和非荧光性质,而与客体分子作用生成其开环结构后表现为明显的颜色变化和荧光释放特性。将反应位点与罗丹明生色团相结合,设计出大量的基于罗丹明衍生物的荧光探针,不仅能够运用于识别传感阳离子,而且能用于阴离子、活性氧物质和中性分子的传感识别。本论文在总结前人工作的基础上,设计开发了四个基于罗丹明衍生物的荧光探针：罗丹明—吡啶甲酰肼衍生物、罗丹明—水杨甲酰肼衍生物、罗丹明—萘酰亚胺衍生物和罗丹明—吡啶腙衍生物。通过客体与探针分子作用后产生的独特光谱变化,采用荧光发射和紫外—可见光谱详细地研究了其传感性能,主要研究内容如下：将罗丹明和吡啶甲酰肼相结合得到了探针分子2-1,不仅能够通过与Cu2+的配位作用实现了在水溶液中对Cu2+的高选择性和高灵敏性的检测,而且利用C1O能定向氧化甲酰肼基团实现了对ClO的识别传感。实验结果表明,在乙腈/Tris-HC1(pH=7.0)缓冲溶液中,探针2-1与Cu2+形成了1：1的络合物并且结合常数为1.79×106M-1(R2=0.994),具有非常高的检测限(1nM)。在甲醇/Na2B407-NaOH(pH=12.0)缓冲溶液中对C1O-也显示出了很好的识别性能,其检测限可以达到1nM。相比于其它已经报道的Cu2+或C1O-荧光探针,这是第一个能在一个小分子中同时检测这两种离子的化学传感器。采用荧光”turn-on”策略来设计罗丹明铜离子配合物的CN-荧光传感器是非常困难的。因为氰离
子会将配合物中的Cu2+取代,生成没有颜色也没有荧光的罗丹明关环结构。将做为发色团的罗丹明B与水杨甲酰肼相连,我们设计合成了一个能够通过配位模式,导致荧光释放来传感识别氰离子的荧光探针3-1。化合物先与Cu2+发生配位作用并导致了明显的紫外吸收光谱变化,其与Cu2+的结合常数为1.7×107M-1。第一次培养出了罗丹明衍生物和铜离子络合产物的单晶,通过分析可以看出,两个水杨甲酰肼基团与两个Cu2+所形成的双铜中心近乎处于一个平面上,两个罗丹明基团处于垂直位置。由于化合物与Cu2+之间的强的配位作用和铜离子的强的荧光猝灭效应,我们将该配合物成功应用于CN-的识别。配合物3-1+Cu2+与氰离子的结合比为1：2,并且得到了高分辨质谱的证实。其对氰离子的检测限可以达到 1.4×10-7M,远远低于世界卫生组织(WHO)对饮用水中氰离子含量不得超过1.9μM的规定。基于FRET 机理,我们设计合成了一个基于罗丹明—萘酰亚胺的Hg2+比率荧光探针4-4。在甲醇／水=2/1(V/VpH=7.0,Tris-HCl,10mM)溶剂体系中探针能够和汞离子进行定量的1：1加汞脱硫反应,并进一步发生分子内成环反应而导致罗丹明开环结构,并释放出光信号。探针能够对Hg2+实现高效且具有高选择性的特异性识别,当主体浓度为0.1μM时,Hg2+浓度在0.030.08μM之间,汞离子浓度和荧光比值之间产生了良好的线性,说明探针对Hg2+浓度的检测可以在一个非常低的范围内进行。在单一分子中,同样条件下探针能够实现对不同物种的选择性识别,具有重要的实际应用价值。我们采用罗丹明肼毗啶腙化合物5-3,实现了在同一溶液中利用紫外可见光谱识别Cu2+,而通过明显的荧光增强来选
择性识别Fe3+。其与Cu2+的作用模式为两个探针分子结合一个铜离子,即按照2：1的化学计量比进行配位作用,结合常数为7.8×104M-2,并且这种结合是可逆进行的。探针在溶液中能够对 1.76×10-9M的Fe3+进行检测,具有潜在的应用价值。【关键词】：罗丹明识别荧光探针紫外—可见/荧光光谱
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：O621.3
【目录】：中文摘要14-16ABSTRACT16-19第一章综述19-571.1引言191.2荧光分子探针技术19-311.2.1荧光的产生19-201.2.2荧光化学传感器设计原理20-221.2.3荧光分子传感响应机制22-311.3罗丹明类荧光染料及其探针研究进展31-561.3.1罗丹明类荧光染料概述31-331.3.2罗丹明类Cu~(2+)荧光传感器33-371.3.3罗丹明类Hg~(2+)荧光传感器37-471.3.4罗丹明类Zn~(2+)荧光传感器47-481.3.5罗丹明类Fe~(3+)荧光传感器48-501.3.6罗丹明类其他金属离子荧光传感器50-531.3.7罗丹明类阴离子及活性氧物质荧光传感器53-561.4本论文研究工作的主要内容56-57第二章基于罗丹明B吡啶甲酰肼衍生物的Cu~(2+)和ClO~-荧光探针的研究57-762.1引言57-582.2仪器与试
剂58-592.2.1主要仪器582.2.2主要试剂58-592.3目标化合物的合成59-602.3.1化合物2-1的合成59-602.4目标化合物对Cu~(2+)的识别研究60-682.4.1pH对Cu~(2+)识别性能的影响60-612.4.2探针对Cu~(2+)识别紫外光谱性能及机理研究61-642.4.3探针对Cu~(2+)识别荧光光谱性能研究64-662.4.4探针对Cu~(2+)选择性和竞争性识别性能研究66-682.5目标化合物对ClO~-的识别研究68-752.5.1探针对ClO~-识别溶剂体系的筛选68-702.5.2探针对ClO~-的紫外光谱滴定研究702.5.3探针对C1O~-的荧光光谱滴定研究70-712.5.4探针对ClO~-选择性和竞争性识别性能研究71-722.5.5探针对ClO~-的检测限研究72-732.5.6探针对Cu~(2+)和ClO~-的颜色和荧光变化73-752.6本章小结75-76第三章基于罗丹明B-Cu(Ⅱ)配合物的荧光增强型氰离子化学传感器的设计合成76-993.1引言76-773.2仪器与试剂77-793.2.1主要仪器77-783.2.2主要试剂78-793.3目标化合物的合成793.3.1化合物3-1的合成793.4目标化合物的铜离子识别研究79-853.4.1化合物3-1的晶体研究79-813.4.2pH对Cu~(2+)识别性能的影响81-823.4.3时间对Cu~(2+)识别性能的影响823.4.4化合物3-1对Cu~(2+)的紫外吸收光谱滴定研究82-833.4.5探针对Cu~(2+)选择性和竞争性识别性能研究83-853.5探针对Cu~(2+)作用机理研究85-923.5.1化合物3-1对Cu~(2+)的晶体结构研究85-873.5.2化合物3-1对Cu~(2+)的JOB实验研究87-883.5.3化合物3-1对Cu~(2+)的质谱研究88-893.5.4化合物3-1对Cu~(2+)的结合常数的确定89-903.5.5化合物3-1对Cu~(2+)作用的红外光谱研究90-923.6配合物
3-1+Cu~(2+)与氰离子作用研究92-973.6.1配合物3-1+Cu~(2+)与氰离子作用动力学研究92-933.6.2配合物3-1+Cu~(2+)与氰离子作用荧光滴定实验研究93-943.6.3配合物3-1+Cu~(2+)与氰离子作用检测限研究943.6.4配合物3-1+Cu~(2+)与氰离子作用的选择性实验94-953.6.5配合物3-1+Cu~(2+)与氰离子作用的颜色和荧光变化95-963.6.6配合物3-1+Cu~(2+)与氰离子作用的机理研究96-973.7本章小结97-99第四章基于FRET机理的萘酰亚胺-罗丹明BHg~(2+)荧光比率探针99-1154.1引言99-1004.2仪器与试剂100-1014.2.1主要仪器100-1014.2.2主要试剂1014.3目标化合物的合成101-1044.3.1化合物4-2的合成1024.3.2化合物4-3的合成102-1034.3.3化合物4-4的合成1034.3.4化合物4-5的合成1034.3.5化合物4-6的合成103-1044.4目标化合物的汞离子识别研究104-1134.4.1pH对Hg~(2+)识别性能的影响1044.4.2时间对Hg~(2+)识别性能的影响104-1054.4.3探针4-4对汞离子的紫外吸收光谱滴定研究105-1064.4.4探针对Hg~(2+)紫外选择性和竞争性研究106-1074.4.5化合物4-4对Hg~(2+)的荧光光谱滴定研究107-1084.4.6探针对Hg~(2+)荧光选择性和竞争性研究108-1094.4.7探针对Hg~(2+)识别颜色及荧光变化109-1104.4.8探针对Hg~(2+)识别机理研究110-1114.4.9探针对Hg~(2+)识别FRET机理研究111-1134.5本章小结113-115第五章双通道检测Cu~(2+)和Fe~(3+)化学传感器的设计合成115-1275.1引言115-1165.2仪器与试剂1165.2.1主要仪器1165.2.2主要试剂1165.3目标化合物的合成116-1175.3.1合成方法1175.3.2主客体溶液配制1175.4目标化合物的
铜离子识别研究117-1225.4.1化合物5-3对铜离子的紫外吸收光谱滴定研究117-1185.4.2探针对Cu~(2+)选择性和竞争性识别性能研究118-1195.4.3探针对Cu~(2+)的检测限研究119-1205.4.4探针对Cu~(2+)作用的原理研究120-1225.5目标化合物的铁离子识别研究122-1255.5.1化合物5-3对铁离子的荧光发射光谱滴定研究122-1235.5.2探针对Fe~(3+)选择性和竞争性识别性能研究123-1245.5.3探针对Fe~(3+)的检测限研究124-1255.5.4探针对Cu~(2+)和Fe~(3+)识别颜色及荧光变化1255.6本章小结125-127第六章总结与展望127-1296.1论文工作总结127-1286.2工作展望128-129参考文献129-143攻读博士学位期间主要发表和待发表的论文143-145致谢145-146个人简况及联系方式146-148 本论文购买请联系页眉网站。
荧光探针设计原理
荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图 1.1)：1．识别结合基团(R),能选择性地与被分析物结合,并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。２．信号报告基团(发色团, F），把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号（荧光等)。3.连接基团(S),将信号报告基团和识别结合基团连接起来,根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。 图1．1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理 (1) 结合型荧光探针[２1］ +
Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1．２ 共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针,是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中,必须充分考虑下列三个方面的因素。(ａ） 受体分子的荧光基团设计、合成:考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性）,Ｓｔｏｋｅs 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象)，荧光发射最好要在长波长区(最好位于5０0 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰,另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力(如氢键、范德华力等）作为理论指导,多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(ｃ) 荧光超分子受体的组装:组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团通过共价键连接在一起,要充分考虑到识别基团和荧光
荧光比率探针及其应用研究进展
７ 前 言 荧光比率技术是荧光分析中的一项重要技术。该技术在生物染色剂中，可被紫外线或蓝紫光（短波长光）激发而发射荧光的染料，称为荧光染料（荧光色素）。可被长波长光激发，这些荧光色素常称为荧光探针。荧光探针通常用于固定组织和细胞的染色，以及或活细胞中的应用， 此外还包括应用于体内荧光探针。 分子荧光探针按用途分类包括离子探针、极性探针、粘度探针、ＰＨ值探针、膜荧光探针、细胞活性探针、细胞器探针、位点特异性荧光探针等等。探针通过与分析物（如生命金属离子）进行结合后，引起荧光特性发生变化，通过测定荧光的激发波长、发射波长、荧光强度、峰位、荧光寿命、荧光量子产率和各向异性等，获得相关信息。 荧光方法测定中，荧光探针在与反应物结合后，出现激发或发射光谱移位的探针，可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率进行测定，称为比率测量。因为通过二个选择性的波长的荧光强度变化可作为定量的依据， 通常指在波长范围内有荧光强度明显的变化。同普通荧光探针相比，比率测量探针可以被分为两部分。 一种是荧光比率效果是通过原来荧光谱的迁移。通常，这些迁移的背景是荧光探针激发态的电子转移。它被激发通过改变发色团同周围分子或原子交互作用的能量改变（溶剂化显色迁移），同外部电场的交互作用（电致显色迁移）和在发色团中的双电弛豫（双电弛豫迁移）。 另外一种结合探针，荧光谱包括２个或更多的谱带。通常，是这些谱带相对强度的改变，激发态同荧光探针发色团反应。这些反应在不连续的能量状态。 荧光比率探针及其应用研究进展 杨柳＊ ，郭成海，张国胜 （防化研究院第四研究所，北京 １０２２０５） 摘要 本文介绍了荧光比率探针，包括阳离子探针、阴离子探针、ｐＨ值探针、极性探针、氧化性和分子的比率测量探针的应用及近几年的研究进展。关键词 荧光分析，比率测量 ＊作者简介：杨柳（１９７５－），男，助理研究员，博士研究生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｌｉｕｊｉｎｊｉｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ 所以在初始和产物状态都随着能量转移而发射荧光。 荧光比率测定法可消除光漂白和探针负载和留存及设备因素（照明稳定性）引起的数据的失真。如阴离子探针可通过有机离子载体从细胞排除，如ＡＭ酯可被Ｐ糖蛋白多药载体排出荧光比率测定法可减少探针渗漏对实验结果的影响。探针与离子结合后，出现激发或发射光谱移位的探针可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率校准，可克服由于离子浓度的变化而造成的荧光信号人工假象。 Ｂｒｉｇｈｔ等（１９８９）发现比率测量减少或消除几种决定因素的变化对测量荧光强度的影响，包括探针浓度、激发光的光路长度、激发强度、和检测效率。消除的人工假象包括光漂白、探针渗漏、细胞厚度、探针在细胞内（区室化作用引起）或不同细胞群之间（负载效率差异造成）的不均匀分布。 比率测量探针已经应用于不同的测量领域：离子探针（阳离子探针Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋，Ｚｎ２＋，Ａｇ＋等）阴离子探针（Ｃｌ－，ＣＮ－，Ｆ－等），膜探针、活性氧和一氧化氮探针，极性探针、ＰＨ值探针等等。 １应用比率测量的阳离子探针： 各种各样的阳离子在生命活动中起重要的作用， 如构成细胞和生物体某些结构的重要成分，参与并调节生物体的代谢活动等，荧光方法通常用来测定阳离子在生物体不同组织的含量和分布。阳离子比率测量探针也在不断发展。 １．１ Ｃａ２＋检测的比率测量探针： 探针与Ｃａ２＋结合后出现光谱移位的探针可进行比率测量。主要包括：Ｆｕｒａ－２、双－ Ｆｕｒａ－２、Ｆｕｒａ－４Ｆ、Ｆｕｒａ－５Ｆ、Ｆｕｒａ－６Ｆ、 ｉｎｄｏ－１、ｉｎｄｏ－５Ｆ、ｍａｇ－Ｆｕｒａ－２
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荧光探针汇总
1.Fluo-3 AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3 AM的荧光非常弱，进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，和细胞内游离 的钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长506nm 发射波长526nm （绿色） 备注推荐使用 2.Mag-fura-2 AM（钙离子荧光探针） 原理Fura-2 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura-2 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fura-2，从而被滞留在细胞内。Fura-2可以和钙离子结合，结合 钙离子后在330-350nm激发光下可以产生较强的荧光，而在380nm激发光下则会 导致荧光减弱。这样就可以使用340nm和380nm这两个荧光的比值来检测细胞内 的钙离子浓度，可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异，荧光探针的渗 漏，细胞厚度差异等一些误差因素。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长为340nm和380nm 发射波长510nm （蓝色） 备注仪器滤光片不适用 3Fluo-4-AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo 4 是一种将Fluo 3结构中的Cl替换成F的钙荧光探针。由于将Cl替换成了电子吸引力更强的F，它的最大激发波长会向短波长处偏离10 nm左右。所以用氩 激光器激发时，Fluo 4的荧光强度比Fluo 3强1倍。由于Fluo 4与钙离子的亲和力 和Fluo 3近似，所以使用上和Fluo 3也基本相同 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长494nm 发射波长516nm （绿色） 备注用激光器激发时荧光强度强，因此不推荐 4.DCFH-DA （活性氧荧光探针） 原理DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长485nm 发射波长520nm （绿色） 备注推荐使用 5.DHR 123 （活性氧荧光探针） 原理本身无荧光, 在超氧化酶存在时可被过氧化氢(H2O2)氧化, 转变成发射绿色荧光的罗丹明123 (Rhodamine 123), 因此广泛应用于检测细胞内活性氧(ROS), 如过氧化物, 次氯酸和过氧亚硝基阴离子等。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长507nm 发射波长529nm （绿色） 备注氧化后成罗丹明123，荧光强度可能受到线粒体膜电位的影响 6.RhodamineI23 （线粒体膜电位荧光探针） 原理细胞膜通透的阴离子绿色荧光染料, 能够迅速被活线粒体摄取, 而无细胞毒性。 生理意义标记线粒体膜电位 激发波长488nm 发射波长515 ~ 575nm （绿色） 生理意义检测线粒体膜电位
罗丹明类荧光探针研究进展_吴豪
罗丹明类荧光探针研究进展 吴豪，袁文兵* (海南大学材料与化工学院，海南海口 570228) [摘要]文章主要介绍近年来罗丹明衍生物在分子探针方面研究的一些新进展，系统阐述了该类探针分子在离子和小分子检测方面的应用。 [关键词]罗丹明；荧光探针；离子检测 [中图分类号]TQ [文献标识码]A [文章编号]1007-1865(2011)06-0265-01 Recent Progress in Rhodamine-Based Fluorescence Chemosensor Wu Hao, Yuan Wenbing* (College of Materials and Chemical Engineering, Hainan University, Haikou 570228, China) Abstract: The recent progress in the studies on rhodamines-based fluorescent probes was reviewed. The application of Rhodamine chemosensors in ions and small molecules sense were discussed in detail. Keywords: rhodamine；fluorescent sensor；ions sense 罗丹明B是重要的荧光探针材料，属于呫吨类染料。罗丹明B具有高的消光系数，较好的荧光量子产率，水溶性好，无毒，制备成本低等优点。因此，它是一类较好的荧光探针母体，极具广泛的应用价值。在中性或碱性条件下，罗丹明B内酰胺化合物以螺环状结构存在，体现紫外区吸收，无色，荧光减弱至消失。在酸性条件下以醌式结构存在，内酰胺结构开环，有荧光，体现长波吸收，成紫红色。 罗丹明基荧光染料由于其具有特殊的结构及相应的结构特性，使其广泛应用于化学分析和生命科学领域。目前的研究焦点多集中于通过不断修饰、优化罗丹明荧光分子探针的结构片段，以实现对小分子及离子的特异性识别，并进一步应用于生物活体及自然环境监测领域。 1 铜离子探针 铜是人体重要的微量元素，机体内铜缺失会导致代谢紊乱和诸多疾病，如胆固醇升高，动脉弹性降低，血压升高。一直以来，铜离子生物荧光探针的研究是一个热门课题。 1997年，Czarinik等[1]合成了罗丹明B酰肼，其可以选择性识别铜离子，该荧光探针是基于铜离子催化罗丹明B酰肼水解生成强荧光的罗丹明B分子的。 2006年，AijunTong等[2]合成水杨醛罗丹明B酰腙，可以可逆性的荧光增强识别铜离子。也就是说，在缓冲溶液中，当加入铜离子时，内酰胺螺环状结构被打开，吸收和荧光增强，当加入络合剂EDTA时，化合物表现出没有吸收和荧光，而在此时再加入铜离子，荧光恢复。 Yang等[3]通过在酸性条件下罗丹明B-酰肼与硫氰酸甲间的一步反应合成了一种Cu2+荧光探针。向该探针的乙腈/水溶液中添加Cu2+后，会造成荧光分子内酰胺键断裂，从而引起体系的荧光和紫外吸收明显增强。利用该探针实现了水相中Cu2+荧光和紫外检测，方法的线性范围分别为0.2~0.4和0.5~10 μmol/L。他们将该方法应用于自来水中Cu2+含量的测定，测定结果与原子吸收光谱方法测定结果一致。 Zhao等[4]在2009年设计合成了一种新型罗丹明内酰胺衍生物5，并将其应用于水溶液和活体细胞中Cu2+的检测。这种比色探针对铜离子的反应是瞬时可逆的,并且在其它金属离子浓度很高的情况下也不会对铜离子的比色和荧光信号产生干扰，这一特征使其很好地满足了生物医学和环境监测方面的特殊要求。目前，该类探针已广泛应用于环境体系中铜离子浓度的检测和生物活细胞铜离子分布成像实验，其优异的综合性能预示了极好的应用前景。 2 铁离子探针 铁是人体中所必须的微量元素，它在人体中主要以络离子的形式存在，与血红素、蛋白质等形成血红蛋白和肌红蛋白，在机体中起到运输和贮存氧的作用。由于Fe3+的顺磁性，一般的Fe3+荧光探针都是荧光熄灭型，不利于在牛物体内Fe3+的荧光成像及原位检测。因此利用罗丹明分子的闭环一开环间转换机理设计荧光增强型Fe3+荧光探针逐步受到重视。 2006年，Tong等[5]利用二乙基三胺将两个罗丹明B连接起来，从而形成无色，没有荧光的罗丹明B的衍生物，三价铁离子的加入，导致其内酰胺结构的开环，荧光增强，从而实现了对三价铁离子的检测。 2007年，Tae和Bae[6]利用肟酸作为Fe3+识别点的功能团，将氧肟酸引入罗丹明内酰胺和开环结构的平衡中。得到了一种新型的Fe3+探针。这种具有氧肟酸结构片段的罗丹明基荧光探针，在甲醇一乙腈(V∶V=1∶1)溶液中能很好的识别Fe3+，产生明显的荧光增强和颜色变化。 Peng等[7]通过乙二胺将2-羟基苯甲醛与罗丹明6G相连接，合成了一种Fe3+荧光探针。内酰胺的羰基氧原子、2-羟基苯甲醛上的羟基氧原子以及乙二胺上的氮原子同时参与了 Fe3+的螯合作用，导致了内酰胺键断裂，体系的荧光性增强。其他重金属和过渡金属离子无类似现象发生。 3 汞离子探针 汞是具有很高毒性的金属。汞单质及汞离子可通过各种途径进入环境，人体长期接触并摄入后会产生严重的恶心、呕吐、腹痛以及肾功能损伤等病症，危害极大。由于人们对汞毒性的高度重视，近年来对Hg2+荧光探针的研究日益增多。 Saresh等[8]以罗丹明6G为母体合成的Hg2+的荧光探针L1在水和甲醇(1∶1，φ)混合溶液中与Hg2+形成Hg (L1)2型复合物，荧光强度提高了90倍，利用L1测定Hg2+的检测线打到1 μg/L。25倍Hg2+浓度的Co2+，Fe2+，Ni2+，Zn2+，Pb2+，Cd2+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Li+，K+和Na+等离子对荧光信号基本无干扰。因而L1是一种高选择性、高灵敏度的Hg2+荧光探针。 Xu等[9]设计合成了一种罗丹明硫酰肼用于紫外和荧光检测水相中Hg2+，探针与Hg2+结合的化学计量比为2∶1.Qian等[10]设计合成的高选择性的罗丹明类Hg2+荧光探针不仅可以实现对Hg2+的荧光检测，而且利用显色反应可以对Hg2+的存在进行初步判断。该探针具有可逆性，当向显色的平衡体系中加入EDTA后，体系的紫红色变为无色。另外，荧光响应速度快是该探针的另一特点，Hg2+加入后立即产生稳定的强烈荧光，与同类的探针需要一定的平衡时间相比，该探针更适合于环境或者生物样品的实时分析。 2005年，Tae等[11]报道了一种十分精妙的罗丹明6G衍生物12，它可用于水溶液中Hg2+高灵敏度和高选择性的检测，即可以检测水溶液中低于2 μmol／L的Hg2+。 重金属与过渡金属离子的检测一般在水相中进行，尤其是生物体内的该类离子的原位检测对探针的水溶性提出了更高的要求。因此，在设计时要考虑探针的实用性，尽量引入具有一定水溶性的辅助基团。Huang等[16]将葡萄糖与罗丹明6G酰肼共价连接，合成了一种水溶性好、高选择性、高灵敏度的Hg2+荧光探针RGl。在纯水中，Hg2+的检测限达到1 μg/L，满足美国EPA规定。该探针可以在pH在5.5~10范围内使用，而且不受环境和生物样品中常见的其他金属离子的影响。因此，RGl可以应用在环境和生物体系，如细胞膜中汞离子的检测。另外，RGl与汞离子的结合是可逆的。向RGl和Hg2+共存的稳定体系中加入Na2S后，可以降低该体系的荧光强度，而再添加Hg2+时，体系的荧光则恢复。 (下转第243页) 新工艺新技术 [收稿日期] 2011-05-05 [作者简介] 吴豪(1988-)，男，河南人，本科，主要研究方向为罗丹明类荧光探针。*为通讯作者。
荧光探针汇总
精心整理 1. Fluo-3AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo-3AM 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3AM 的荧光非常弱，进入细胞后可以 被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，和细胞内游离的钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长506nm 发射波长526nm （绿色） 备注推荐使用 2. Mag-fura-2AM （钙离子荧光探针） 原理Fura-2AM 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura-2 AM 进入细胞后可以被细胞内的酯 3 4. 成5. 原理本身无荧光,在超氧化酶存在时可被过氧化氢(H2O2)氧化,转变成发射绿色荧光的罗丹明 123(Rhodamine123),因此广泛应用于检测细胞内活性氧(ROS),如过氧化物,次氯酸和过氧亚硝基阴离子等。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长507nm 发射波长529nm （绿色） 备注氧化后成罗丹明123，荧光强度可能受到线粒体膜电位的影响 6. RhodamineI23（线粒体膜电位荧光探针） 原理细胞膜通透的阴离子绿色荧光染料,能够迅速被活线粒体摄取,而无细胞毒性。 生理意义标记线粒体膜电位 激发波长488nm 发射波长515~575nm （绿色） 生理意义检测线粒体膜电位
备注正在使用 7.Hoechst33342（DNA荧光探针） 原理Hoechst33342是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测。Hoechst 染料可透过细胞膜在聚AT序列的富集区域的小沟处与DNA结合并对DNA染色而发出强 烈的蓝色荧光。 生理意义标记双链DNA 激发波长355nm发射波长465nm（蓝色） 备注正在使用 8.FDA 原理FDA可透过细胞膜并作为荧光素积蓄在活细胞内。 生理意义反映细胞膜完整性和细胞活力 9.PI（ 倍。 10.EB 11.DAPI 20 12.CalceinAM 原理Calcein-AM由于在Calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein(钙黄绿素)留在细胞内,发出强绿色 荧光，且细胞毒性很低，适合用于活细胞染色。 生理意义检测细胞膜完整性 激发波长494nm发射波长517nm（绿色） 备注跟FDA功能类似，细胞毒性很低，可以长时间标记细胞，但价格比较贵 13.BCECF-AM(pH荧光探针) 原理BCECF-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，BCECF-AM没有荧光，进入细胞后被细胞内的酯酶水解成BCECF，从而被滞留在细胞内。BCECF在适当的pH值情况下可以被激发 形成绿色荧光。 生理意义检测细胞内pH
SNP检测方法汇总
现在SNP的常用检测方法主要有：Taqman法、质谱法、芯片法、测序法。Taqman法：准确性高，适合于大样本、少位点，价格比较贵；质谱法：准确性高，适合于大样本、多位点（能检测25个位点）；芯片法：准确性较低，适合于超多位点分析；测序法：非常准确，但是价格也非常的高，但是对于少样本、超多位点还是非常好的选择。 SNP检测方法汇总 分析SNP的方法有许多种，本文收集目前还在用的方法，按通量从高到低排列： 全基因组测序 这是最贵的方法，但也是看SNP最全的方法 大概一个人样本，花2万元 外显子组测序 外显子组测序，也可以得到较全面的SNP信息 大概一个人样本，花1.5万元 随着人全基因组测序的价格降到2万元左右，外显子组测序会很快退出市场 全基因组SNP芯片 原理，核酸杂交，荧光扫描
Illumina和Affymetrix都有很著名的全基因组SNP芯片，例如： Affymetrix: CytoScan，SNP 6.0， Illumina: 660，中华，450K等 SNP芯片，在2000~5000元每样本，还是比全基因组测序的2万元一个样本的价格要低质谱法 原理，精确测量PCR产物的分子量，就可以知道SNP位点上是A/C/G/T中的哪一个Sequenome MassArray法测中等通量的SNP位点是十分准确的 单个位点、单个样本的费用约2元人民币 无需预制芯片、预订荧光探针,只要合成常规的PCR引物就可以做实验了 如果测几十个点，到上百个点，是很方便的方法 SNPseq法 此方法为天昊公司所创，一次测几百个位点 原理： 用Goldgate法做出针对某些位点的多重PCR片段
荧光探针研究新进展
《生物工程进展》2000,Vol.20,No.2 荧光探针研究新进展 章晓波 徐 洵 (国家海洋局第三海洋研究所,厦门 361005) 摘要 自从Southern(1975)首次进行DNA探针杂交后,至今核酸分子杂交已成为分子生物学的最基本方法。Matthews和Kricka[1]总结了各种杂交方法,将其归为两大类:一是异相杂交(hetero2 geneous assay)即固相杂交,目的核酸结合于不溶性支持物上;二是同相杂交(homogeneous assay)即液相杂交,一般同时使用两个探针。为了检测杂交,寡核苷酸探针需要标记,探针的标记物有放射性同位素和非放射性标记物。固相杂交常使用放射性同位素,荧光素是一种非放射性标记物,它能检测到的DNA浓度比吸收减色测定方法所需DNA浓度低100-1000倍[2],在同相杂交中广泛用于探针的标记。最近,荧光探针研究获得了新的进展,Tyagi和Krammer(1996)建立了一种新的荧光探针-分子信标探针,并得到许多应用,我们实验室也开展了这方面的研究。本文拟对荧光探针的研究进展作一综述。 关键词 荧光探针 分子信标探针 荧光PCR 1 常规荧光探针 固相杂交中,探针非特异结合于支持物表面,降低了灵敏度。Heller等(1982)以及Heller和Morri2 son(1985)[3]最早进行了同相杂交试验,同相杂交不需支持物,减少了固定目的DNA及除去未杂交探针等操作。他们的试验中使用了两个探针,这两个探针分别与目标DNA的两个相邻区域互补,第1探针在3′末端标记,第2探针在5′末端标记,根据标记物的光谱特性,使第1标记物为第2标记物的能量供体。当探针与目标DNA杂交时,二探针彼此靠近,光吸收或化学反应激发供体标记物,通过能量转移引起受体标记物的激发,这样,第1标记物发射光的减少以及(或)第2标记物发射光的增加标志着目标DNA的存在。 后来Morris on等[3]扩展了这一方法,他们使用的两个探针互补且相应于目标DNA上同一碱基序列,一个探针在5′末端标记荧光素,另一互补探针在3′末端标记荧光素发射的淬灭剂芘丁酸(pyrenebutyrate)或磺基若丹明101(sulforhodamine101)。无目标DNA 时,两探针结合,荧光素的能量转移至淬灭剂,不产生荧光。存在目标DNA时,探针与目标DNA之间竞争杂交,由于探针与目标DNA的结合,在494-496nm 光照下,产生荧光,目标DNA浓度越高,荧光信号越强,最低可检测到4pM的目标DNA,此方法得到一些应用[2,4,5]。Cardullo等[4]在应用Morris on方法的同时,提出在两个互补探针的5′末端分别标记荧光素和四甲若丹明(T etramethylrhodamine),因为荧光共振能量转移(fluorescence res onance energy trans ferr FRET)的效率随供体和受体之间距离的-6次方而减少,当两者相距20个核苷酸(70!)即产生不明显的能量转移,因此此方法中所使用的探针长度较短,特异性降低。 2 分子信标探针 同相杂交一般同时采用两个标记探针,Tyagi 和Kramer(1996)[6]首次建立了分子信标探针(molecular beacon probe),在同一寡核苷酸探针的5′末端标记荧光素、3′末端标记淬灭剂(DABCY L)。分子信标探针能形成发夹结构,探针的噜扑环与目的DNA碱基互补,噜扑环两侧为与目的DNA无关的碱基互补的臂。无目的DNA时,探针形成发夹结构,荧光素靠近淬灭剂,荧光素接受的能量通过共振能量转移至淬灭剂,DABCY L吸收能量后以热量形式消失,结果不产生荧光。当探针遇到目的DNA 分子时,形成一个比两臂杂交更长也更稳定的杂交,探针自发进行构型变化,便两臂分开,荧光素和淬灭剂随之分开,此时在紫外照射下,荧光素产生荧光。 影响分子信标探针构型变化的参数主要有[6]:臂长、臂序列GC含量、噜扑环长度和溶液盐浓度,尤其是二价阳离子如Mg2+对两臂形成的杂交茎有较强的稳定作用,在Mg2+存在条件下,4～12个核 41
荧光定量pcr法原理汇总
我们前面比较详细地介绍了荧光染料法做定量PCR的有关技术和产品，显然，作为定量PCR的初期阶段的荧光染料法还是有局限性的，比如，由于染料不能区分特异性PCR产物和引物二聚体等非特异产物，也不能区分不同探针，所以检测的特异性始终不如后来出现的探针法；需要在PCR后进行熔链曲线分析；也不能做多重PCR检测（Multiplex）。 上个世纪90年代原美国Perkin Elmer( PE)公司开发出了Taqman荧光探针定量技术，将定量PCR带入了更广阔的应用空间。Taqman探针法的出现是定量PCR技术的重要里程碑，之后在此基础上发展出了杂交探针法，以及荧光引物法，是对探针法的不断改进和简化。如果希望全面掌握定量PCR技术的研究人员就不能错过这些定量检测技术。 要提到荧光探针或者荧光引物，有一个基础概念需要首先明确，那就是荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)：一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体 (donor) 和能量受体 (acceptor) 对, 其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，当它们在空间上相互接近到一定距离(1—10 nm)时，激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。能量传递的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等有关。定量PCR所涉及的荧光探针和荧光引物的检测都这个FRET原理相关。 实时荧光PCR中另一个很重要的概念，即Ct值.C代表循环(Cycle)，T代表阈值(Threshold).Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数.。一般取PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线.因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 一：水解探针法 TaqMan技术
分子荧光的机理和荧光探针原理
1.3荧光分子探针识别机理 1.3.1光诱导电子转移[4,12](Photoinduced Electron Transfer,PET) 典型的PET体系是由包含电子给体的识别基团部分R(reseptor)，通过一间隔基S(space)和荧光团F(fluorophore)相连而构建。其中荧光团部分是光能吸收和荧光发射的场所，识别基团部分则用于结合客体，这两部分被间隔基隔开，又靠间隔基相连而成一个分子，构成了一个在选择性识别客体的同时又给出光信号变化的超分子体系。PET荧光探针中，荧光团与识别基团之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强的淬灭作用，因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧光很弱，一旦识别基团与客体相结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射出强烈荧光（图1-1）。PET荧光探针作用机制可由前线轨道理论来说明（图1-2）。由于与客体结合前后，荧光强度差别非常大，呈明显的“关”、“开”状态，因此这类探针又被称做荧光分子开关。 图1-1 PET荧光探针的一般原理图LUMO 图1-2 PET荧光探针的前线轨道原理图 已报道的PET荧光分子探针中，多数都是以脂肪氨基或氮杂冠醚作为识别基团。de Silva 研究小组利用多种荧光团设计了大量该类PET探针用于氢质子、碱金属阳离子识别。化合物1是一个简单的PET荧光分子探针，在甲醇中和K+络合后，荧光量子产率从0.003增加至0.14。钱旭红等设计的PET荧光探针（化合物2），对氢质子有很好的识别作用，已被Molecular Probe公司推广为细胞内酸性内酯质探针。de Silva研究小组利用类似于EDTA
基于罗丹明B的阳离子荧光探针的研究
基于罗丹明B的阳离子荧光探针的研究 .1分子荧光产生的原理 当用紫外或可见光照射某些物质时，这些物质吸收某种波长的光后会发射出波长和 强度各不相同的光线，当停止照射后，这种红光也随之消失，这种光被称为荧光汇1.2〕。对 荧光产生原理和条件直到十世纪中期才弄清楚。GorgeGStokes在1852年详细考察了奎 宁和叶绿素的荧光后，首先确定和报告了他们的荧光波长总比激发波长要长。他还研究 了荧光强度和荧光物质浓度的关系，发现在高浓度时荧光会淬灭，他也发现荧光可以被 外部物质淬灭，从而建议利用荧光达到检测的目的。由AlexanderJabfonski在1935年提 出的荧光产生的过程图，常被称为Jabfonski图131(见图 1.1)。通常情况下，荧光试剂 分子处于基态，吸收光后，试剂分子的电子被激发而处于激发态，基态和激发态都有单 重态和三重态两种类型。S为电子自旋量子数的代数和，其数值为O或1。S为O时， Fig.1.1JalllonskidiagramforaPhotolu刀。刃。eseentsystem 分子内轨道中的所有电子自旋配对，自旋方向相反，此时分子处于单线态，大多数有机 物分子的基态是处于单线态。分子吸收光能后，电子越迁到高能级，电子自旋方向不变， 此时分子处于激发单重态。S。，51，52，.…，表示分子的基态和第一，第二，…，激发 单重态，能量由低到高。如果处于基态单重态的有机物分子的电子在跃迁过程中伴随有
电子自旋方向的变化，在激发态分子轨道中就有两个自旋不配对的电子，此时S=l，表 明分子处于激发态的三重态，用T表示，Tl，T:分别表示三重态的第一第二激发态，分 子中的电子从基态S0跃迁到激发态51，52，比较容易发生，进行很快(10飞)，而从基 态单重态到激发三重态不易发生。高能量的单重态激发态分子(如S:)可以与其它同类分子或溶剂分子碰撞通过内转换回到激发态的最低能级51，这一过程为10一，25，处于激发态最低能级的分子寿命一般为10礴一10一ss，它们会放出光子返回基态，这时产生的光就是 荧光。从51到Tl能量转化是系间跨越。从Tl到S。有两种过程:一个事物能量释放; 另一个是放出光子，即磷光，在104一105间完成。 1.2荧光分子探针的定义 荧光探针定义为能和个别组织特异结合而又不干扰其他组织成分自身荧光的那些 荧光化合物，为了和细胞中的自发荧光物质相区别，人们也曾称荧光染料为次级荧光体， 相应地把这种染色过程称为次级染色，把像叶琳这样的自然荧光物质称为初级荧光体。 而现在把所有的荧光探针，不管其染色性能和对天然荧光的影响如何，都统称为荧光探 针〔‘〕。 荧光探针大多是含有共扼双键体系的有机化合物，共辆双键使其容易吸收激发光， 其激发波长多处于近紫外区或可见光区，发射波长多处于可见光区。 作为荧光探针应该具有以下特点〔4]:第一，荧光探针的荧光必须与生物样品的背景 荧光易于区别;第二，荧光探针必须不干扰研究的主体;第三，荧光探针主要用于
有机荧光探针最新研究进展
有机荧光探针最新研究进展 徐绍彬 （化学化工学院，1081109001） 摘要荧光探针是是一种极好的生物分子传感器,具备灵敏度高反应时间迅速等特点。近年来,随着生命科学的不断发展,荧光探针已经在蛋白质、核酸、细胞检测及免疫分析等方面发挥了重要作用。随着荧光探针的合成及应用技术的不断改进,人们对有机荧光化合物的认识和研究也不断深入,有机荧光探针的发展前景将越来越广阔。本文对最近几年国内外有机荧光探针的研究情况做一综述。 关键词BODIPY 荧光探针染料 探针是一种能和某特异靶分子相互作用,实现对靶分子进行检测的分子,并要求相互作用后对被探测对象不产生或仅产生可忽略的干扰。荧光探针就是以荧光物质作为指示剂,并在一定波长光的激发下使指示剂产生荧光,通过检测所产生的荧光实现对被检测物质的定性或者定量分析。荧光分析方法灵敏度高,选择性好,试样量小,在分析化学,特别是在分子生物学、生物化学、医学等领域中有较广泛的应用。由于大多数生物分子本身无荧光或荧光较弱,检测灵敏度较差,人们用强荧光的标记试剂或荧光生成试剂对待测物进行标记或衍生,生成具有高荧光强度的共价或非共价结合的物质,使检出限大大降低,这就是荧光探针技术。 荧光探针可有多种分类方法:按荧光波长可分为发射在紫外可见区的荧光探针和近红外区的荧光探针。按荧光探针用途不同可分为荧光标记试剂(fluorescent) 和荧光生成试剂(nuorlgenic)。按荧光探针物质本身的性质又可分为有机(包括稀土金属有机配合物) 荧光探针、量子点荧光探针、高分子荧光探针等。近年来随着生命科学的日益发展，大量的各式各样荧光探针被合成出来，人们对荧光探针技术的认识和研究也不断的深入。目前常用于合成荧光探针的染料有BODIPY、菁染料、噻嗪与噁嗪类染料、呫吨类染料等。本文将讨论最近三、四年的有机荧光探针的发展情况，并重点对基于BODIPY的有机荧光探针的合成及应用进行概述。 1 BODIPY类 二氟化硼－2－二吡咯甲烷(BODIPY) 是一类重要的有机荧光染料，由于其分子结构易于改性，近十年来研究人员合成了一系列的BODIPY衍生物，并在荧光探针技术上得到应用。这类荧光染料具有荧光量子产率高、摩尔吸光系数大、稳定性好、对pH、溶液极性不敏感等优点，因而在金属离子检测、PH值测定、DNA的标记及测序等方面得到重要应用。 1.1基于BODIPY的金属离子荧光分子探针研究进展 设计一种检测生理过程重要金属离子的荧光探针是非常活跃的领域，对金属离子探针的研究早在20世纪七八十年代就已开始，己经报道的探针分子成百上千。BODIPY类金属离子荧光探针的研究也陆续见诸报道，不少研究人员利用BODIPY荧光染料合成形形色色的金属离子荧光分子探针，使它代替了许多早期的荧光染料而应用在生物和化学分析方面。 2008年，Serdar Atilgan 等人通过逐步法合成了一种高灵敏的锌离子荧光探针。这种新颖的双苯乙烯基取代的BODIPY衍生物结合锌离子以后，发射峰从730nm蓝移至680nm，因而可做为发射峰在近红外区域的水溶性荧光探针。
荧光探针在蛋白质研究中的应用
第13卷 第3期1998年6月荧光探针在蛋白质研究中的应用 Ξ王守业 余华明 张祖德 刘清亮 (中国科技大学化学系 合肥230026) 大学化学 摘要 荧光探针技术是研究蛋白质在水溶液中构象的一种有效方法。利用它可以测定蛋白 质分子的疏水微区内两基团的距离以及酶与底物结合过程中蛋白质构象的变化等。本文综述了荧光探针技术在蛋白质研究中的一些进展。 一、 引言 荧光探针技术是利用物质的光物理和光化学特性,在分子量级上研究在溶液中蛋白质构象的一种方法。该方法的最大特点是具有高度的灵敏性和极宽的动态响应范围。荧光探针物质之所以可被用来研究蛋白质的构象,主要是因为其具有特殊的光物理性质,如在不同极性介质中有着不同的光谱特性(即不同的峰值波长),不同的荧光量子产率和荧光寿命等。因此,测定荧光探针物质和蛋白质分子结合后荧光峰波长、位移及量子产率的变化,就可探知其所处微环境的极性及其他有关性质。利用荧光探针技术研究蛋白质在溶液中的构象有两种方法:一种是测定蛋白质分子的自身荧光,即“内源荧光”,另一种是利用荧光探测剂,即“外源荧光”。若引人的荧光探测剂为有机分子,则该分子叫做有机荧光探针;若引入的荧光探测剂为稀土离 子(如铽(Ⅲ)、铕(Ⅲ )等),则该离子叫做稀土离子荧光探针。 二、 荧光探针的某些光物理和光化学特征 1. 有机荧光探针的某些特征 最常用的有机荧光探针物质有12苯胺基萘282磺酸(ANS ),22对甲胺萘262磺酸(2062TNS )和12N 0N 2二甲胺基萘252磺酸(1052DNS )(dansyl acid ),其结构如图1:θθSO -3 N θH θθSO -3N H θ H 3C θθS O O Cl N H 3C CH 3 1,82ANS 2,62TNS 1,52DNS 2Cl 图1 1082ANS,2062TNS 和1052DNS 2Cl 的结构 这些化合物在水溶液中基本不发荧光,量子产率低(低于0.1),但在非极性溶剂中,其量子产率大增,荧光峰蓝移,且能和许多蛋白质结合。这种探针分子溶液的荧光光谱因溶剂极 Ξ本文为国家自然科学基金资助项目。
三代基因组测序技术简介及其原理整理.
三代基因组测序技术简介及其原理整理 第一代测序技术 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法以及1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）。 1977年，桑格测定了第一个基因组序列——噬菌体X174，全长5375个碱基。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。 Sanger法原理： 1）在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP（N=A/G/T/ C）加到引物的3’- OH末端，合成出新的互补链。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP，在互补链在DNA聚合酶作用下延伸时，一旦连接上ddNTP，由于双脱氧核糖的2’和3’都不含羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键而终止反应，随即形成一系列不同长度的、以同样引物为起始、以同一碱基终止的短片段混合物。 2）双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。 化学裂解法原理： 与Sanger法类似，将DNA模板分成4个反应。在每个反应中，先在模板5’端进行放射性标记，再加入能特异性在其中一种碱基处切开DNA的化学试剂。反应进行时，平均一个DNA分子只在随机位点产生一次裂解。接着，通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。 第二代测序技术 第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。经过不
基因组学总结
Roche 454（GS FLX Titanium System）超高通量测序技术原理 2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序的先河。2007年又推出了性能更优的第二代基因组测序系统——Genome Sequencer FLX System。2008年10月，454推出了全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件，让GS FLX的通量一下子提高了5倍，准确性和读长也进一步提升。 GS FLX 测序原理：GS FLX系统的测序原理和GS 20一样，也是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术；在DNA 聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来(图1)。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。 Roche GS FLX System是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量基因组测序系统。在测序时，使用了一种叫做“Pico TiterPlate”（PTP）的平板，它含有160多万个由光纤组成的孔，孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。 测序实验流程： 1、文库制备：根据样品的种类和实验目的，将基因组DNA/cDNA片段化处理至400-800bp间，经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA（sstDNA）； 2、Emulsion PCR：特定比例的单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上，使大部分磁珠磁珠携带了一个独特的单链DNA片断。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增，而不受其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增后仍结合在磁珠上的片段既可被回收纯化用于后续的测序实验； 3、测序反应：携带DNA的珠子与其他反应物混合物，随后放入PTP板中进行后继的测序。PTP孔的直径（29um）只能容纳一个珠子（20um）。然后将PTP板放置在GS FLX中，测序开始。每一个与模板链互补的核苷酸的添加都会产生化学发光的信号，并被CCD照相机所捕获； 4、数据分析：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息，通过GS FLX系统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析。 技术特点：? 速度快，一个测序反应耗时10个小时，获得4-6亿个碱基对。比传统的Sanger测序的方法快100倍；? 读长长，单个序列的读长更长，平均可达到450个碱基左右；? 通量高，每个反应可以得到超过100万个序列读长，成本大大降低；? 准确度高，读长超过400bp时，单一读长的准确性可以超过99%；? 一致性好，测序结果一致性超过99.99%；? 可以进行Pair－End测序研究；? 简便高效，不需要进行建库、克隆挑取、质粒提取等工作，一个人可以在一天内完成一个微生物物种的测序工作。 GS FLX系统的应用：自从2005年底GS 超高通量基因组测序系统问世以来，已经相继在世界上各大测序实验室成功落户。这项技术的第一个“试验品”就是来自有“DNA之父”之称的James D Waston，他向454公司提供了自己的血液样本。目前GS系统的用户在Nature，Science，PNAS等世界顶级的期刊杂志上已经发表了五十多篇的学术论文。（详细列表请查询https://https://www.360docs.net/doc/fe11875062.html,/sis/sequencing/genome/index.jsp）。与GS 20系统相比较，硬件配置和软件系统方面的革新改进，使得GS FLX系统具有了广泛的应用：全基因组测序；多达120 Mb的未知基因组的测序；－生成基因组结构概图；－研究DNA序列的组织，分布和信息；－基因筛查：寻找新基因，定位和功能；－和其他基因组进行比较研究；全基因组进行从头鸟枪法测序，例如微生物基因，BAC和YAC克隆测序。比较基因组研究；－识别单碱基突变；－识别突变热点和保守区域；－识别插入或者缺失的基因；－断定基因型和表型之间的相关关系（比如，研究药物抗性的遗传基础）；－基于基因测序变化进行毒性预测；－进行流行病学分析；－了解工业生产菌株和它们的亲代菌株序列上的差异作为进行工业生产菌株开发的遗传基础；－进行宏基因组（metagenomics）研究；－古代化石DNA 测序研究；利用配对末端方法（Pair-End Tag）将Contigs拼接成Scaffolds。转录组和基因调节研究；基于短Tags，ESTs, ChIP，或者GIS-PET序