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Dnmt1 DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1)

DNA甲基转移酶的表达调控及主要生物学功能

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DNA 甲基化是表观遗传学的重要部分，同组蛋白修饰相互作用，通过改变染色质结构，调控基因表

达。在哺乳类细胞或人体细胞中，DNA 甲基化与细胞的增殖、衰老、癌变等生命现象有着重大关系。对催化DNA 甲基化的DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferase, Dnmt）的研究可以揭示DNA 甲基化对基因表达调控的机制，从而研究与之相关的重要生命活动。文章以DNA 甲基转移酶作为切入点，探讨DNA 甲基转移酶在基因表达调控中发挥的作用及其主要生物学功能。

关键词：甲基生物学调控DNA甲基转移酶表观遗传学DNA甲基化表达调控生物学功能甲基转移酶

苏玉, 王溪, 朱卫国

北京大学基础医学院, 北京100191

摘要：DNA 甲基化是表观遗传学的重要部分，同组蛋白修饰相互作用，通过改变染色质结构，调控基因表

达。在哺乳类细胞或人体细胞中，DNA 甲基化与细胞的增殖、衰老、癌变等生命现象有着重大关系。对催化DNA 甲基化的DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferase, Dnmt）的研究可以揭示DNA 甲基化对基因表达调控的机制，从而研究与之相关的重要生命活动。文章以DNA 甲基转移酶作为切入点，探讨DNA 甲基转移酶在基因表达调控中发挥的作用及其主要生物学功能。

关键词：DNA 甲基转移酶; DNA 甲基化; 表观遗传学

DNA methyltransferases: the role in regulation of gene expression and biological processes

SU Yu, WANG Xi, ZHU Wei-Guo

School of Basic Medical Sciences, Peking University, Beijing 100191, China

Abstract: Both hitone modification and DNA methylation remodulate chromatin structure and control gene expression or silence. As a main enzyme for DNA methylation, DNA methyltransferase (Dnmt) is not only associated with DNA methylation, but also links to many important biological activities, including cell proliferation, senescence and cancer development. This review focuses on structure, regulation and function in biological processes of Dnmt. Keywords: DNA methyltransferase; DNA methylation; epigenetics

DNA 的甲基化修饰是真核细胞基因表达调控的特点之一。在哺乳动物的某些基因中，5’侧翼区为CpG的高频区，称为CpG岛。DNA 甲基化多发生在这些CpG岛的胞嘧啶第五位碳（C5）上。首先甲基转移酶与DNA 结合，将目标核苷酸反转暴露于DNA 双螺旋之外，之后半胱氨酸的亲和基团与胞嘧啶第六位碳（C6）共价结合，从S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine, Adomet）处转甲基至胞嘧啶C5 上[1]。通过这种甲基化机制和组蛋白修饰、染色质重组等共同作用，细胞可以不改变DNA 的碱基序列，而调控不同基因在不同细胞和组织中的表达。DNA 的甲基化是通过DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferase, Dnmt）催化和维持的。一般认为，哺乳动物的Dnmt有4 种，分为两个家族：Dnmt1 和Dnmt3（另有一种Dnmt2，主要为tRNA的甲基转移酶，也有报导称Dnmt2 具有微弱的DNA 甲基转移酶活性[2]）（图

1）。Dnmt1 家族在DNA 复制和修复中维持其甲基化；而Dnmt3 家族则催化CpG从头甲基化（denovo methylation）。Dnmt3 包括了两个从头甲基转移酶Dnmt3a、Dnmt3b 和一个调节蛋白Dnmt3L[1]。

图1 Dnmt的家族成员及其结构

Dnmt1 的结构域为：N 端与某些蛋白特异结合区，C 端的酶活性区和及其他未知区域；Dnmt2 主要为tRNA甲基转移酶；Dnmt3a 和Dnmt3b 的结构域为：N 端的可变区，PWWP 结构域，半胱氨酸富集区，C 端的酶活性区；Dnmt3L 有半胱氨酸富集区，但C 端不具单独的催化活性[1]。罗马数字表示酶结构中的一些保守序列。

Dnmt1 是1988 年Bestor等[3]从真核生物克隆出来的第一个DNA 甲基转移酶，是一种胞嘧啶C5 特异的甲基转移酶。Dnmt1 分子量为183 kDa，一般认为Dnmt1 有3 个结构域：C 端的催化域，N 端的某些蛋白识别的靶区域，以及其他未知区域[4]。最近有研究表明Dnmt1 的半胱氨酸富集区可与未甲基化的CpG岛结合，这说明除了催化区域以外，Dnmt1 的其他结构域也与酶活性有重要关系[5]。Dnmt1 的结构可能还会通过与氨基酸相互作用和（或）催化域的丝氨酸磷酸化而发生变化[6, 7]，这可能与酶的活性、与DNA 结合等的调节有关。Dnmt1 的主要作用是维持DNA 甲基化，这种维持作用可以将DNA 甲基化信息传递给子代细胞。

Dnmt3a 和Dnmt3b 的结构域基本相同，都在N 端存在一可变区，可变区之后至C 端依次为：PWWP（Proline tryptophan tryptophanproline）结构域，其可能与DNA 非特异性结合有关；半胱氨酸富集的锌结合区域；C 端的催化活性区域。

Dnmt3L 是一种Dnmt3 类似蛋白，具有半胱氨酸富集的锌结合区域，但缺少C 端的酶催化活性域，所以没有单独的催化活性。但它是DNA 从头甲基化的调节因子，通过与Dnmt3a 和Dnmt3b 的C 端结合，可提高它们的催化活性，正向调节DNA 从头甲基化[8]。

1 DNA 甲基转移酶的基因表达调控

一般认为DNA 甲基化通过两种途径抑制基因表达。第一种是直接阻碍转录因子与甲基化的CpG岛结合，直接抑制基因表达[9]；另一种是通过招募DNA 甲基结合蛋白（Methyl-CpG-binding proteins, MBP）及一些阻碍复合物，阻止转录因子与特定DNA 序列结合，间接抑制基因表达[10]。本实验室发现p21 启动子上的转录因子Sp1 结合位点的甲基化并不阻碍Sp1 结合到其启动子上[11]，说明第一种途径的抑制作用并不表现在所有基因中。而在第二种途径中，Dnmt和MBP 可与组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase, HDAC）、共抑制子（co-repressor）和ATP 依赖的染色质重塑蛋白等结合形成抑制复合物，与组蛋白去乙酰化和染色体重塑共同作用，从而抑制基因表达[12~14]。

Dnmt与组蛋白修饰相关因子的相互作用是Dnmt调控基因表达的重要手段。Dnmt1 的N 末端可以与HDAC1、HDAC2 结合，Dnmt3a 和Dnmt3b 也可以招募HDAC，从而使组蛋白去乙酰化[15]。Dnmt除了可以与HDAC 相互作用外，还与组蛋白的甲基化有关。DNMT1 的N 端可以招募组蛋白甲基化酶Suv39h1（Suppressor of variegation 3-9 homolog 1）和识别HP1 （Heterochromatin protein 1）[14]。Dnmt3a 也可与HP1 相互作用，而HP1 具有识别甲基化的组蛋白、稳定异染色质浓缩结构的作用[16]。研究人员还发现DNMT3A 可以直接识别对称甲基化的组蛋白H4R3me2s （Symmetric methylation of histone H4 arginine 3）[17]。这说明Dnmt的基因表达抑制作用与组蛋白修饰和染色质重塑相关。这种机制的意义可能是：由于组蛋白的变构在细胞增殖过程中不能直接传递，所以通过Dnmt对新复制得到的子代DNA 甲基化型的保留，得到基因是否转录的信息，从而使子代细胞中组蛋白正确地乙酰化或去乙酰化。

DNMT1 的N 端可以识别MBP 家族中的MBD1（Methyl-CpG binding domain 1）、MBD3、MeCP2（Methyl-CpG binding protein 2）[14]。一项研究显示，大鼠肝细胞瘤中的Dnmt1、Dnmt3a 和Dnmt3b 数量是正常肝细胞的4～10 倍，MeCP2 是正常的8 倍，MeCP2 与MT-1 启动子相互作用，抑制MT-1（一种抗氧化剂）的表达，说明MeCP2 和Dnmt都与肿瘤中MT-1 基因表达抑制有关[18]。在Xist基因沉默的相关研究中，另一种甲基结合蛋白Mbd2 与Dnmt1 和HDAC 抑制物有相互作用，是导致Xist基因沉默的中介[19]。Dnmt通过招募这些蛋白，与组蛋白修饰和染色体重塑共同作用，间接抑制基因表达。

Dnmt间接的基因沉默作用还表现在与一些共抑制子的相互作用上。如Dnmt3a 可以与一种转录抑制蛋白RP58 结合，二者共同抑制基因表达[20]。DNMT3B 在HeLa细胞中可以与共抑制子SIN3A（Kinetochore associated protein）相互作用，同时也可与KIF4A（Kinesin family member 4A）和condensin相互作用参与染色体浓缩[21]。这些研究结果表明，Dnmt与相关蛋白的相互作用不仅是间接抑制基因表达的途径，也是Dnmt参与组蛋白修饰、染色体变构的途径。

最近的一些研究还揭示了Dnmt与另一组基因沉默相关因子PcG（Polycomb group）的相互作用。PcG蛋白组成的多聚复合物PRC（Polycomb repressive complexes）2 和3 中的EZH2（Enhancer of zeste homolog 2）可以和Dnmt相互作用，共同抑制基因表达，并且EZH2 是其靶基因启动子甲基化所必需的[22]。PRC1 活化相关的NSPc1（Nervous system polycomb 1）蛋白，与DNMT1、EZH2 共同结合在HeLa细胞中的HOXA7 启动子上，当NSPc1 缺失时DNMT1 与HOXA7 启动子的结合下降，同时DNMT1 缺少时NSPc1 的结合水平也下降[23]。这些研究结果说明Dnmt参与的DNA 甲基化的基因沉默机制和PcG参与的基因沉默机制也存在交互作用。

一些因子可以作用于Dnmt，导致酶的数量或活性发生改变，从而影响DNA 甲基化水平，影响基因表达。HDAC 抑制剂apicidin在HeLa细胞系中可以下调DNMT1 水平，而DNMT1 的缺少会导致肿瘤细胞死亡[24]。SNF2（Sucrose non fermenting protein 2）家族相关的ATP 依赖染色质重塑蛋白hSNF2H（Human sucrose non fermenting protein 2 homologue）可以与DNMT1 的N 端结合，当hSNF2H 存在时，DNMT1 对单核苷酸的亲和力升高[25]。研究发现另一种SNF2 家族相关的ATP 依赖染色质重塑蛋白LSH（Lymphoid-specific helicase）并不直接导致DNA 甲基化，而是通过增加Dnmt的数量间接引起甲基化[26]。最近的一项研究中，小鼠LSD1（Lysine-specific demethylase 1，又称为KDM1 和AOF2）的编码基因Aof2 被敲除后DNA 甲基化水平下降，Dnmt1 水平下降[27]。组蛋白甲基化酶SET7 也可调控的DNMT1 的稳定性。SET7 通过直接与DNMT1 相互作用，并特异地甲基化DNMT1 的第142 位赖氨酸，实现其对Dnmt1 数量和活性的抑制作用[28]。可见，这些因子可以通过调控Dnmt数量和活性间接参与基因沉默，同时Dnmt也通过这些因子参与其他水平的基因表达调控作用。除了改变Dnmt的数量或活性，调控Dnmt与基因启动子的结合也是调控DNA 甲基化水平的方式。本实验室研究发现HDAC 抑制剂depsipeptide在肺癌细胞系H719 和H23、大肠癌细胞系HT-29 和胰腺癌细胞系PANC1 中对p16、SALL3、GATA4 基因有激活基因沉默的作用。Depsipeptide通过降低H3K9 的甲基化，减少DNMT1 与上述基因启动子的结合，最终导致基因沉默[29]。这些结果进一步说明Dnmt对基因沉默的影响是与组蛋白结构变化相关的，二者间存在密切的交互作用。

总之，Dnmt的基因表达调控机制是复杂的、多水平的。Dnmt参与了DNA 甲基化、组蛋白修饰和染色体重塑，组成了复杂的表观遗传调控网络，共同调控基因表达。

2 DNA 甲基转移酶的主要生物学功能

介于上述Dnmt的表达调控机制，Dnmt在多种生命现象中发挥了重要作用。下面就Dnmt

的重要生物学功能进行探讨。

2.1 DNA 甲基转移酶与肿瘤

在肿瘤细胞中，抑癌基因的不正常甲基化抑制了抑癌基因的表达，使细胞周期失控，发生癌变。很多研究都证明了DNA 甲基化异常与肿瘤发生有关。研究者们在乳腺癌、大肠癌、胃癌中发现了某些基因的高甲基化[30~32]。很多癌变组织中Dnmt的表达也是增加的[33, 34]。Dnmt的增加往往发生在DNA 甲基化之前，可能是引起DNA 甲基化异常的原因。

Dnmt的两个家族成员在以上机制中的作用是协同存在的。例如：下调DNMT3B 在直肠癌细胞中的表达只能使整体甲基化水平下降3%，下调两者却可使甲基化水平下降95%[35]。研究发现缺乏DNMT1 表达的肿瘤细胞仍伴有明显的基因组甲基化和相关基因沉默[35]。这说明Dnmt家族之间在调控肿瘤发生过程中不仅仅是互补关系，而可能是相互协同甚至相互促进的关系。

根据以上结论和推断，研究人员提出了以Dnmt为靶点治疗肿瘤的新思路。5-氮杂-2′- 脱氧胞苷（5-aza-2′-deoxycitydine, 5-Aza-CdR, Decitabine）作为一种Dnmt抑制剂，被证明有抑制肿瘤细胞的作用[36, 37]。它可以和结合在基因启动子上的Dnmt结合，抑制其对启动子的甲基化[38, 39]。5-Aza-CdR 在患有白血病、骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic syndrome, MDS）、非小细胞性肺癌（Non-small cell lung cancer, NSCLC）的病人中进行了1 期、2 期临床试验，显示了一定的抗肿瘤作用[40]。但5-Aza-CdR 存在的一些问题限制了其临床应用，如其体内半衰期短、易被胞嘧啶核苷脱氨酶失活、会引起粒细胞减少的毒副作用等[41, 42]。这些问题也使其实体瘤的治疗效果受到限制。本实验室研究发现5-Aza-CdR 可以通过增加

p21 的表达抑制细胞增殖，而这条通路是p53 依赖的[36]。这项研究对5-Aza-CdR 的临床应用具有参考价值，因为很多实体瘤细胞中p53 广泛突变，而像白血病等癌症中p53 突变少，

5-Aza-CdR 更能发挥其抗肿瘤作用。

2.2 DNA 甲基转移酶与发育

DNA 甲基转移酶在胚胎发育中起到了关键作用。Dnmt3a、Dnmt3b 在ES 细胞中表达丰度较高，成体组织中很低，ES 细胞中的Dnmt3a 和Dnmt3b 失活会干扰DNA 从头甲基化，Dnmt3b、Dnmt3a 基因突变的小鼠胚胎畸形和死亡率极高[43]。在胚胎发育的早期，Dnmt3a 和Dnmt3b 功能重叠。Dnmt1 的甲基化作用发生在植入期，并在胚胎发育过程中起到了维持甲基化的作用[43]。这说明，无论是DNA 从头甲基化还是DNA 甲基化的维持都是胚胎发育的重要环节，可能与不同组织细胞中不同基因的表达有关。另外，DNA 甲基转移酶与胚胎早期植入子宫内膜也有一定联系。有研究显示DNMT1、DNMT3A、DNMT3B 可以联合作用，调节E 钙粘素（E-cadherin）的表达，从而调节子宫内膜对胚胎的接受能力[44]。这也说明Dnmt在胚胎发育中起到的重要作用，异常的胚胎植入和流产很有可能与Dnmt的异常有关。

在神经系统的发育中，记忆的形成与DNA 甲基化的动态变化有关。一项针对大鼠海马区域的记忆形成的研究显示，与记忆形成相关的基因的甲基化水平在条件反射形成前后发生变化，Dnmt的mRNA 水平也有所改变。当使用Dnmt抑制剂后，已经甲基化的基因去甲基化，条件反射过程会减弱或消失[45]。这说明与记忆形成有关的DNA 甲基化并非长期的、稳定的，而是动态变化的，记忆形成与表观遗传学现象有密切关系。

2.3 DNA 甲基转移酶与细胞衰老

DNA 的甲基化是DNA 亚序列水平的一种遗传信息，可以传递给子代细胞。这种传递主要通过Dnmt1 维持。然而衰老的细胞会出现“DNA 甲基化漂移”。研究者们发现在很多衰老的组织和细胞中广泛存在DNA 甲基化程度降低的现象[46]。这种DNA 甲基化漂移会导致DNA 低甲基化或过甲基化。产生这两种现象的内源性机理与DNA 甲基转移酶的不正常表达有关[47]。在检测不同年龄人群的T 淋巴细胞表达DNMT1、DNMT3A 和DNMT3B 水平后，研究

人员发现DNMT3A在T 淋巴细胞中表达比较低，且不随年龄变化而变化；而DNMT1 和DNMT3B 表达很多，且随年龄升高而表达下降，这说明DNA 甲基转移酶水平下降是组织中甲基化程度下降的原因之一[48]。本实验室也发现，正常人成纤维细胞2BS，p21 启动子的甲基化随年龄变化而波动，而p21 是细胞周期相关的重要因子[49]。甲基化漂移会导致基因的沉默或过表达，使衰老的组织发生基因表达不正常，细胞周期调控机制失调。但是引起DNA 甲基转移酶水平下降的原因尚未明确。究竟是甲基化漂移引起衰老，还是衰老引起甲基化漂移，目前还不清楚。

2.4 DNA 甲基转移酶与其它疾病

DNA 甲基转移酶的突变会导致一些遗传性疾病。如“着丝点不稳定和面部异常”（Immunodeficiency centromeric instability and facial anomalies），即ICF 综合征，是由于DNMT3B 基因突变引起的。它是一种常染色体隐性遗传病，主要表现为免疫缺陷和面部异常[50]。最近有报导显示，高同型半胱氨酸血症（Hypohomocysteine, HHcy）与DNMT1 活性降低引起的DNA 低甲基化有关，而HHcy是动脉粥样硬化和冠心病的独立危险因素[51]。另外，与DNA 甲基化异常有关的疾病还有Rett综合征，是MeCP2 变异导致的[52]。

总而言之，DNA 甲基转移酶对于调控DNA 甲基化，从而调节染色质结构和基因的表达起着重要作用。它们之间既是分工合作，又可以相互协同和促进。这种调节在衰老、肿瘤、胚胎发育和其他疾病中都有所体现。对于DNA 甲基转移酶和DNA 甲基化机制的研究还有很多未知内容，但其重要生物和生理意义已经愈发凸现。完善Dnmt的研究对重大疾病的控制和治疗可能会起到重要作用。