代谢工程试题答案

1.微生物代谢工程定义、研究内容和研究手段。

（1）定义：

代谢工程是利用重组DNA技术或其他技术,有目的地改变生物中已有的代谢网络和表达调控网络,以更好地理解细胞的代谢途径,并用于化学转化、能量转移及大分子装配过程。

（2）研究内容：

生物合成相关代谢调控和代谢网络理论；代谢流的定量分析；代谢网络的重新设计；中心代谢作用机理及相关代谢分析；

（3）研究手段:

代谢工程综合了基因工程、微生物学、生化工程等领域的最新成果。

①基因操作技术：在代谢工程中，代谢网络的操作实质上可以归结为基因水平上的操作：

涉及几乎所有的分子生物学和分子遗传学实验技术，如基因和基因簇的克隆、表达、调控，DNA 的杂交检测与序列分析，外源DNA的转化，基因的体内同源重组与敲

除，整合型重组DNA 在细胞内的稳定维持等。

②分析手段：组学技术(X-omics)：工业微生物基因组测序与功能基因组分析；基于基

因芯片的转录组学分析；蛋白质组学技术；基于同位素技术的代谢通量组学。

③检测技术：常规的化学和生物化学检测手段都可用于代谢工程的研究，如物料平衡、

同位素标记示踪法、酶促反应动力学分析法、光谱学法、生物传感器技术。

2.代谢改造思路和代谢设计原理。

（1）代谢改造思路：

代谢工程研究的重点在于改造代谢网络，以便生产特定目的代谢产物或具有过量生产能力的工程菌应用于工业生产。根据微生物的不同代谢特性，常采用改变代谢流、扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种方法。

a改变代谢途径的方法：加速限速反应，增加限速酶的表达量，来提高产物产率。改变分支代谢途径流向，提高代谢分支点某一分支代谢途径酶活力，使其在与其它的分支代谢途径的竞争中占据优势，从而提高目的代谢产物的产量。

b扩展代谢途径的方法：在宿主菌中克隆和表达特定外源基因，从而延伸代谢途径，以生产新的代谢产物和提高产率。扩展代谢途径还可使宿主菌能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗的底物。

c转移或构建新的代谢途径：通过转移代谢途径、构建新的代谢途径等方法来实现。

(2)代谢设计原理

a.现存代谢途径中改变增加目的产物代谢流

增加限速酶编码基因的拷贝数；强化以启动子为主的关键基因的表达系统可以提高产物的转化率；提高目标途径激活因子的合成速率；灭活目标途径抑制因子的编码基因；(5)阻断与目标途径相竟争的代谢途径；改变分支代谢途径流向；构建代谢旁路；改变能量代谢途径。

b.在现存途径中改变物流的性质：

利用酶对前体库分子结构的宽容性；通过修饰酶分子以拓展底物识别范围

c.在现存途径基础了扩展代谢途径：

在宿主菌中克隆、表达特定外源基因可以延伸代谢途径，从而生产新的代谢产物、提高产率。

3.微生物的基因操作技术有哪些？（举两例说明）

PCR技术，核酸的凝胶电泳，核酸的分子杂交技术，细菌的转化，DNA序列分析，基因的定点诱变，蛋白质及RNA相互作用技术，酶切及基因敲除技术等。大引物诱变法（1）基因的定点诱变：目前，主要采用两种PCR方法，即重叠延伸技术与大引物诱变法

在基因序列中进行定点突变。

（2）核酸的分子杂交技术：具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）。Southern 杂交，Northern 杂交，原位杂交（ISH），荧光原位杂交（FISH）。

（3）基因敲除：同源重组，cre/lox,FLP/FRT

4.什么是酶的反馈抑制，以缬氨酸代谢途径来举例说明。（见第7题, 1-（2））

酶的反馈抑制是指最终产物抑制作用，即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该途径的酶的活性调节，所引起的抑制作用，包括顺序反馈抑制、同工酶的反馈抑制、协同反馈抑制、累积反馈抑制、增效反馈抑制。

以缬氨酸为例：缬氨酸由丙酮酸合成，涉及四个反应，分别由四个酶催化，依次为乙酰羟酸合酶(AHAS)、乙酰羟酸同分异构酶(AHAIR)、二羟酸脱水酶(DHAD)和支链氨基酸转氨酶(TA)。首先，由AHAS将两分子丙酮酸缩合成2-乙酰乳酸；其次，AHAIR将2-乙酰乳酸转化为双羟基异戊酸；再次，由DHAD将双羟基异戊酸脱水形成2-酮异戊酸；最后，TA将2-酮异

戊酸转化为L-缬氨酸。L-缬氨酸和L-异亮氨酸的合成共享AHAS 、AHAIR、DHAD和TA等4种酶。如AHAS以丙酮酸为底物则合成L-缬氨酸，而用丙酮酸和2-酮丁酸为底物则合成L-异亮氨酸。

缬氨酸合成反馈抑制的主要对象是其合成途径上的第一个关键酶乙酰羟酸合酶（AHAS），同时缬氨酸和异亮氨酸的合成酶系受三个末端产物缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的多价阻遏。因此，如果解除AHAS的反馈抑制和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物酶系的阻遏，必将大大提高缬氨酸的积累。为此可选育缬氨酸结构类似物抗性突变株来解除缬氨酸的反馈调节。如抗缬氨酸突变株的获得，或者利用分子手段对关键酶基因进行定点突变。

5.微生物酶的自动调节方式（举两例说明）。

微生物并不是在所有空间、时间内合成它所能合成的全部酶，在一定生理条件下，微生物只合成它当时所需要的酶；存在于细胞内的酶活力是受到控制的，酶的催化过程必须

与细胞对能量和细胞组分的需求相协调。微生物酶的自动调节主要分为以下几个不同水平的调节

（1）转录水平上的调节

①酶的诱导的机制

酶的诱导对于微生物是十分有意义的。从营养的角度看，微生物可以根据环境所提供的生长底物，诱导合成相应的酶(蛋白质)，以分解生长底物，吸收营养，进行代谢活动，从而加强微生物对环境的适应能力。

②营养阻遏的机制

在用混合碳源培养大肠杆菌的研究中发现，细胞只生成能降解培养基中能最迅速被同化的碳源的酶系，而用来降解其他碳源的酶系的合成在该碳源用完前一直受到阻遏。

③终端产物对其自身合成途径的酶的合成的反馈阻遏和弱化的机制

许多氨基酸生物合成途径不但受该氨基酸本身的调节而且受其对应的氨基酰tRNA的调节，前者指的是反馈阻遏，后者指的是叫做弱化的另一种类型的控制，阻遏控制转录的开始，弱化控制转录的终止。

(2)翻译水平上的调节

包括两层意思，其一是对翻译速度的调节；其二是对已译成的、会成为细胞的包袱的蛋白质分子的破坏性降解。

(3) 蛋白质水平上的调节

①变构蛋白和变构酶的调节；

②共价调节酶的调节：可由共价修饰引起酶活性或（和）调节特性改变的酶叫共价调

节酶。共价调节酶可以在另外一个酶（修饰酶）的催化下被共价地修饰，即在它分子上共价地结合上或者释放一个低分子量基团，从而使酶的活性发生变化。

举例：

(1)酶的诱导调节机制：乳糖操纵子包括调节基因、启动子、操纵基因和结构基因。在

含葡萄糖的培养基中大肠杆菌不能利用乳糖，只有改用乳糖时才能利用乳糖。操纵子的调控机理是：当在培养基中只有乳糖时由于乳糖是lac操纵子的诱导物，它可以结合在阻遏蛋白的变构位点上，使构象发生改变，破坏了阻遏蛋白与操纵基因的亲和力，不能与操纵基因结合，于是RNA聚合酶结合于启动子，并顺利地通过操纵基因，进行结构基因的转录，产生大量分解乳糖的酶。

（2）酶的阻遏调节机制：色氨酸操纵子的调节：当培养基中色氨酸含量较高时，色氨酸与游离的辅阻遏蛋白相结合，并使其与操纵区DNA紧密结合；当培养基中色氨酸供应不足时，辅阻遏物失去色氨酸并从操纵区上解离，trp操纵子失去阻遏。

6.微生物基因水平的调控策略，请举例说明

（1） 操纵子

正调控：阻遏蛋白从操纵基因上脱离后，激活蛋白与启动子结合以及和RNA聚合酶的相互作用，帮助结构基因的转录起始，促进相应蛋白的合成。乳糖操纵子

负调控：阻遏蛋白与操纵基因的结合，阻止了RNA聚合酶对操纵子结构基因的转录。色氨酸操纵子。

（2）转录终止调控：衰减作用：原核生物中通过翻译前导肽而实现控制DNA的转录的调控方式。前导序列(leader sequence)：位于翻译起始密码子AUG之前的一段不参与翻译的mRNA5’端的核苷酸片段Trp操纵子衰减作用，发卡结构

7.如何采用代谢工程进行缬氨酸育种？

1 谷氨酸棒状杆菌生物合成L-缬氨酸的途径和调控机制

L-缬氨酸在谷氨酸棒状杆菌中的生物合成途径。葡萄糖经过糖酵途径生成L-缬氨酸合成的重要前体丙酮酸(pyruvate)，再通过 4 步反应合成L-缬氨酸：首先ilvBN 基因编码的乙酰羟酸合成酶(acetohydroxyacid synthase, AHAS)将两分子的丙酮酸缩合成2-乙酰乳酸(2-acetolatate)，然后在ilvC 基因编码的乙酰羟酸还原异构酶(acetohydroxyacid isomeroreductase, AHAIR)催化下转化为双羟基异戊酸(2,3-dihydroxyisovalerate)，再由ilvD 基因编码的二羟酸脱水酶(dihydroxyacid dehydratase, DHAD)将双羟基异戊酸脱水形成2-酮异戊酸(2-ketoisovalerate)，最后ilvE 基因编码的转氨酶B(transaminase B, TA)将2-酮异戊酸转化成L-缬氨酸。胞内积累的L-缬氨酸由brnFE 编码的转运蛋白复合体BrnFE 转运至胞外。

在 C. glutamicum 中，一些其它代谢产物的合成途径与L-缬氨酸的合成途径相互交错。L-缬氨酸合成途径的4 个关键酶也用于L-异亮氨酸(L-isoleucine)合成：先由丙酮酸和苏氨酸(threonine)经ilvA 基因编码的苏氨酸脱水酶(threomine dehydratase, TD)催化反应生成2-酮丁酸(2-ketobutyrate)，再共用这 4 种酶催化 4 步反应生成L-异亮氨酸。丙酮酸还是多种反应的前体，包括由丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvate dehydrogenase complex, PDHC,其中关键酶Elp 由aceE 基因编码)催化反应生成乙酰辅酶A(acetyl-CoA)；由pqo 基因编码的丙酮酸：醌氧化还原酶(pyruvate quinine oxidoreductase, PQO) 催化反应生成乙酸(acetate) ；由pyc 基因编码的丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase, PC)催化反应生成草酰乙酸(Oxaloacetate)；由ldh基因编码的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)催化反应生成乳酸(lactate)，以及由alaT 和avtA 基因编码的丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase, AA)催化反应生成L-丙氨酸(L-alanine)等。L-缬氨酸合成途径的中间产物2-酮异戊酸可以由panB 基因编码的羟甲基转移酶(hydroxymethyltransferase, HT)催化起始，经3 步反应生成D-泛酸(D-pantothenate)；还可以由leuA 基因编码的异丙基苹果酸合酶(isopropylmalate synthase, IS)催化起始，经4 步反应生成L-亮氨酸(L-leucine)。

对谷氨酸棒状杆菌生物合成L-缬氨酸进行代谢改造，还需要明确其代谢途径的调控机制。目前已知的调控主要有：AHAS 对底物的亲和性，产物对AHAS 的反馈抑制，ilvBNC 的转录弱化，PdxR和AvtA 对TA的调控，以及全局调控因子Lrp对BrnFE 的调控(图1-1)。

(1) AHAS 对底物的亲和性

谷氨酸棒状杆菌AHAS催化反应底物包括对2-酮丁酸和丙酮酸，但对前者的亲和性较高，会优先合成L-异亮氨酸，不利于L-缬氨酸的积累。因此要考虑减弱其他相关代谢产物的合成，将代谢碳流导向L-缬氨酸的合成。

(2)产物对AHAS的反馈抑制

谷氨酸棒状杆菌AHAS是一个四聚体，包括ilvB基因编码的两个大亚基(催化亚基)和ilvN基因编码的2个小亚基(调节亚基)，ilvBN与ilvC基因一起，构成一个操纵元ilvBNC。AHAS的调节亚基可以受3种支链氨基酸(缬氨酸?亮氨酸?异亮氨酸)中任何一种的反馈抑制，其中缬氨酸的抑制能力最强；在单一支链氨基酸或者多种协同作用下，被抑制程度不超过57%。这表明3种BCAAs与C.glutamicum的AHAS调节亚基结合位点可能相同，只是亲和性有差异。L-缬氨酸的积累需要减弱或者消除这种反馈抑制。

(3)ilvBNC的转录弱化

谷氨酸棒状杆菌ilvBNC操纵元有典型的转录弱化特征：ilvB基因上游292bp处的一段DNA能表达一个前导肽，且该序列后面存在能形成RNA茎环形结构和转录终止子的序列，对ilvBNC操纵元有转录弱化调节作用。胞内3种支链氨基酸的存在都能引起ilvBNC 的转录弱化作用，因此L-缬氨酸的积累也需要对其减弱或者消除。

(4)PdxR和AvtA对TA的调控

谷氨酸棒状杆菌中支链氨基酸合成途径的最后一步主要由ilvE基因编码的TA催化，且pdxR基因编码的PdxR蛋白在L-缬氨酸的合成中具有催化活性BCAAs的合成都需要ilvE基因的参与，但其作用机制尚不清楚。

还有研究发现avtA基因编码的转氨酶AvtA在有L-丙氨酸(L-alanine)存在时，催化L-丙氨酸合成L-缬氨酸的活性高于合成L-异亮氨酸；此外，菌体生长所需的三种BCAAs的合成都需要ilvE基因的参与，但其中L-缬氨酸的合成还需要由avtA基因协同参与。

(5) Lrp对转运蛋白BrnFE的调控

谷氨酸棒状杆菌中3种支链氨基酸都能通过brnQ基因编码的转运蛋白BrnQ输送到胞内，通过转运蛋白复合体BrnFE分泌到胞外。研究发现全局调控因子Lrp可以结合在lrp和brnF之间的DNA上，促进BrnFE的表达。

2 谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-缬氨酸的代谢改造策略

谷氨酸棒状杆菌用于工业发酵生产L-缬氨酸的菌株主要来自传统遗传育种，但传统育种手段已经难以满足日益增长的需求，因此需要运用代谢工程对谷氨酸棒状杆菌进行改造。主要代谢改造策略具体包括以下几方面：阻断代谢旁路和强化主要碳流，解除反馈抑制和转录弱化，积累关键前体丙酮酸，强化辅因子，以及其它改造策略。

(1)阻断代谢旁路和强化主要碳流

谷氨酸棒状杆菌中L-缬氨酸与L-异亮氨酸、L-亮氨酸和D-泛酸的合成途径相互交错，因此要提高其产量首先要阻断代谢旁路，减少副产物的合成。由图1-1可知，ilvA基因编码的TD 是合成L-异亮氨酸的关键酶，因此可以通过敲除ilvA基因阻断L-异亮氨酸的合成；leuA基因编码的IS是合成L-亮氨酸的关键酶，因此可以通过敲除leuA阻断L-亮氨酸的合成；D-泛酸的合成涉及两个在染色体上位置相邻的关键基因panB和panC，因此通过单独敲除敲除panB 或者共同敲除这两个基因可以阻止D-泛酸的合成。除了阻断代谢旁路，还需要通过高效表达L-缬氨酸合成途径相关基因以强化主要碳流。丙酮酸合成L-缬氨酸涉及5个基因ilvB、ilvN、ilvC、ilvD和ilvE。在C.glutamicum基因组中前3个基因是串联的，ilvD与它们位置也很接近，而ilvE相距较远。因此，操纵元ilvBNC、ilvBNCD可以通过质粒高效表达，也可以再串联ilvE基因强化碳流流向L-缬氨酸合成途径。

(2)解除反馈抑制和转录弱化

谷氨酸棒状杆菌胞内的L-缬氨酸积累过多会对其合成途径关键酶AHAS有反馈抑制，ilvBNC操纵元也存在转录弱化。要大量积累L-缬氨酸，必须解除这两种负面调控作用。对ilvN 基因编码的AHAS的小亚基进行定点突变，可以解除BCAAs的反馈抑制作用。切除ilvN编码的AHAS小亚基C端的53个氨基酸也可以抗L-缬氨酸的反馈抑制。通过启动子点突变或启动子替换，可以增强ilvBNC操纵元启动子活性以解除转录弱化。

(3)积累关键前体丙酮酸

丙酮酸不仅是L-缬氨酸合成的关键前体，同时也是胞内重要的代谢中间产物，减少其消耗以大量积累，也能够提高L-缬氨酸产量。谷氨酸棒状杆菌中丙酮酸主要通过糖酵解途径合成，其消耗的的方式主要有以下两方面：一方面合成各种氨基酸和有机酸，除了3种支链氨基酸之外，还可以通过alaT和avtA基因编码的AA生成L-丙氨酸，其中alaT占主导作用；或者通过ldh基因编码的LDH生成乳酸。另一方面合成TCA循环中间产物，如通过aceE等基因编码的PDHC合成乙酰辅酶A；或通过pqo基因编码的PQO先合成乙酸再合成乙酰辅酶A；或者通过pyc基因编码的PC合成草酰乙酸。对这些相关基因进行敲除或弱化，就可以通过积累丙酮酸而增加L-缬氨酸产量，并减少副产物合成。

(4)强化辅因子辅因子

在谷氨酸棒状杆菌生物合成L-缬氨酸过程中也有重要作用。如图1-1所示，每合成1分子L-缬氨酸需要消耗1分子葡萄糖，产生1分子NADH同时消耗2分子NADPH。其中NADH 的产生主要发生在糖酵解途径中，关键反应由pgi基因编码的磷酸葡萄糖异构酶(phosphor glucose isomerase,PGI)催化；而NADPH的消耗发生在AHAIR和TA催化的两步反应中。合成NADH却消耗NADPH必然存在不平衡和损耗，这必然对L-缬氨酸的过量积累有限制作用。为消除这种不利影响，可以通过敲除pgi基因使葡萄糖经磷酸戊糖途径(HMP)降解而产生NADPH[29]；也可以通过表达大肠杆菌来源的膜结合转氢酶(membrane-bound transhydrogenase,PntAB)促进NADH向NADPH转化；还可以通过修饰AHAIR和替换TA，使得对NADPH的需求转变为对NADH的需求。

(5)其它改造策略

其它改造策略包括对L-缬氨酸转运的调控、启动子活性的优化和基于整体代谢网络的全局调控策略等。

3谷氨酸棒状杆菌L-缬氨酸生产菌株的选育情况

最早的关于L-缬氨酸生产菌的报道始于1961 年，此后研究者在L-缬氨酸生产菌种的选育方面进行了大量研究。通过传统诱变育种和代谢工程改造方法，很多能发酵生产L-缬氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株被成功选育(表1-1)。

迄今为止，大多数用于工业生产的菌株都是通过传统的随机诱变选育得到。中国科学院微生物研究所氨基酸组对Corynebacterium pekineise AS1.299 采用硫酸二乙酯(DES)诱变处理获得突变株ASl.586，L-缬氨酸产量达26.8 g/L。江南大学的张伟国等以DES 和亚硝基胍(NTG)诱变黄色短杆菌V4-153 得到突变株ZQ-2，L-缬氨酸产量达40 g/L。

传统诱变育种工作量大，引起的遗传变异是随机分配的，可能对细胞生理产生不可预测的消极影响，且产量难以进一步提升。因此通过理性的代谢工程方法定向构建和改造L-缬氨酸生产菌株，正成为主要策略。较早期的工作大都基于摇瓶发酵水平进行机理上的研究。Radmacher 等敲除ilvA 和panBC 基因，并过表达ilvBNCD基因，最终摇瓶发酵L-缬氨酸产量达10.6g/L。Elisakova 等通过ilvN 基因点突变消除了L-缬氨酸对其编码的AHAS 小亚基的反馈抑制，并敲除ilvA 和panB 基因，过表达ilvBNC 基因，最终摇瓶发酵L-缬氨酸产量达15.2g/L。以此为基础，Holátko等通过定点突变上调ilvD和ilvE启动子活性，下调ilvE和leuA 基因的启动子活性，降低L-isoleucine和L-leucine的合成速率从而提高L-缬氨酸的产量。最终得到的工程菌株摇瓶发酵L-缬氨酸产量达11.6g/L。Wada等发现谷氨酸棒状杆菌atpG基因点突变造成的H+-ATPase缺陷有益于L-缬氨酸的合成，在其中过表达抗L-缬氨酸反馈抑制的ilvN53C基因和ilvC基因的菌株摇瓶发酵L-缬氨酸产量达8.2g/L。这些较早期的研究虽然L-缬氨酸的产量不高，但为进一步代谢工程改造提供了参考，具有重要的指导意义。

近年来随着代谢工程改造策略越来越完善，且引入分批补料发酵、高密度发酵和厌氧发酵罐发酵等先进发酵方法，L-缬氨酸产量的提升幅度越来越明显。Blombach 等发现通过敲除aceE 增加丙酮酸积累能有效提升L-缬氨酸产量，过表达ilvBNCE 的工程菌C. glutamicum (ΔaceE)通过分批补料发酵能产生24.6 g/L 的L-缬氨酸。以此为基础，pqo 基因和pgi 基因被敲除，分别进一步增加丙酮酸积累和促进NADPH 供应，最终的重组菌分批补料发酵L-缬氨酸产量可达48.0 g/L ，在同等发酵方法中处于世界领先水平。Hou 等通过弱启动子MPilvA 替换减少L-异亮氨酸积累，敲除基因avtA 减少L-丙氨酸积累，并过表达带有抗反馈抑制突变的基因ilvEBNrC，最终得到的菌株 C. glutamicum ATCC13032 MPilvAΔavtA pDXW-8-ilvEBNrC 罐上发酵L-缬氨酸产量达到31.2 g/L。Buchholz等通过弱化基因aceE 启动子积累丙酮酸并减少醋酸依赖，敲除基因pqo 和ppc (PEP carboxylase)进一步积累丙酮酸，最终得到的菌株 C. glutamicum ace A16 (pJC4ilvBNCE)罐上高密度发酵可以生产86.5 g/L 的L-缬氨酸。Hasegawa 等通过对AHAS 进行点突变以及用梭形杆菌(Lysinibacillus

sphaericus)来源的TA 替换谷氨酸棒状杆菌自身TA 的方法，使L-缬氨酸合成过程中需要的辅因子从NADPH 变为NADH。此外还敲除ldh 基因减少厌氧发酵条件下乳酸的积累，并过表达ilvBNCDE 基因,得到的菌株 C. glutamicum R BNGECTMDLD/ΔLDH 厌氧发酵下L-缬氨酸产量达到227 g/L。在此基础上，敲除基因ppc 和avtA 减少副产物苏氨酸和L-丙氨酸，同时敲除NADH 代谢相关的 3 个基因并过表达糖酵解相关的 5 个基因以强化辅因子，再在

染色体上嵌入抗反馈抑制突变AHAS 的编码基因和NAD-依赖AHAIR的编码基因，最终得到的重组菌株Val-9 (BNGECTMDLD/ΔLP_ΔAc+GP_ilvNGECT M_ΔAla 厌氧发酵L-缬氨酸产量达150 g/L 且副产物含量较低。以上结果说明通过系统代谢工程选育得到的产L-缬氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株在工业上也具备竞争力。

8.简述工业发酵的五字策略。（结合研究实例说明）

工业发酵的五字策略为“进、通、节、堵、出”，含义分别为：进，促进细胞对碳源等营养物质的吸收；通，使来自代谢流上游和各个“注入分支”的碳架物质能畅通地流向目的产物；节，阻塞与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物；堵，消除或削弱目的产物进一步代谢的途径；出，促进目的产物向胞外空间分泌。

通：通过超表达与缬氨酸合成直接相关的酶基因ilvBN,ilvC,ilvD,ilvE基因来使碳源物质丙酮酸更通畅的流向目的产物缬氨酸。

节：①缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸的生物合成途径中公用了三种酶，即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶和二羟基脱水酶。选育亮氨酸、异亮氨酸营养缺陷型突变株可以使用于合成三种氨基酸的公用酶系完全用于缬氨酸的生物合成，进而提高缬氨酸的产量。②通过筛选丙酮酸脱氢酶（PDHC）缺陷菌株来增加缬氨酸前提物质丙酮酸的积累。③通过敲除编码苏氨酸脱氢酶的ilvA基因，可以阻断亮氨酸和泛酸的合成，他们与缬氨酸竞争前体物质酮异戊酸。

④通过抑制醌氧化还原酶（PQO）和丙酮酸羧化酶（PCx）的活性来阻断与缬氨酸合成无关的碳硫分支对碳源的消耗。

堵：缬氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌的育种过程中，筛选终产物分解抑制菌株，达到提高产物的目的。

出：通过抑制livJ基因的表达，从而抑制缬氨酸向胞内运输载体蛋白的表达，促进目的产物向胞外空间分泌。这相当于五字策略中的出。

9.简述微生物基因克隆的方法与流程

1)目的基因的制备：基因文库；cDNA文库；已知基因PCR。

2)载体的选择和制备：基本要求：①复制单位;②.多克隆位点(多个单克隆位点);③.筛选标记;

④.分子量尽可能小; ④.外源DNA插入后不影响载体本身的复制能力。

3)载体与目的基因的连接---构建重组体：粘性末端连接法、去5’磷酸连接法、人工接头法、

同聚物接尾法

4)将重组DNA导入宿主细胞：

①转化：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程。化学转化，电转化等

5)目的基因的筛选和鉴定：①免疫学方法；②分子杂交（探针）；③原位杂交；④PCR；

⑤限制性酶切图谱；⑥遗传学方法:抗药性标志选择（蓝白斑筛选）。

10.工业生物技术中亟待解决的技术问题有哪些，请举例说明

(1)应用酶学和途径工程———酶的高通量筛选和分子改造、极端微生物筛选、极端条件和工业条件下酶学的构效关系、合成途径工程、合成生物学技术、生物催化工程等。

(2)生物合成网络和细胞工厂———充分理解生物质降解和生物基产品的合成过程, 建立生物质降解酶(系)和生物基产品合成途径关键酶(系)及调控元件的结构和功能模型、调节与代谢网络模型;理解网络重构和调控改造、跨膜物质运输强化的基本原理, 设计用于生物质降解和生物基产品合成的理想有机体, 或仿生纳米结构的理想酶催化剂;建立若干关键工业微生物的系统生物工程及工业生物过程的系统生物学研究体系。

(3)微生物生态系统功能的工业利用———研究生态系统碳循环的微生物机制, 了解微生物生态系统中的基因表达、蛋白质功能和复杂的新陈代谢网络, 用分析、模型、仿真工具的组合解释、理解和预测微生物生态系统的行为能力, 探索多种微生物如何通过相互作用, 既响应又适应环境, 发展新的工业生物工程问题解决策略。

(4)生物炼制中的各种化学和工程问题———如各种生物质原料的高效预处理科学和技术, 低品位生物原料的高效利用, 生物材料的构效, 生物聚合物工程, 生物产品的高效分离介质、过程和设备等。

(5)化学工程和工业生物技术的系统工程研究———模拟特殊生命体复杂体系, 借助计算机辅助技术进行新型生物材料的结构设计与自组装生物制造;研究基因的人工编排合成, 用生物系统中的基本组件(基因、蛋白质等)与生物材料合成特殊功能的生物机器;全生命周期评价与分析、生物过程能学分析、过程原子经济分析等。

(6)基于节能减排的过程工程强化技术及应用———针对生物化学过程工业中影响能耗和物耗的关键, 研发新型高效传热、传质及反应装置, 实现流体流动与特殊传热、传质表面及界面结构间的协同强化, 并通过反应耦合、反应-分离耦合、吸放热耦合等, 显著降低传递与反应过程的阻力, 实现传热、传质及反应装置的高效、紧凑、耦合强化, 并在过程工业中推广应用。

(7)基础化学品生产与转化的绿色过程工程———针对基础化学品的生产过程, 通过解决介质分子设计、物质温和转化、过程强化和系统集成的关键共性问题, 围绕包括绿色介质、反应机理、传递规律、清洁工艺及设备、系统物质-能量耦合规律等, 研究建立工艺、设备/过程及系统3个层次的节能新理论和新方法, 开发清洁生产工艺和过程, 为大规模高污染过程工业的绿色化技术升级换代提供科学基础平台。