SDS-CTAB改进方法提取细菌基因组DNA

改进SDS-CTAB方法提取细菌基因组DNA

（经济型实验室专用，可修改适合特定菌种）

具体步骤：

（1）将待检测菌株接种于37℃培养过夜；

注：以生长至对数期的细菌为最佳提取对象，因为过对数期时培养基中会积聚过度的核酸酶降解DNA。

，混合均匀、不得涡

。

。然后，加入80 μL

溶液加之

离心5 min。

离心后，转移含有核酸的上清液（水相，即上清液A）至新的2 mL离心管中。

（7）加入等体积（约800 μL上清液A中，充分混匀，15,000 rpm离心5 min。离心后，转移含有核酸的上清液（水相，即上清液B）

至新的2 mL离心管中。

（8）加入等体积（约800 μL上清液B中，充分混匀，10,000 rpm离心5 min。离心后，转移含有核酸的上清液（水相，即上清液C）至新的

2 mL离心管中。

（9）加入0.7倍体积（约560 μL上清液C以沉淀DNA，上下轻柔颠倒离心管几次，可见白色、黏样沉淀即为DNA。常温静置5~60 min后，12,000~15,000

rpm常温离心15~30 min。可见DNA团集于离心管壁边上。然后小心去除异丙

醇，避免碰到DNA团。

（10）加入500 μDNA团，再常温12,000~15,000 rpm离心15~30 min。小心除去乙醇，并用纸巾擦拭管壁边缘多余

液体。

（11）放置含DNA离心管于通风橱处风干，时间不得超过5 min。然后加入50~100 μL TE缓冲液重悬DNA，可放置37

注：此时可通过测定OD260nm来估算DNA

50 Mg/mL。DNA的纯度可通过测定A260/A

琼脂糖凝胶电泳来判断。如有约20 kb

裂，而被核酸酶降解或剪切的DNA

（12）用TE缓冲液调整DNA终浓度至

倍分装多管用于PCR。

注：13-17为DNA纯化用

（13200 μL

等体积（600 μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），

。

离心管中，加入1/10体积（50 μL）的

，混匀，-20℃放置超过30 min。

；12000 rmp，

-20℃存

溶液配制：

(1)LB液体培养基（1000 mL）

按要求称取下列药品：

酵母提取物，5g

胰蛋白胨，10g

NaCl，10g

加入800mL蒸馏水溶解，用10M NaOH调节pH至7.0，蒸馏水定容至1000mL，按需要分装；121℃高压下蒸汽灭菌20min（高压灭菌条件下同）；4℃保存备用。

(2)LB琼脂培养基（1000mL）

配方同LB液体培养基，调节pH至7.0后，加入15g琼脂粉，蒸馏水定容到1000mL，高压灭菌；趁热倾倒平板，4℃保存备用。

(3)20×TE缓冲液（500mL）

按要求称取下列药品：

Tris碱，12.1g

EDTA，3.7g

加入400mL蒸馏水溶解，用浓盐酸调节pH值至8.0，蒸馏水定容至500mL，室温贮存备用。

(4)1×TE缓冲液

用蒸馏水将上述贮存液稀释20倍，高压灭菌，室温保存备用。

(5)3M NaAc（pH 5.2, 500mL）

称取NaAc·3H2O 204.1g，400mL蒸馏水中溶解，用冰乙酸调节pH值至5.2，定容至500mL，高压灭菌，室温贮存备用。

(6)10% SDS（500mL）

称取SDS 50g，于400mL蒸馏水中溶解，必要时可加热并搅拌溶解，加水定容至500mL，高压灭菌，室温贮存备用。

(7)5M NaCl（500mL）

称取NaCl 146g，加入400mL蒸馏水溶解，定容至500mL，高压灭菌，室温贮存备用。

(8)CTAB/ NaCl 溶液（500mL）

按要求称取下列药品：

NaCl，20.4g

CTAB，50g

用400mL蒸馏水溶解，必要时可加热并搅拌溶解，定容至500mL，高压灭菌，室温贮存备用。

(9)氯仿/异戊醇（24:1, 500mL）

分别量取氯仿480mL，异戊醇20mL，混合均匀，避光，4℃贮存备用。

(10)苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）

分别量取等体积的氯仿/异戊醇（24:1）和Tris饱和酚，混合均匀，避光，4℃贮存备用，建议现配现用。

(11)50×TAE缓冲液

按要求称取下列药品：

Tris碱，242g

Na2EDTA·2H2O，37.2g

800mL蒸馏水溶解，加入冰乙酸57.1 mL，混匀，加水定容至1000mL，室温贮存备用。1×TAE缓冲液（将上述贮存液用蒸馏水稀释50倍，室温贮存备用）

(12)0.1%溴化乙锭

称取0.1g溴化乙锭，加入100mL 蒸馏水，混匀，避光，室温贮存。

(13)无菌水

取去离子超纯水，高压灭菌，贮存备用。