芽孢杆菌的分离_鉴定及应用研究
芽孢杆菌的分离、鉴定及应用研究
孙建义 许梓荣
(农业部饲料与动物营养重点开放实验室,浙江大学饲料科学研究所,杭州 310029)
摘 要:从仔猪粪便中分离到一芽孢杆菌菌株。此菌细胞杆状,大小为1.1μm×4.2μm,革兰氏阳性,兼性厌氧,能运动,菌体中具有近中生的椭园形芽孢,芽孢囊不膨大,原生质体中含有不着色颗粒;在普通琼脂平板上菌落乳白色,不透明,边缘不整齐,呈白蜡状;在肉汤培养基中出现混浊且形成薄菌膜;在含7%NaCl肉汁培养基中生长;过氧化氢酶、V.P.反应、卵磷脂酶、淀粉水解、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、酪素水解液和酪氨酸水解液均呈阳性反应,而甲基红试验、吲哚产生试验和苯丙氨酸脱氨试验呈阴性反应;能分解葡萄糖、蔗糖和麦芽糖,不分解阿拉伯糖、木糖、甘露醇和乳糖;最适生长温度为30～37℃,最佳生长pH7.0～8.0。经鉴定,该菌株是蜡样芽孢杆菌一个菌株(Bacillus cereus BC210)。应用试验结果表明,该菌株具有促进动物生长效应。
关键词:仔猪;芽孢杆菌;分离;鉴定;应用
Study on isolation and identification of Bacillus strain BC210and its application:Sun Jianyi,Xu Z irong (K ey Laboratory o f Animal Nutrition&Feed,Ministry o f Agriculture,PRC;Feed Science Institute,Zhejiang Uni2 ver sity,Hangzhou310029)
Abstract:This paper reports strain BC210suspected to be species of the genus Bacillus is olated from piglet feaces.Cells rod2shaped,straight,1.1by4.2μm;m otile;facultative;G ram reaction positive.Heat2resistant en2 dospores formed,domininant position central,not distend sporangium distinctly.Cells grown on glucose agar con2 tain intracellular globules unstainable.Irregular margin of colonies on argar media;surface dull;opaque;cream2 white2colored.Turbidity with a dull,wrinkled,coherent pellicle in broth;growth in7%NaCl,catalase,V.P.
test,egg y olk reaction,hydrolysis of starch,citrate2salts test,NO3-to NO2-test,tyrosine decomposed and casein decomposed positive;M.R.test,Indole test,phenylalanine aminotras ferase negative;acid produced from glucose, sucrose and maltose,not from arabinose,xylose,mannitol and lactose.The optimum temperature and pH for growth are from30℃to37℃and from7.0to8.0,respectively.According to Bergeyπs Manual of Determinative Bacteriology(9th edition),it is named as Bacillus cereus BC210.Application results showed that it could pro2 m ote animal growth.
K ey w ords:Bacillus;is olation;identification;application
动物消化道内的微生态平衡,对于促进动物健康生长,增强动物消化吸收机能,提高饲料利用率都具有重要意义。近年来,抗生素作为预防药物被大量用作动物促生长剂,对畜牧业的发展起了积极的作用。然而,抗生素的过多使用,严重破坏了动物体内微生态平衡,引起菌株突变而产生耐药性,同时,抗生素在畜产品中的残留,给食品的安全性带来了威胁,从而引起了国内外学术界的高度重视。随着现代生物技术的发展,人们对
浙江农业学报Acta Agriculturae Zhejiangensis11(1):47～50,1999
收稿日期:1998-06-17
动物消化道内正常微生物进行了深入研究。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》(第9版)[1],正常微生物菌群主要分为15个属,除乳酸杆菌属、链球菌属和肠杆菌等外,还包括了需氧的芽孢杆菌属,其中乳酸菌和粪链球菌是肠道中固有的微生物,而芽孢杆菌和酵母在肠道微生物群落中散在性存在。
本文报道了从正常仔猪粪便中分离得到的芽孢杆菌BC210菌株的各种生理生化特性,并对该菌的归属进行了鉴定,对其应用效果进行了初步研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 分离菌株编号为BC210,由本研究所从仔猪粪便中分离筛选所得;标准菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)AS1.126。
1.1.2 普通琼脂培养基 牛肉膏0.5%,蛋白胨1%,NaCl0.5%,pH7.6～7.8,压力0.11 MPa灭菌20min,固体培养基加2%琼脂。1.2 方法
除特别说明外,一般形态、生理生化性状试验均参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第9版)[1]和《微生物学实验手册》[2]进行。
1.2.1 分离方法 以仔猪粪便作为分离样品,采用分离芽孢杆菌的方法在普通琼脂培养基上进行稀释涂布分离培养,挑取单个可疑菌落,对经过革兰氏染色和显微镜个体观察初步认为是芽孢杆菌者,进行单菌分离培养。
1.2.2 生理生化试验 各种生长、生理生化试验均以培养20～24h的斜面为种子。在碳源试验过程中,斜面种子在无菌条件下用不含碳源的无机盐培养基离心洗涤2次(4000rΠmin,30min),经洗涤的菌体制成菌悬液,接种于试管中,观察试验结果。
1.2.3 菌落形成观察及细胞大小的测定 将菌体经适当稀释后涂布于平板上,置37℃恒温培养24h,观察菌落形态,用显微镜观察细胞形态并测定细胞大小。
1.2.4 污染检查 各项生理生化试验均采用无污染纯培养物进行,污染检查试验方法见参考文献[3]。
1.3 鉴定
根据菌株BC210的菌体形态特征、菌落形态特征、革兰氏染色性状,有关生理生化鉴别试验,参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第9版)[1]进行属和种的鉴别。
2 结果与分析
2.1 形态特征
2.1.1 个体形态 研究结果表明,细菌BC2 10菌株呈杆状,大小为1.1μm×4.2μm,菌体中具有近中生且椭园形的芽孢,芽孢囊不膨大,菌体革兰氏染色呈阳性反应;AS1.126菌株呈杆状,大小0.9μm×
3.6μm,近中生椭园形芽孢,芽孢囊不膨大,革兰氏染色阳性,原生质中具有不着色颗粒。
2.1.2 菌落形态 BC210菌株和AS1.126菌株具有相同特征。在普通琼脂平板上,经37℃培养24h,菌落直径达5～6mm,呈乳白色,不透明,边缘不整齐,面光呈白蜡状,各菌落沿划线蔓延呈长线片状。在肉汤培养基中生长,液体混浊且具有较薄菌膜。
2.2 生理生化特性
试验结果表明,菌株BC210和AS1.126都能在葡萄糖复合琼脂上进行厌氧生长,具有运动性,且能在含7%NaCl肉汤培养基中生长,V.P.(乙酰甲基甲醇)试验呈阳性,V. P.中的pH值为5.1,柠檬酸盐利用试验、硝酸盐还原试验、卵磷脂酶反应、过氧化氢酶反应、淀粉水解试验、酪素水解试验、酪氨酸分解试验均呈阳性反应,并能抗0.001%的溶菌酶作用,甲基红试验、吲哚产生试验和苯丙氨酸脱氨试验呈阴性反应,具有分解葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的能力,不分解阿拉伯糖、乳
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糖、甘露醇和木糖。
菌株BC 210和AS 1.126的适宜生长pH 为7.0～8.0,最适生长温度为30～37℃,最高和最低生长温度分别为45℃和10℃。2.3 鉴定依据G ordom 氏分类法,将芽孢杆菌属分
为三群,都归属于《伯杰氏细菌鉴定手册》
(第9版)的第十五部分———芽孢杆菌科(Bacil 2
laceae )[1]
。芽孢杆菌属包括22个种和一些未定位的种。
菌株BC 210的个体形态特征,菌落形态特征,革兰氏染色阳性,
以及有关生理生化特性,均与蜡样芽孢杆菌标准菌株的特性相同,
而与其他芽孢杆菌具有明显差别[1]
,因而暂将该菌定名为蜡样芽孢杆菌一个菌株Bacil 2
lus cereus BC 210。
2.4 应用试验效果
对比饲养试验在嘉兴胥山养殖场进行,动物为长加断奶仔猪。设试验和对照二组,每组各29头,3个重复,试验组为在对照组饲粮中添加0.1%的干粉剂,试验期为41d ;试验组和对照组平均起始体重为14.79kg 和14.73kg ,平均末重为35.73kg 和34.54kg 。结果(图1
,2)表明,添加微生物制剂能使仔猪的日增重提高4.50%(P <0.05),料重比
图1 BC 2
10粉剂对仔猪日增重的影响
Fig .1 E ffect of BC 210powder on piglet daily gain
图2 BC 210粉剂对仔猪料重比的影响
Fig .2 E ffect of BC 210powder on feed and daily gain ra 2tio
下降4.39%(P <0.05)。
3 讨论
(1)芽孢杆菌的安全性,蜡样芽孢杆菌广泛分布于自然界,包括动物的消化道,一般不致病,但有的菌株可引起中毒。BC 210芽孢杆菌的活菌制剂饲喂仔猪和雏鸡,观察到对仔猪和雏鸡的下痢具有预防和治疗效果,同时无任何中毒症状发生,试验结果初步表明该菌株的安全性。
(2)饲用微生物制剂又称益生素(Probiot 2ics )[4]
,主要包括乳酸菌、双歧杆菌、芽孢杆菌和酵母的活菌制剂。由于乳酸菌和双歧杆菌是动物消化道内源性有益微生物,具有阻止致病菌对肠道的入侵和定植,抑制致病菌和抗感染,维持肠道菌群生态平衡,增强动物免疫力,控制毒素等作用[4]
。因而学术界普遍认为这些菌是制作益生素的理想菌株,但是乳酸菌比较脆弱,经不起常规饲料加工过程中温度和压力影响,而芽孢杆菌的芽孢具有很强的耐热性,芽孢虽处于体眠状态,却具有
较强的活性,同时还可耐胃中pH 较低的酸
性环境。瘘管仔猪研究芽孢杆菌的生长和发育试验结果发现约90%的芽孢发育,如果考
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94?孙建义等:芽孢杆菌的分离、鉴定及应用研究
虑肠道内容物的浓缩作用,回收率几乎达100%;芽孢杆菌还可引起肠道微生物组成的变化,如引起十二指肠中大肠杆菌数量显著减少,而乳酸菌含量上升。以微型猪为试验对象,结果表明,芽孢杆菌使猪粪便中大肠杆菌的数量为对照组的35%,添加芽孢杆菌可使猪内容物pH和NH
3含量下降,VFAs含量上升18%,丙酸和乙酸的含量也上升,此外,芽孢杆菌还具有多种酶活性[5]。
关于芽孢杆菌产品功效的研究表明,添加芽孢杆菌制剂可提高动物的日增重,提高饲料利用率,降低饲料成本,同时还可预防和减少下痢,至今尚无在猪饲料中添加芽孢杆菌而产生负作用的报道,因而可以认为芽孢杆菌类益生素在饲料工业上具有广泛的应用前景。
参考文献
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