反义RNA技术原理及在疾病治疗中的作用

摘要：反义RNA技术是利用反义RNA能够与特异靶RNA通过配对碱基间氢键作用而互补配对，从而在基因复制、转录和翻译3个不同水平上参与基因表达的调控，来治疗各种遗传性或病毒感染性疾病的一项技术。本文在讨论反义RNA技术的作用机制和与反义寡核苷酸技术的比较的基础上，拟概述反义RNA的作用机制、技术方法与特点、技术运用和存在的问题。相信随着对基因功能研究的广泛开展及基因治疗研究的深入，反义RNA技术必将成为一种有力的工具，在疾病治疗中起到重要的作用。

关键词:反义RNA；基因表达调控；基因治疗

反义核酸技术是继基因克隆和重组技术后分子生物学领域兴起的一种全新的技术。该技术由于其核苷酸具有与DNA意义链相同的序列且可以选择性地抑制特定基因的表达而得名。广义的反义核酸技术包括：①反义寡核苷酸技术(antisense oligonucleotides,ASOD)，即直接应用一段人工合成的寡聚核苷酸,通过碱基配对与细胞内核酸结合,特异的调节基因表达。②反义RNA技术(antisense RNA),是利用基因重组技术,构建表达载体，使其离体或在体内表达出反义的RNA。③核酶技术(ribozyme)核酶是一种可自我催化的特殊的反义RNA，能与靶序列结合并使之裂解，从而对特定基因的表达进行调控。反义RNA(antisense RNA)是一种本身缺乏编码能力，但能与特异靶RNA(主要是mRNA)互补的RNA分子，它可通过配对碱基间氢键作用与靶RNA的特定互补区域结合形成双链复合物，抑制靶RNA的功能,从而调控基因的正常表达[1]。反义RNA技术的基本原理是利用自然存在的或人工合成的反义RNA，通过基因重组技术反向插入到合适的表达载体形成重组DNA,然后转染受体细胞，则这一反向插入的序列就会随细胞周期产生大量反义RNA,对基因的表达进行调控,从而抑制、封闭或破坏靶基因的表达。选择具有明显的生物学效应的靶序列后,反义RNA即通过和相应的RNA互补而达到阻断其功能的目的。近20多年来,反义RNA技术已在病毒病、癌症、遗传性疾病等疑难疾

病的基因治疗、动植物品种的改良以及生物研究方法的改进方面取得了令人瞩目的成就。本文在讨论反义RNA技术的作用机制和与反义寡核苷酸技术的比较的基础上,拟概述反义RNA的作用机制、技术方法与特点、技术运用和存在的问题。

1反义寡核苷酸技术与反义RNA技术

1.1反义寡核苷酸技术

1978年,Zamecnik首先应用一种13个碱基的寡核苷酸抑制Rous肉瘤病毒,取得一定效果[1],此后,随着对其作用机制、特异性及药理作用等研究的深入,其应用范围不断扩大。由于ASOD的易降解性,在实验中通常要对其进行修饰,硫代反义寡核苷酸作为第一代反义寡核苷酸的代表,由于在细胞毒性、细胞吸收率等方面存在众多问题,Agrawal等设计了第二代混合骨架的反义寡核苷酸(mixed-backbone oligonucleotides ,MBO),MBO含有至少两种不同的化学修饰,在结构上可以是任意两种或多种修饰的不同排列组合。MBO 不仅保持了核酸酶抗性,而且具有很好的靶序列杂交特异性和相对较低的毒副作用[2]。近年来以2-氨基乙基甘氨酸为基本单元的多肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)由于可与互补的RNA或DNA形成稳定的PNA/DNA(RNA)杂合链并且具有较强的蛋白酶、核酸酶抗性而预示了其作为反义抑制剂的用途,被称为第三代反义核酸[3],但细胞对PNA的吸收效率较低的问题一直没有得到很好解决。并且,由于寡核苷酸的半衰期较短,有必要反复应用ASOD。事实上,以上三代寡核苷酸较高的制备成本也是妨碍其广泛应用的因素之一。同时,在反义寡核苷酸的设计上还较盲目,要设计出高效的反义寡核苷酸并非易事。相对而言,包含反义RNA的重组质粒则相当于具有生物兼容性和生物降解性的长期释放装置。

2 反义RNA作用机制

与ASOD方法相比,设计反义RNA时一般不需要目的基因的详细的调控知识,人们普遍应用由翻译起始位点延伸0.5kb～3.0 kb的片段作为重组质粒的(逆向)插入序列。而全长的cDNA序列一般认为没有必要,尤其当目的基因较长时。另外,互补于3′端非翻

译的序列也往往具有很好效果[4]。在真核生物中,一般认为对应5′非编码区的反义RNA优于针对编码区的反义RNA。包含反义核酸的重组质粒在细胞内转录出反义mRNA,发挥抑制基因表达的作用。目前,具体的作用机制尚不甚清楚,人们推测可能有: 反义RNA的作用机制主要表现在DNA复制、转录和翻译3个水平上。

2.1DNA复制中的作用

反义RNA作为DNA复制的抑制因子,与引物RNA结合或作用于引物前体而抑制DNA 复制,从而降低DNA的复制效率。E.coli的colE1质粒复制的前提是合成适当的RNA(RNA Ⅱ),它自动折叠后与DNA模板结合形成DNA复制的引物,从复制起始点上游—445bp 处开始,以另一DNA为模板反向转录的RNAⅠ正好与RNAⅡ的结合,阻止了正常引物的产生,从而干扰复制的进行。

2.2转录及转录后水平的作用

反义RNA与mRNA 5′末端互补结合,阻断帽子结构形成;作用于外显子和内含子的连接区,阻碍前mRNA剪接;作用于polyA形成位点,阻碍mR-NA的成熟及其向胞浆转运。在crp基因的ticRNA(transcription inhibitory complementary RNA)负向自我调控中,ticRNA 与crp mRNA的5′端结合,形成类似于RNA聚合酶识别的转录终止信号的二级结构,以反式作用对转录过程本身进行调控[5]。

2.3翻译水平的作用

反义RNA可直接与mRNA的SD序列(含RBS)或编码区(主要是AUG)结合,从空间上直接阻止核糖体的正常结合或可直接降解靶mRNA。反义RNA与mRNA在SD序列配对形成吻触复合体或在互补区段结合形成RNA- RNA双链结构,从而调控翻译的进行。在真核生物细胞中有许多RNA在翻译水平上表现反义RNA的功能。如鸡胚胎肌浆中存在的富含U的小分子RNA称为tcR-NA,它们可以与肌球蛋白重链的RNA的polyA尾杂交而抑制正常的翻译过程。Audrey等[6]的研究表明FGF- AS RNA在翻译过程能有效地抑制FGF- 2在哺乳动物细胞中的表达。

反义RNA的重组DNA中只有启动子及终止子,当转染细胞后,重组DNA能自动表达反义RNA,并且重组DNA自身可以整合到宿主的基因组DNA中,或作为“附加体”长期存在。在原核细胞中,反义RNA以针对SD序列效果最好,而在真核细胞中以5′端非编码区为标靶最有效。

3 反义RNA技术方法

3.1反义表达载体的构建

一般应用RT-PCR技术克隆出部分目的cDNA,并在两端加上限制性酶切位点倒向插入真核表达载体中,载体一般要含有下游的polyA尾以保证转录产物的稳定。为确定插入方向可应用限制性内切酶酶切或直接测序,曹国栋等人曾介绍一种PCR鉴定重组体DNA插入方向及转染的方法[7],可有效解决酶切困难或无适当位点可供选择的问题。

下面是一些常用的真核表达载体:应用较广的是含SV40(simian virus 40)、RSV(Rous sarcoma virus)或CMV (cytomegalovirus)的启动子/增强子的质粒载体。尤其CMV的早期启动子/增强子元件可有效的应用于各种人及鼠源的肿瘤细胞系。含EBV(Epstein-Barrvirus)复制起点的载体,可编码核抗原(EBV nuclear antigen),可以以“附加体”形式在细胞中复制,避免了整合入染色体基因组所带来的位置效应。在应用反义RNA 技术研究原癌基因在细胞生长、分化及凋亡的调控机制时,人们发现反义RNA对一些原癌基因表达抑制的同时抑制了细胞的生长,从而不利于转化子的筛选[8]。一种解决办法是选择可诱导型的表达载体,使得筛选后在诱导物的诱导作用下表达出反义RNA并发挥反义作用。1982年,Karin等构建含金属硫蛋白-Ⅱ型(MT-Ⅱ)启动子的可诱导型载体,在适当诱导条件下(如Zn2+、Cd2+等)才能启动下游基因的转录[9]。应用此类载体进行转染已取得良好效果。构建此类载体时要注意的是诱导物对生物体可能产生的生物学效应,尤其是毒副作用。近年来出现了一类高效且诱导剂生物效应较小的双载体系统,如pVgRXR/pIND(Invitrogen),pTet/pTRE (Clontech),其原理是第一种质粒能够表达能与诱导剂结合的蛋白,细胞在稳定转染了第一种质粒后,再转染第二种含目的基因片段或反义片

段的质粒,而第二种质粒的表达受控于能被第一种质粒所表达的蛋白所激活的转录启动子。pTet/pTRE载体系统已成功地应用于细胞培养及转基因小鼠[10]。但对于某些细胞系,四环素结合蛋白的高表达对其有一定的毒副作用。

3.2基因的导入(转染)

磷酸钙法、电转法、基因枪是体外实验中DNA转染真核细胞的常用方法。脂质体不仅常用于体外实验中载体DNA对细胞系的转染,也用于体内实验中的转染过程。脂质体能提高分裂细胞和非分裂细胞对核酸的摄取,并保护其不被降解。优点是操作简单,细胞吸收较好。缺点是包埋的DNA量不确定,体内实验中发现在特定组织如肝脏吸收的倾向性,及对某些组织如脑有一定毒性。在此基础上人们逐渐开发出具有一定良好特性的转染试剂如pH-敏-脂质体。各类受体介导的转染试剂往往使转染更接近自然的生理过程(如基于转铁蛋白受体介导的核酸转染试剂),不仅可能降低毒副作用还可因受体的特异分布而具有转染的组织或细胞特异性。另一种转化策略是以病毒作为载体,同时利用了病毒的转染特性。rAAV-AS(AAV, adeno-associated virus,腺病毒辅助性病毒)以其安全、高效而广泛应用于反义RNA技术及基因治疗。它几乎可以转染所有哺乳动物,但对其他动物,如家禽,目前尚未建立起其AAV系;并且,由于它的转染是细胞膜上受体介导的,哺乳动物的AAV不能用于家禽的转染[11]。逆转录病毒在快速分裂的细胞中转染效率也相当高,这使它常被作为载体应用于肿瘤的治疗中,它可应用于哺乳动物及禽类。其不足是它只在快速分裂的细胞中起作用,这使它的应用范围受到一定限制[11]。一般认为体内的转染需要借助基因的导入系统(gene deliver system),Wolff和Malone等人于1990年用表达β-gal及荧光酶基因的质粒分别对小鼠肌肉进行直接体内注射,在注射区域的肌细胞检测到该基因的表达[12]。直接注射法仅对骨骼肌细胞有效,人们推测可能与骨骼肌的多细胞核、存在胞环流等结构特性有关。为检验转染效率,人们往往选用β-gal或pEGFP等报道基因。

3.3检验、结果分析

在以反义RNA表达载体进行细胞系的转染或体内实验时,应设置空载体转染的对照实验,以排除外源载体DNA的导入带来的生物学或免疫学效应。体外实验中基因产物的活性、细胞的增殖、分化等生物学参数,体内实验中动物本身的一些生物学表型的改变均是不可忽略的重要指标。在此基础上分子生物学水平的分析主要有以下几个方面:除了以正义探针检验反义RNA的表达情况外,我们更关心的是靶基因的表达情况。应用进行中的核转录分析(nuclear run on transcription assay)能够较可靠的测定基因转录活性。对mRNA水平的检验方法除了Northern印迹,RNA保护试验(RNase protection assay)灵敏度更高,并且可以进行较准确的定量分析。由于目前反义RNA抑制靶基因表达的原理尚在研究之中,而反义RNA抑制靶基因表达的过程中并不一定伴随着mRNA水平的降低[13],所以检测反义抑制效果的较为客观的标准是相应蛋白水平的变化。Western印迹,ELISA,流式细胞分析法(flow cytometry)均是常用的分析技术。免疫组化技术、免疫荧光技术由于不能很好的定量而一般避免使用。

4 反义RNA技术的特点

4.1特异性强

反义RNA在宿主细胞内可以特异性地识别、关闭某一基因,阻断靶基因的表达,甚至可以选择性地抑制单一启动子控制的多基因区内某一基因的表达,而不影响其它基因的表达[14]。

4.2操作简便,靶mRNA范围广

可以大量地设计合成反义RNA(或反义RNA片段),仅需要知道病毒、基因或病变细胞的序列信息及其编码蛋白的功能。多个反义RNA可同时封闭多个基因,在核内和胞浆中都能发挥作用,用于治疗多种疾病。

4.3安全性好

反义RNA只与特定的mRNA结合,不会因改变基因结构而引起突变,在剂量多的情况

下可以被RNase水解。与合成药物相比,副作用较小。而且将含有反义RNA基因的载体引入原代细胞,可形成持续稳定的感染细胞系,使后代具有遗传的抗病毒或抗病特性。

5反义RNA技术的应用

反义RNA技术已可用来治疗由基因突变或过度表达导致的疾病和严重感染性疾病。

5.1抗癌作用

从癌组织中分离出mRNA,合成相应的反义RNA。将反义RNA引入癌细胞阻止癌基因的表达,抑制癌蛋白的产生,从而可控制细胞的恶性增殖。桑建利等[15]利用构建了的细胞周期蛋白E反义RNA真核载体转入人乳腺癌细胞时,也发现癌细胞成集落能力显著下降。Steiner等[16]在反转录病毒载体上构建了包括起始位点在内的750bp的反义RNA,经PA317包装成反转录病毒皮下注入,发现能抑制裸鼠DN145移植瘤生长94.5%,其中2只小鼠肿瘤消失。Keiichiro等[17]采用反义RNA阻断龋齿类动物和人类肿瘤细胞的表型结构形成中,把载有反义RNA的质粒转染入人的乳头状瘤病毒(HPV)阴性C33细胞、HPV- 16阳性SiHa细胞和HPV- 18阳性HeLa细胞S3中进行反转克隆。发现反义的克隆形成的集落数明显少于野生型克隆的集落数。此结果表明用反义RNA能够很强地阻断裸鼠中致癌性细胞。Volker等[18]的研究结果同样也证明了反义RNA能够有效阻断HeLa细胞中的基因表达。另有研究表明反义RNA可以通过阻止组织蛋白酶- L的表达进而降低恶性的肿瘤发生能力[19]。综上可见,反义RNA可以特异性地抑制癌基因的异常表达或抑制肿瘤癌细胞特异蛋白质的表达,诱导肿瘤癌细胞调亡,因而可应用于癌症的发病机制和治疗研究。

5.2抗病毒的研究

在治疗病毒性感染疾病上,由于病毒核酸的序列比较明确,易于人工合成相应的反义寡聚核苷酸,来抑制病毒基因的表达。反义RNA技术已用于抑制乙肝病毒(HBV)、疱疹病毒(HIV)、AIDS病毒等病毒的研究。Morgan等(1996)的研究表明HIV的反式激活蛋白反应顺序(TAR)与TAT蛋白结合可促进HIV转录,当用反义TAR封闭TAR时,即可终止HIV

的转录。姚志强等[20]针对不同靶位设计了10段互补反义核酸(DNA片段),经模型筛选发现针对S基因起始区、SP2增强子帽区和polyA信号编码区的asONs作用最强,揭示反调节基因转录/翻译起始区的反义核酸具有明显的抗病毒作用。Gabor等(1998)使用内源性表达抗HIV- 1的pol.vif和enr基因,以及3′- LTR序列的反义RNA方案,构建了MuLVLTR 启动子逆转录病毒重组质粒,转录CD4+淋巴细胞系,结果表明反义RNA能高效地稳定表达,反义envRNA能够最有效地抑制HIV- 1的复制,并且反义polRNA使P24抗原减少了100- 1000倍。Carol等[21]的研究表明,反义RNA能有效地阻断La Crosse病毒(LCV),并且来自dengne Viruses区的反义RNA更能有效阻止同源病毒的复制,且阻断时间和最小片段的反义RNA都能确定,它可以弥补接种等传统方法存在的不易达到阻止效果和效率较低的缺点。反义RNA还用于研究甲型流感病毒(AIV)及乳头瘤病毒(HPV)[17]复制及基因表达的抑制。另外,国内外在应用反义RNA技术培育抗病(如猪瘟、抗鸡马立克氏病等)动物品系方面也取得比较明显的进展。

5.3在其它方面的研究

反义RNA技术还可用于肠道疾病(Rotbart etal.,1988)、心血管疾病[22]、β-地中海贫血[23]、调节衰弱心脏中肌细胞的Ca2+泵体内平衡[24]、G蛋白防止高血压、肝纤维化等多种疾病的研究[25]。Don-ald等[26]的研究发现恶性疟原虫的clag9基因对CD36细胞的粘链是必不可少的,而将clag9的反义RNA结构导入3D7克隆中进行培养,发现粘链的C32黑素瘤细胞比原始型少15折叠,由此反义RNA也可用于疟疾的转染治疗。Agnes 等[27]在对高加索人中的一种常染色体隐性疾病(遗传性血色素沉着)研究中发现,它是由HFE基因编码MHC分子而造成的,HFE基因的5'端调节其表达,采用无开放阅读框的HFE的反义RNA导入细胞内,发现反义RNA在所有试验的组织和细胞中都得到表达,显著地抑制了HFE基因的表达。

6反义RNA技术应用中的问题

反义RNA技术的研究尚处于初级阶段,但迄今的研究结果表明,该技术作为具有高

度专一性的基因表达的反义抑制剂是很有希望的。在基础研究方面,反义RNA技术不仅用于基因分析,还可用来制备C-缩短的多肽,以研究蛋白质结构活性关系而无须使基因变异;研究细胞信号传导、细胞分化及癌变的发生、发展过程等等。在应用研究方面,反义RNA药物可以特异性的抑制癌基因的异常表达或抑制肿瘤细胞特异蛋白质的表达,诱导肿瘤细胞凋亡;在抗病原微生物感染方面,针对其特异基因的反义核酸可较好的阻止其对人体的侵害,反义核酸技术用于抗癌、抗病毒的基因疗法方面已有大量报道,包括对HIV、HSV等的防治。其他方面,如防治高血压、肝纤维化等多种疾病。人们正在发掘更广泛的应用领域。但反义RNA技术也存在一些问题，下面就是主要的问题。

6.1反义RNA片段的特异性问题

多少长度的反义RNA片段才能最有效地结合靶mRNA;对于不同种属、不同的组织和器官的病变细胞,分别需要设计多少长度的高效反义RNA片段;对应的是5'端还是3'端;是编码区还是非编码区等问题都需进一步研究,以达到特异性的抑制效果。动物体某一器官、组织或系统中细胞发生病变往往是个体特定基因的失控或有害基因表达造成的,在基因治疗时,必须针对病变的特殊细胞,而对其它细胞影响较小为佳,甚至无影响。因此反义RNA的基因治疗必需特异性、专一性地转移到病变细胞抑制其表达,只有这样才能最有效地发挥作用。

6.2制备反义RNA的费用和使用效率的问题

应用Qβ复制酶、体外转录等技术合成反义RNA,耗资较大。随着科技的发展,准确地合成所需反义RNA的技术一定能得到完善和提高。目前,已经在体外合成反义RNA,直接作用于培养细胞,反义RNA在细胞中转录而发挥作用。还有就是构建一些转录特异反义RNA的重组DNA,将这些重组DNA转化细胞,让其在细胞中转录反义RNA而发挥作用。但反义RNA的碱基序列、反义RNA中无效的长度、含量、靶序列结合部位和反义RNA的浓度等也都影响到使用效率。而且反义RNA和靶mRNA的发卡、内部环等二级或三级结构以及复杂的环环结构都影响反义抑制效率[28～30]。

7结语

经过近20年的研究,反义RNA技术已得到逐步完善并开始应用到医疗实践中。目前对反义RNA的转染效率、特异性及治疗时反义RNA的用量、持续时间和进入机体的有效途径等都进行了量的研究。采用反义RNA表达载体和受体介导能进一步提高反义RNA的特异性;脂质体和含有核酶的嵌合性运送反义RNA;核内反义RNA作为治疗因子避免了在细胞浆需抑制极其巨大数量的靶RNA则提高了抑制率,减少了反义RNA用量,扩宽了抑制治疗范围;在体内可诱导性调控序列的嵌入则更加提高了反义RNA技术的应用。在人类基因组计划完成,后基因组计划已渐进开展的基础上,反义RNA技术将不断改进和发展,并将在基因的鉴定克隆和各种疾病的治疗上发挥重大的作用。

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