-细胞凋亡的检测方法-

细胞凋亡的检测方法

细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。

一、细胞凋亡的形态学检测

二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中（图3）。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

方法

1 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min 后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。

2 贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。

3 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。

结果（图4、图5）

注意事项

1. 整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。

2. 操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。

三、线粒体膜势能的检测

线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。

线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。

方法：将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123（1mM）或终浓度为DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C平衡30min，流式细胞计检测细胞的荧光强度。

注意事项

1．始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位。

2．与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。

四、DNA片断化检测

细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成

50~300kbp长的DNA大片段, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。

1. 大分子染色体DNA片段的测定

细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300kbp长的DNA大片段。所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA，DNA像通过弯管一样，以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为"爬行"。因此，细胞凋亡早期产生的50~300kbp长的DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大的DNA

分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向重新定向后，才能继续向前移动。DNA分子量越大，这种重排所需要的时间就越长。当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时，DNA就可以按其分子量大小分开。

参考文献 Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039

2． DNA Ladder 测定

方法：收获细胞（1′107）沉淀?细胞裂解液?13000rpm′5min, 收集上清?1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C，2h?蛋白酶K（2.5mg/ml）37°C，2h?1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA，4°C过

夜?14000rpm′15min?最后将沉淀溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer?1.2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色并照相。

结果：[图6]

参考文献 Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507

3．凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析

方法：收集细胞?70%冷乙醇（in PBS）4°C固定过夜?PBS洗涤，1000rpm′10min?RNase A（0.5mg/ml）37°C

消化30min?PI（50mg/ml）染色，室温避光15min?FACScan分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。

结果：[图8]

4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)

优点：敏感度高，适合于检测少量样本，小部分凋亡细胞。如临床活组织检测。

五、TUNEL法

细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA 的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

六、Caspase-3活性的检测

Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。

1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly （ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。

方法：

收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL显影或NBT/BCIP显色。

结果：[图9-1、图9-2]

2 荧光分光光度计分析

原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。

方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?制备细胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽荧光底

物）?37°C反应1h?荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。

结果：[图10]

3 流式细胞术分析

方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?加Ac-DEVD-AMC?37°C反应1h?UV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。

结果：[图11]

七、凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析

TFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因，前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象，伴随着细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。同时我们发现，凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明，凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件，提供了一种新的技术和指标。

（一）TFAR19蛋白的细胞定位分析

材料试剂：

FITC标记的单克隆抗体，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20），胎牛血清，荧光细胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip头，移液器。

仪器：低温水平离心机, 37°C水浴箱，荧光显微镜，共聚焦激光扫描显微镜，流式细胞计

方法：

1 悬浮细胞的染色：

（1）收获正常和诱导凋亡的细胞（0.5~1′106），PBS洗2次，1000rpm′10min。

（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。

（3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。

（4）加入200ml胎牛血清，室温反应30min。

（5）加入5ml FITC标记的TFAR19单抗（终浓度为1：40），4°C反应30min

（6）荧光细胞洗液洗2次，1000rpm′10min。

结果观察：将细胞沉淀滴片，荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察TFAR19在细胞中的定位。同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的平均荧光强度。[图12]

2：贴壁细胞的原位染色

（1）贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中（内有洁净盖玻片），让其爬片生长，待长到

50%~80%满时，凋亡诱导剂处理细胞。

（2）将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色，染色步骤同上。

（3）将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ml）的载玻片上，荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜观察TFAR19在细胞中的定位。

结果观察：[图13]

3：临床病理切片的染色、检测。

4：原代细胞的培养、检测。

5：分析TFAR19蛋白在人体内各组织器官的分布及定位

（二）TFAR19蛋白的表达与临床疾病

1． ELISA法检测正常人和疾病状态下，以及疾病的不同时期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗体水平。材料和试剂：

1) 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸盐Buffer

2) 洗涤液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20

3) 封闭液： 3%BSA（用洗涤液配制）

4) 酶标抗体的稀释：用封闭液稀释

5) OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g 柠檬酸 0.51g DDW 100ml

6) 显色液（现配现用）：底物Buffer 10ml OPD 2mg 30% H2O2 2ml

7) 终止液 2Mol/L H2SO48. 重组人TFAR19, HRP标记的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISA Reader（OD490nm），洗板机

操作步骤

1) 用包被Buffer稀释的重组人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C过夜（一般24h以上）。

2) 洗涤Buffer洗板三次，加入封闭液，200 ml/well ，37°C孵育2h或4°C

过夜。

3) 洗涤Buffer洗板三次，加入不同稀释度的病人血清（3个重复孔）100ml/well ，37°C孵育1h。设包被Buffer、洗涤Buffer 、封闭液为阴性对照。

4) 洗涤Buffer洗板三次，加入1：2500稀释的HRP标记的抗人IgG, 100ml/well，37°C孵育1h。

5) 洗涤Buffer洗板三次，加入显色液，100 ml/well，避光反应10~15min。

6) 加入H2SO4终止反应，50 ml/well。

7) ELISA Reader 读取OD490 光密度值，分析和比较病人血清和正常血清中TFAR19自身抗体的表达水平。

2． Western blot 分析原发性肿瘤细胞和正常细胞的TFAR19蛋白的表达水平。

细胞凋亡检测方法在肿瘤研究中的应用

随着对细胞凋亡的研究和认识的不断深入，对包括肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本的细胞凋亡的检测已成为一种迫切需要。目前，多种方法已得到较广泛的应用。然而如何选择适当的方法并对检测的结果作出正确的判断及愉如其分的解释仍是值得探讨的问题。本文简要评述几种常用的细胞凋亡检测方法。

一、细胞凋亡的形态学观察

细胞凋亡（apoptosis）的命名主要是根据某些单个细胞死亡时细胞碎裂如花瓣或树叶散落般的形态学特征。目前对细胞凋亡的认识正不断得到深化，检测凋亡细胞的方法也逐渐增多，但形态改变仍是确定细胞凋亡的最可靠的方法。

光学显微镜观察

凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染，形成致密质块，有时可碎裂。在HE染色的组织切片中细胞体积缩小，胞质致密、嗜酸性染色增强，并可形成凋亡小体。在组织中凋亡细胞常以分散单个形式存在，凋亡细胞与周围细胞分离，不引起炎症反应。本方法简便易行，但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难，常缺乏较为特征的指标，具有较强的主观性，重复性差。本方法可用于调亡现象的初步观察，作为分析指标之一。

检测方法：细胞涂片或组织石蜡切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物镜下观察凋亡细胞的形态改变，结合显微测量工具可作凋亡细胞计数。

视频时差显微技术（video time-lapse microscopy）

本方法用于细胞培养，通过相差显微镜可动态观察细胞凋亡的变化过程，尤其是观察细胞表和外形的变化。凋胞与基质分离，胞体变圆、收缩、出泡，有的细胞拉长，出现钉状突起，特续数小时后细胞膜破裂，细胞溶解，通过连续观察，本方法可养壑培养中的凋亡细胞，但不能用于病理组织。

检测方法：收集2×105细胞/ml培胞，置于多孔培养板，加入凋亡诱导剂，在带有自动摄像装置的相差显微镜下观察凋亡细胞的动态改变，每隔分钟30秒作序列摄影，连续24小时。如同进进行荧光染色，可参荧光晃微镜下观察和摄影。

电子显微镜观察

关于凋亡细胞的超微结构特征，包括透射电镜和扫描电镜下的改变，在许我文献中已有详尽描述。凋亡细胞的典型形态改变如胞质的固缩，染色质浓缩成半月形或帽状附于核膜，核的碎裂和凋亡小体形成等，在透射电镜下得到最佳的体现。为凋亡细胞判定提供了最可靠的依据。本方法的缺点是样品制作过程较复杂，且仪器、设备的费用昂贵，较难广泛大量开展。由于样品范围局限，在凋亡细胞数较少时需进行大量的观察才能观察到典型的凋亡改变。还应指出的是，在观察体外培养的凋亡细胞时，常可见到各阶段的改变，并可见到较多典型的凋亡细胞时，常可见到各阶段的改变，并可见到较多典型的凋亡小体很少见到，出现较多的是凋亡初期胞体收缩、染色质边聚和后期凋亡小体（或整个凋亡细胞）被吞噬和降解的现象。一些不典型的改变容易被忽略，在观察时要特别予以注意。

检测方法：透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸电子又重染色，透射电镜观察。扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，乙醇逐级脱水，CO2临界点干燥，真空喷金，扫描电镜观察。

流式细胞技术

流式细胞仪检测凋亡细胞是通过检查其光射特征及荧光参数时行的。细胞穿过流式细胞仪的激光束集点时使激光发生散射，分析散射光可以提供细胞大小及结构的信息。散射光包括前向散射光和左向角散射光两种，前向散射光的强度与细胞大小、体积相产，右向角射光的强度与细胞结构的析射性、颗粒性（granu-larity）有关。细胞凋亡过程中出现的形态改变如细胞皱缩、胞膜起泡、核浓缩和碎裂等可以使光散射特性发生改变。早期凋亡细胞主要表现为前向散射光减弱而右向角散射光增强或不变，前者反映了细胞的皱缩，后者反映了细胞的核逐缩及碎裂。晚期凋亡细胞的前向散射光和右向角散射光均减弱。由于光散射牧场生并非凋亡细胞的特异性指标，细胞的机械性损伤和细胞坏死也可以使前向散射光减弱。因此，只有将光散射特性的检测与荧光参数的检测结合起来才能准确地辨认凋亡细胞。

细胞凋亡过程中核酸内切酶在DNA分子核小体间的降解，导致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，细胞荧光染色后作流式细胞仪分析，可以发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的Go/G1峰前出现一个亚二倍体峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡细胞。根据此亚二倍体峰可以计算凋亡细胞的百分率。此外，流式细胞术还可以通过测定线粒体膜的电位、溶酶体质子泵的活性及细胞DNA/总蛋白质比例等方法辨认凋亡细胞。

检测方法：获取密度1×106细胞/ml左右的细胞悬液，精洗，固定，荧光染料染色，上流式细胞仪分析。

二、细胞凋亡的细胞化学测定

细胞凋亡的细胞化学测定包括细胞表面（细胞膜）的结构和通透性改变的测定和细胞核DNA改变的测定。根据应用的范围，又可分为细胞群休和单个细胞测定两种，以下仅介绍其中几种较为常用的方法。

碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测

早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA结合的荧光染料（如PI)不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。

检测方法：获取11×106细胞/ml的细胞悬液，先用PI染色，再行Hoechest3342染色，进行流式细胞仪分析或荧光显微镜观察。PI及Hoechest3342均使用340nm紫外线激发，前者荧光为红色（620nm）,后者荧光为蓝色（480nm）。正常细胞蓝色最强。早期凋亡细胞由于DNA的漏出蓝色稍弱并有少量的红色荧光，晚期凋亡细胞红色荧光加强。坏死细胞红色荧光最强。

膜联蛋白（annexin）V标记

正常细胞的细胞膜磷脂分布是不对称的，磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）位于细胞膜内侧，在细胞凋亡时转至细胞膜外表面，这一改变被认为是特导性的，并且可作为凋亡细胞表面改变的标记。PS表面化发生于凋早期，其机制尚不清，可能是一种导致机体吞噬凋亡细胞的信号。膜联蛋白V是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和力，荧光标记的膜联蛋白V与细胞表现PS结合，再用显微镜或流式细胞仪进行检测，可以观察凋亡过程中细胞膜PS的表面化。结合PI染色进行双参数检测尚能区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细胞。正常细胞膜联蛋白V（-）PI（-），早期凋亡细胞膜联蛋白V（+）PI（-），晚期凋亡细胞和坏死细胞膜联蛋白V（+）PI（+）。有研究表明膜联蛋白V标记仅有不到三分之一的凋亡细胞出现阳性标记，其原因尚不明。同时需注意度的是凋亡后期溶解阶段，细胞碎片也可出现明显的阳性着色。

检测方法：1×106细胞/ml细胞悬液，先后用膜联蛋白V--FITC及PI染色，流式细胞仪分析，获得由四个象限组成的细胞直方图（cytogram），每个象限的细胞数目就是在检测细胞总数在所点的组份。左下象限代表正常细胞（An-PI-）,右下象限代表早期凋亡细胞（An+PI-），右上象限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞（An+PI+）,左上象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞（An-PI+）。用生物素标记膜联蛋白V还可以作体内试验。将生物素标记膜联蛋白V注射小鼠体内，30分钟后处死，迅速取出要研究的组织置于甲醛内固定，然后，常规石蜡切片，脱蜡、水化，用亲和素标记的过氧化物酶程程序孵育，DAB显色，光镜下观察凋亡细胞。

DNA琼脂凝胶电泳法

细胞凋亡时，在内源性核酸内切酶的作用下，DNA在核小体间被切割成180-200bp整数倍的单或寡核苷酸片段，在电泳时表现为特征性的“梯形带”。自Wyllie把内源性核酸内切酶降解产生“梯形带”与细胞凋亡相联系以来，“梯形带”被作为细胞凋亡的一个重要的生化指标。尽管有报道指出，实验中出现典型的形态改变时可不伴有核小体间的DNA降解，对这一指标提出质疑，本方法仍被广泛应用。但此方法敏感性不高，大量凋亡细胞同时存在时才出现典型的结果，且只能被用于细胞群体，不能用于组织的原位检测。

检测方法：培养细胞清洗、离心，加入细胞裂解液裂解，高速离心，取上清液用酚/氯仿抽提二次，RNA酶消化，然后加到含溴已锭的1％-2％的琼脂糖凝胶的样品的孔中进行电泳，最后在紫外线灯下观察和摄影。

DNA裂解的原位检测

在细胞水平检测DNA裂解的原位标记技术已越来越多地被用于组织切片和培养细胞，细胞凋亡时，由于DNA 的裂解，形成单或寡核小体的双链相对分子质量小的片段及在相对分子质量大的DNA上形成单的继裂（缺口，nick）。此类断裂可用生物素、地高辛或荧光素标记的核苷酸在3`-OH端予以显示。通常采用的酶是DNA聚合酶I或未端脱氧核苷酸转移酶（TdT），前者使核苷酸结合于缺口，需要模板存在，标记方法通常被称为“原位缺口平移”(insitu nick translation,ISNT),后者使核苷酸在双链的断端延伸，不需要模板的存在，其方法被称为未端记（end labeling）、加尾法（tailing reaction）或TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）。上述方法，尤其是TUNEL的应用已很广泛，其优点是可用于原位标记，可用于病理组织，并可进行定量分析。值得注意的是坏死期由于内源性核酸内切酶和蛋白质酶的何等用，DNA被切割成大小不等的片段，也可出现阳性反应。组织或细胞外理不当时可出现假阳性。因而，TUNEL等方法对凋亡细胞的标记是选择性的。而不是特异性的，TUNEL 或其他DNA裂解原位标记的分析应结合阳性细胞的形态，尤其是核的特征，细胞的分布和有无炎症反应，除外非凋亡的阳性反应。

检测方法：石蜡切片常规脱蜡、水化，蛋白质酶K消化，TdT酶和核苷酸混合液孵育，显色（辣根过氧化物酶标记可用DAB显色，碱性磷酸酶标可用NBT+BCIP显色），复染，脱水，封片。凋亡细胞核呈现蓝色（NBT+BCIP 显色）或者棕黄色（DAB显色）。

凋亡蛋白质酶（Caspase）-3及其底物的检测

凋亡蛋白质酶是一类半胱氨酸蛋白质酶，具有特异性水解底物分子天冬氨酸（Asp）残七C端肽键功能，是近年随着调亡研究的深入而发现的重要凋亡分子。迄今已有13个分子得到命名，分别为凋亡蛋白质酶1-13。基中凋亡蛋白质-3是被认为在多种组织、细胞类型中最常涉及的凋亡效应分子。活化的凋亡蛋白质酶-3仅在凋亡细胞中发现，因此，检测凋亡蛋白质酶-3的活性有助于发现早期的凋亡细胞。一般采用人工合成四肽荧光底物如DEVD-AMC，凋亡蛋白质酶-3在D与AMC之间水解，释放荧光物质、AMC，后者在紫外线激发下发出波长为430-460nm的荧光，通过流式细胞仪或分光光度计对其强度进行定量，从而测定凋亡蛋白质酶-3的活性。由于醛对凋亡蛋白质酶-3的水解活性抑制作用，因此同时加入含醛四肽如DEVD-CHO可以抑制凋亡蛋白质酶-3对DEVD-AMC的水解，不产生荧光。这样的抑制试验可作为对照，使凋亡蛋白质酶-3的活性分析更有特异性。但

是，上述方法不适用于组只切片，因此有人尝试采用针对活化的凋亡蛋白质酶-3亚基的抗体，通过免疫组化显示凋亡细胞，然而其敏感性及特异性尚不能令人满意。

检测方法：培养细胞（也可以预先作凋亡诱导并在不同时段收集细胞）在裂解液内裂解、离心、去上清液。加入凋亡蛋白质酶-3的底物（如DEVD-AMC）孵育，同时用不加底物的样品作对照，流式细胞仪检测，加有底物的样品释放出的荧光强度样对照样品明显增强。如加入DEVD-AMC时再加入DEVD-CHO，样品释放的荧光强度与对照样品无差异。

凋亡蛋白质酶-3导致细胞凋良心是通过水解或灭活一些细胞关键蛋白质实现的，因此检测凋亡蛋白质酶-3底物的改变也有助于辨认细胞的凋亡。PARP是第一个被认识的凋亡蛋白质酶-3底物，它的相对分子质量为116000，水解后形成相对分子质量为85000及相对分子质量为25000的两个片段，用运载相对分子质量为85000片段的抗体可以观察细胞是否发生凋亡。细胞骨架蛋白中的CK-18被凋亡蛋白质酶-3水解后，在其C端的第387-396位氨基酸残基形成一个新的抗原表位，用抗此表位的抗体可以在组织切片上辨认凋亡细胞。另外一种细胞骨架蛋白质肌动蛋白（actin）被水解后产生一种称为“fractin”的片段，在凋亡早期出现，并认为与细胞膜的起泡有关，可能有助于早期凋亡细胞的辨认。总之，随着对凋亡蛋白质酶及其底物的进一步研究，将会发现更有价值的有助于检测凋亡细胞的方法。三、展望

除了以上介绍的几种较常用检测细胞凋亡的方尖，还有一些尚未被列入的检测方法，新的方法正将出现。尽管用于检测细胞凋亡的方法较多，但形态学观察，尤其是透射电镜观察仍具有不可替代的作用，只是其应用受到一定限制。在细胞化学检测方法中，迄今没有任何一种方法具有足够的敏感性和特异性，尤其在病理组织中要作出准确定量分析仍较为因难。在目前情况下标本和病变的特点，选择多种适当的方法进行综合检测，常可行到较准确结果，同样重要的是，要充分理解各种方法的原理及应范围，并对结果作出合理的分析和判断。随着对细胞凋亡认识的深化和有关技术的进展，期待更敏感、更特异的方法面世，这对于病理状态（包括肿瘤）中细胞凋亡的研究将具有重要意义。发布时间：2002年09月07日

琼脂糖凝胶电泳检测调亡细胞细胞调亡的研究方法：琼脂糖凝胶电泳

1．用不同方法诱导细胞调亡后，取106调亡细胞，置1.5ml离心管中，用PBS洗涤一次。在微量离心机上全速离心5秒钟，去上清液。加入100μl含5mol/L异硫氰酸胍，100mmol/L 2-巯基乙醇的25mmol/L枸橼酸钠缓冲液pH7.0，在旋涡混悬器上混悬20秒钟，破坏细胞，变性蛋白质。

2．加入50μl含7.5mol/L醋酸氨和0.8mg/ml糖原的水溶液，混匀；加入300μl 100％乙醇，4℃保存过夜。

3．在微量离心机上全速离心30分钟，去上清液。加入75％乙醇同样离心洗涤沉淀物2次。用20μl含100μg/ml 无DNA酶的RNA酶的TE缓冲液消化RNA，37℃30分钟。加入10μl甘油和少量溴酚蓝，直接点样。

4．用50ml TAE溶解2g琼脂糖，加入0.25μg/ml溴乙啶。倒板后加样，用100bp DNA标记物作为标记。25mV 电泳过夜。在紫外线下观察结果。调亡细胞的DNA呈相差200bp的条带的梯形图。

细胞凋亡检测技术与方法更新时间：2003-11-1

细胞凋亡（Apoptosis），又称细胞程序性死亡（PCD: Programmed Cell Death），是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与

的过程。细胞凋亡概念提出至今还不到30年的时间，但由于它在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键角色，对个体的正常发育及细胞凋亡紊乱在病理学研究中的重要作用，引起了人们对其机制和组分的广泛而深入地研究，成为目前生命科学界最为热门话题之一，也是生命科学界乃至社会各界争相投入的研究领域。从近年的SCI排名中我们可以看到，信号传导方面的文章远远超过位于第二位的人类基因组方面的，而信号传导中一个重要的前沿领域就是细胞凋亡的研究。随着这方面研究的持续升温，涌现出了大量新的技术和方法对细胞凋亡进行检测，其中不少已经有商品化的产品出现，大大加速了研究的进程。具体来说，针对凋亡的不同阶段有以下一些方法。1．早期检测: 1）PS（磷脂酰丝氨酸）在细胞外膜上的检测:

PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生, 可能作为免疫系统的识别标志。AnnexinV，一个钙依赖性的磷脂结合蛋白，能专一性的结合暴露在膜外侧的PS，再通过简单的显色或发光系统进行检测。由于这是一种凋亡早期的活细胞检测（悬浮细胞和贴壁细胞都适用），可与DNA染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。

美国著名生物试剂公司CLONTECH和INTERGEN公司分别开发了多种标记的Annexin V产品，简便快速，10分钟就可完成检测。其中带荧光标记的Annexin V-EGFP（Enhanced Green Fluorescent Protein）及An nexin V-FITC，灵敏度高，可作为FACS（流式细胞分选）方法筛选凋亡细胞的基础。由于融合蛋白Annexin V -EGFP，EGFP与PS 的结合比例为1：1，还可进行定量检测。除此之外，还提供生物素偶联的Annexin V，可通过常用的酶联显色反应来检测。另外，MACS公司将磁珠包被Annexin V，可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。

2）细胞内氧化还原状态改变的检测：

这反应了细胞凋亡研究中相对较新的趋势，研究什么样的氧化还原环境引起下游事件的发生。CLONTECH 公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通过荧光染料monochlorobimane（MCB）体外检测凋亡细胞细胞质中谷光苷肽的减少来检测凋亡早期细胞内氧化还原状态的变化。正常状态下,谷光苷肽（glutathione：GSH）作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。在Jur cat和一些其它类型的细胞中，细胞膜中有可被凋亡信号启动的ATP依赖的GSH转移系统。当细胞内GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。

由于GSH与氧化还原作用及线粒体功能密切相关，此项检测除了对研究细胞凋亡的起始非常有用外，还可用于心脏病、中风等疾病治疗的研究。但有些细胞如：HeLa 和3T3细胞凋亡时没有明显的GSH水平的变化，不能用此法检测。

3）细胞色素C的定位检测

细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液，结合Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）后启动caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。

细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4）是定位在线粒体内膜上的膜蛋白，凋亡发生时，它保留在线粒体内，因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的标志。

ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超离心，可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高度富集的线粒体部分，再进一步通过Western杂交用细胞色素C抗体和COX4抗体标示细胞色素C和COX4的存在位置，从而判断凋亡的发生。

4）线粒体膜电位变化的检测：

在凋亡研究的早期，从形态学观测上线粒体没有明显的变化。随着凋亡机制研究的深入，发现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分，发生很多生理生化变化。例如，在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化，导致膜穿透性的改变。MitoSensorTM，一个阳离子性的染色剂，对此改变非常敏感，呈现出不同的荧光染色。正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，发出强烈的红色荧光。凋亡细胞中，因线粒体穿膜电位的改变，它以单体形式存在于细胞液中，发出绿色荧光。用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。CLON TECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用这种原理来检测线粒体膜电位的变化。但是，这种方法不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化。

2．晚期检测：细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些Caspase的底物）在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。对于这一现象的检测通常有以下两种方法：

1）TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）

通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP （多为dUTP）间接（通过地高辛）或直接接到DNA片段的3’-O H端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。美国Intergen公司提供多种标记方法，直接荧光标记，地高辛介导荧光标记或过氧化物酶联显色，可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。其中，直接标记步骤少，操作简便。而间接标记有信号放大的作用，检测灵敏度高。

2）LM-PCR Ladder （连接介导的PCR检测）

当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通过LM-PCR（ligation-mediated PCR）,连上特异性接头，专一性地扩增核小体的梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生的核小体的梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。

上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。

3）Telemerase Detection （端粒酶检测）

这是相对来说推出较早，用得较多的一种方法。端粒酶是由RNA和蛋白组成的核蛋白，它可以自身RNA 为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细胞获得“永生化”。正常体细胞是没有端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现，9 0%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。Intergen公司的TRAP-eze Telemerase Detection Kit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分别与底物及端粒重复序列配对的引物。如果待测样本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同个数的6碱基（GGTTAG）端粒重复序列，通过PCR反应，产物电泳检测就可观察到相差六个碱基的DNA Ladder现象（参见图4）。此外，Intergen公司还提供用酶联免疫法（ELISA）检测的试剂盒. 同样，这种检测方法也不专对细胞凋亡，检测结果也不纯反应细胞凋亡的发生。

3．mRNA水平的检测

研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞（cytotoxic T cells）等靶细胞。B cl-2 和bcl-X （长的）作为抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的调节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。一般多采用Northern杂交和RT-PCR走胶对它们进行检测。随着近年来荧光定量PCR技术的发展，用定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确。Intergen公司的Amplifluor? Apoptosis Gene Systems

就根据这一新技术原理，通过检测fas, bax-alpha 和bcl-X （长的）基因的mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测。

以上介绍了针对凋亡不同阶段特征的检测方法，随着凋亡机制研究的深入，近年来还发展了许多针对特定的凋亡途径的检测，如抗体法，酶活性测定等等，Cell Signeling technology公司，DAKO公司，Santa-Cruz公司，Calbiochem & Oncogene公司都紧跟科研潮流，开发了大量的抗体及活性测定产品。我们将陆续报道这方面的技术方法与产品。（基因快讯）

细胞系或细胞株的建立更新时间：2004-12-21

一、概念

1、细胞系（Cell Line）：原代培养舞经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（Lineage of Cells）所组成。

2、细胞株（Cell Strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞株（finitecell strain）；如果可以连续传代，称为连续细胞株（continuous cell strain）。对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。

二、建立细胞系（或株）的要求

什么样的体外培养群可被认可为己鉴定的细胞，视具体情况而定，无统一规定。对于用作原代培养的细胞只要供体均一，取材部位及组织种类等条件稳定即可，如用做长期培养，特别是反复传代的细胞，常需做如下说明：1、组织来源：细胞供体所属物种，来自人体或者动物；个体性别、年龄；取材的器官或组织。

如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断，以及病历号等。

2、细胞生物学检测：

了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞一般形态，特异结构，细胞生长曲线和分裂指数，倍增时间，接种率

等。

如为肿瘤细胞，为说明来源于原肿瘤组织并保持恶性，须做软琼脂培养，异体接种致瘤和对正常组织侵润力等实验。

3、培养条件和方法；应说明细胞系（或株）适应的生存环境，即指明使用的培养基、血清种类、用量以及适宜PH值。

三、若干细胞建株的要点及基本过程

（一）肿瘤细胞培养技术要点

1、取材：材料主要来源于外科手术或活检瘤组织，取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料。取材后尽快培养，因故不能立即培养者，可冻存。其培养方法及冻存方法同前述正常组织。

2、成纤维细胞排除：在肿瘤组织中常混杂有一些成纤维细胞，培养时能与瘤细胞同时生长，并常压过癌细胞，导致癌细胞生长受阻以至消失，应仔细排除。

排除方法常有：机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法等。

3、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率

根据实验经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。一般当肿瘤组成或细胞被原代培养后，要经过对新环境的适应才能生长，因此不能局限于一般培养法，须采用一些特殊措施。如：用适宜底物，鼠尾胶原底层及饲细胞底层等。用细胞生长因子，根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子，如胰岛素、氢化可的松，雌激素等。也可以考虑动物媒介培养。

（二）人类淋巴母细胞建株方法

l、4ml肝素抗凝血于离心管中，加入2ml RPMI 1640。

2、混匀后沿管壁缓慢加到预置有4ml淋巴细胞分离液的液面上静置30min。

3、1500rpm，15min，吸取白细胞层（第二层）于另一离心管中。

4、加RPMI 1640 5ml洗涤白细胞两次。

5、将白细胞接种至1ml RPMI 1640培养基中，加入10μl环胞霉素和100μl的EBV（EB病毒）液，混匀。

6、水浴摇床，40次/分，37℃，3hr。

7、1500rpm，15min。将细胞接种至1ml培养基中（内含谷氨酰胺1mM／ml）加入10μl环胞霉素，轻轻混匀，37℃培养。

8、5天后观察细胞转化和生长情况，决定是否半量换液。一般半量换液l—2次，并维持环胞霉素的浓度。

9、待转化细胞数量明显上升，并出现细胞团块后，可转入25ml细胞培养瓶中，加1—2ml培养基，37℃培养10—15天，一般每隔3—4天观察一次，决定是否换液，传代。

10、细胞生长达一定数量后冻存，冻存前应进行核型分析和存档。

肿瘤细胞/细胞系的培养

肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞。当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。

一、组织培养肿瘤细胞生物学特性

肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出

特点：

（－）形态和性状

培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定

向运动和锚着不依赖性有关。

（二）生长增殖

肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2％～5％）仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的

一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。

（三）永生性

永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）。体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。因恶性肿瘤终将杀死宿主并同归于尽，从而难以证明这一性状的存在。体外肿癌细胞的永生性是否能反证它在体内时同样如此？也尚难肯定。从近年建立细胞系或株的过程说明，如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的，肿瘤细胞应易于培养。事实上，多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。生长增殖并不旺盛；经过纯化成单一化瘤细胞后，也大多增殖若干代后，便出现类似二倍体细胞培养中的停滞期。过此阶段后才获得永生性，顺利传代生长下去。从而说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。从一些具有永生性而无恶性性的细胞系，如NIH3T3、Rat－1、10T1/2等细胞证明，永生性和恶性（包括浸润性）是两种性状，受不同基因调控，但却有相关性。可能永生性是细胞恶变的阶段。至少在体

外是如此。

（四）浸润性

浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织

细胞中，并有穿透人工隔膜生长的能力。

（五）异质性

所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。异质性构成同一肿瘤内细胞的活力有差别的瘤组织；处于瘤体周边区的细胞获得血液供应多，增殖旺盛，中心区有的细胞衰老退化，有的处于周期阻滞状态，那些呈活跃增殖状态的细胞称干细胞（Stem Cells）、只有这些干细胞才是支持肿瘤生长的成分。

肿瘤干细胞培养时易于生长增殖；把干细胞分离出来的培养方法称干细胞培养。

（六）细胞遗传

大多数肿瘤细胞有遗传学改变，如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。肿瘤细胞群常由多个细胞群组成，有

干细胞系和数个亚系，并不断进行着适应性演变。

（七）其它

肿瘤细胞在体外不易生长的原因可能由于：①依赖性：肿瘤细胞虽有较强克隆生长力，但仍有一定的群体性或与其它细胞相依存关系。一是肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互依存，二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系，可能影响癌细胞增殖生长的活性；②肿瘤细胞的自泌也会因分散培养而被稀释，达不到肿瘤生长的需求，降低肿瘤细胞的生长增殖力；③并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的Life Span，只有干细胞才有强的增殖生长能力，但这些细胞数量很少；④离体培养肿瘤细胞

可能需求与体内相似的特殊生存条件。

二、培养方法

肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。在具体培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养法均可。（一）

要点

1．取材：

人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材后宜尽快进行培养，

如因故不能立即培养，可贮存于4℃中，但不宜栽过24小时。

2．培养基：

肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的RPMIl640、DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因肿瘤细胞有自泌（Autocrine）性产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。按不同细胞需要不同的生长因子；肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。有的还需特异性生长因子〔如乳腺癌细胞等）。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。

3．成纤维细胞的排除：

成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。排除成纤维细胞有多种方法（表2－1）。

表2－1 抑制成纤维细胞生长因素

注：上表结果为个别实验室经验，仅供参考

（二）成纤维细胞排除法

1．机械刮除法：

是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）。刮除程序为：

（1）标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；

（2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间；

（3）用Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；

（4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止

2．反复贴壁法：

根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。

（1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks 冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；

（2）取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中。置温箱中静止培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后；向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；

（4）培养B瓶中细胞5～20分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中；再向B瓶中补加完全培养基。

当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。

3．消化排除法：

此法曾用于乳癌细胞的培养，具体程序是：

（1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；

（2）把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。4．胶原酶消化法：

本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。

（1）可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化；

（2）用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次重复。

5．其它方法：

有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用；也有人用聚蔗糖制备成比重1.025～1.085的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在23℃中800g离心10分种。在比重1.025～1.050层为成纤维细胞，在比重1.050～1.08 5层为上皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化学物如SOD抑制成纤维细胞生长的方法。

选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。

（三）提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施

根据人们的经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。当肿瘤组织或细胞初代接种培养后，常出现以下几种情况：

完全无细胞游出或移动；

有细胞移动和游出，但无细胞增殖，细胞长时间处于停滞状态以致难以传代；

有细胞增殖，传若干代后停止生长或衰退死亡；

传数代后细胞增殖缓慢，经过一段停滞期后，才又呈旺盛生长状态，形成稳定生长的肿瘤传代细胞系。

以上现象说明肿瘤细胞对体外生存条件有较高的要求，并需经过对新环境的适应才能生长，因此欲获得好的培养

效果，不能局限于一般培养法，必须采用一些特殊的措施。

1．适宜底物：

把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。

2．生长因子：

应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生长物，常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。

为提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应力和增加有活力癌细胞（干细胞）的数量，可采用动物体转嫁接种成瘤后，再从动物体内取出进行培养，能提高体外培养的成功率。受体动物以裸鼠最好。

3.动物体媒介培养方法：

（1）瘤块接种：取新鲜瘤组织，用Hanks液洗净血污，切成1～3毫米小块，用穿刺针头吸一小瘤块，用酒精棉球擦拭动物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤块；

（2）饲养观察，待肿瘤生长达较大体积后，剥取出瘤组织；（3）进行体外培养。

（4）为防止失败，仍取部分瘤组织继续在裸鼠体内传代。通过裸鼠媒介接种，有活力的肿瘤细胞数量增多，细胞培养易于成功。肿瘤细胞培养方法与培养正常细胞完全相同，但成功率比正常细胞高。

（四）体外培养肿瘤细胞生物学检测

一旦培养的肿瘤细胞生长成形态上单一的细胞群体或细胞系（或株）后，不论用于实验研究还是建立细胞系，都需要做一系列的细胞生物学测定，主要的目的在于求得证明：

所培养的细胞系的确来源于原体内具有恶性的细胞，而非正常细胞或其它细胞。均具有瘤种特异性。阐明一般生物学性状。测定项目数量无明确规定，根据需要而定，以下为常做的项目和要点。

【形态观察】主要观察细胞的一般形态，如大体形态、核浆比例、染色质和核仁大小、多少等以及细胞骨架微丝微管的排列状态等。【细胞生长增殖】检测细胞生长曲线、细胞分裂指数、倍增时间、细胞周期时间。【细胞核型分析】检测核型特点，染色体数量、标记染色体的有无、带型等。

【凝集试验】检测凝集力。【软琼脂培养】检测集落形成能力。

【异体动物接种】向异体动物体内（皮下）接种细胞悬液，观察成瘤能力。

【其它】除上述项目外，根据需要还可做同位素标记、组织化学成分分析，荧光显微镜观察等。

在上述肿瘤细胞生物学检测中，最主要的为：异体动物（以用裸鼠为上）接种成瘤、软琼脂培养、核型分析、细胞骨架和电镜观察等几项。当然从分子细胞学角度考虑尚应做癌基因和抗癌基因等的检测，这些项目将在本书第二篇中介绍。

（五）对肿瘤细胞系或细胞株的评价

已建成的各种肿瘤细胞系或细胞株，无疑都是可用的实验对象。近年我国已建成的肿瘤细胞系已非常多，并获得越来越广泛的应用。但根据研究者的经验，在使用这些细胞系时，应持特别审慎态度，主要是应考虑到这些细胞在长期传代中有否发生遗传性改变的可能。众所周知，长期传代细胞系染色体核型常是不稳定的。另外也可能发生如基因突变、基因易位或缺失等变化。其结果可能导致细胞产生生物学性状上的变动。以近年建成的各种肿瘤细胞系为例，都已传代少则几十，多则百代以上后，才确认建成了细胞系。这种情况下很难保证细胞从初代到建成时的性状仍是一致的。已如前述，癌细胞在培养中并非能很顺利地传下去，凡已长期传代的细胞系，都已获得不死性。当前尚未完全确证所有癌细胞都具有不死性；因此尚难肯定在长期培养中的癌细胞的生物学性状与体内