POD、PPO活性测定：
POD 、PPO 活性测定
试剂：磷酸缓冲液（代号PBS ）配制
A ：Na 2HPO 4?12H 2O 17.91g 加水 1000ml 定容
B ：NaH 2PO4?2H 2O 7.8g 加水 1000ml 定容 0.05mol ·l -1
PH6PBS 123mlA+877mlB 1000ml 定容即可 0.05mol ·l -1 PH7.8 915 ml A+ 85mlB 1000ml
1%PVP （聚乙烯吡咯烷酮） 10gPVP ——加PBSPH7.8——1000ml （用来提取酶液）
②愈创木酚（即0.02mol ·l -1
邻甲氧基苯酚） ③30%H 2O 2
④25mmol ·l -1
焦性没食子酸（焦培酸）
POD 反应液：
取50ml0.05mol ·l -1
PH6PBS 加入 28μl （愈创木粉）加入19μl30%H 2O 2 棕色瓶
PPO 反应液：
取50ml0.05mol ·l -1
PH6PBS 加入 100μl 焦培酸 棕色瓶
酶液提取：
称取0.5g 样品放入研钵，分三次共加8ml1%PVP 冰浴研磨 全部倒进离心管 放进离心机 4℃、10000r ·min 离心15min →取上清夜备用
（1）POD 测定：
3ml 反应液μl 酶液 混匀 A470比色 (以反应液做对照) 每一分钟记录一次
计算：POD 活性（U ·g -1
FW ·min -1
）=OD470×N 总体积/t ×n ×w ×0.01
（2）PPO 测定：
3ml 加入 100μl 酶液 混匀 30℃水中15min A420比色(以反应液做对照)
计算：PPO 活性（U ·g -1
FW ·min -1
）=OD420×N 总体积/t ×n ×w ×0.001
（反应液调零点，一个酶单位u 定义为0.001A 值变化）
POD 、PPO 、多酚氧化酶的测定
试剂：磷酸缓冲液（代号PBS ）配制
A ：Na 2HPO 4?12H 2O 17.91g 加水 1000ml 定容
B ：NaH 2PO4?2H 2O 7.8g 加水 1000ml 定容 0.05mol ·l -1
PH6PBS 123mlA+877mlB 1000ml 定容即可 1%PVP （聚乙烯吡咯烷酮） 1gPVP 100ml 定容
②愈创木酚（即0.05 mol ·l -1
邻甲氧基苯酚）:取0.6208 g 的愈创木酚定容到100ml 容量瓶摇匀即可
③0.1mol/LH2O2 5.68ml 稀释至1000ml ④25mmol ·l -1
焦性没食子酸（焦培酸）
⑤0.1mol/L 儿茶酚溶液：取0.5506克儿茶酚溶于50毫升蒸馏水中，定容摇匀即可。
POD 反应液：
取20ml0.05mol ·l -1
PH6PBS 加入10ml （愈创木酚）加入10ml30%H 2O 2 棕色瓶
PPO 反应液：
取25ml0.05mol ·l -1
PH6PBS 加入 50 l 焦培酸 棕色瓶
多酚氧化酶反应液：
取20ml0.05mol ·l -1
PH6PBS 加入 10ml 儿茶酚
测定步骤：
0.5g 烟叶 5mlPBS 冰浴研磨 12000g 离心30min 上清夜
POD 0.5ml 酶液 3ml 反应液，470nm 比色，每一分钟纪录吸光值 PPO 420nm 比色
多酚氧化酶420nm 比色，每一分钟纪录吸光值
△A 470*Vt
酶活性= 〔u/(g ·min)〕 W*V s *0.01*T
△A 470为反应时间内吸光度的变化; V t ：酶提取液总量(5ml)
V s ：测定时所取提取液的量(0.5ml)
W ：样品重量（g ） T ：反应时间（5min ）
离心管
PPO 测定
试剂：
165mmol/LPH7.0磷酸缓冲液（PBS ） 1%(w/v)PVP 60%乙醇 无水乙醇
底物：100ml 柠檬酸-磷酸缓冲液（PH6.3）加入吐温20 0.1ml ，摇匀，加入0.25ml 亚油酸（0.0075mol/L ）摇匀乳化。
测定步骤：
0.2g 烟叶 PBS PVP 研磨，匀浆，单层纱布过滤 4℃ 1000*g
离心5min 除去残渣 15000*g 离心20min ，取上清夜
0.3ml 酶液 0.7ml 底物，摇匀，30℃保温5min 2ml 无水乙醇，摇匀 3ml60%乙醇，摇匀 取1ml ，用60%乙醇稀释至10ml 234nm 比色
对照：0.3ml 酶液 70-80℃水浴加热5-10min 0.7ml 底物，摇匀，30℃保温5min
2ml 无水乙醇，摇匀 3ml60%乙醇，摇匀 取1ml ，用60%乙醇稀释至10ml 234nm 比色
酶活性（ g/FW ）=10*(OD234-OD ’234)*V/t*Vx*W
V 提取液总体积，Vx 测定时取酶液体积，t 为反应时间。
OD 不杀死酶的吸光值，OD ‘为杀死酶作对照。