铜藻纤维素酶解条件的初步研究
本科毕业论文
( 2012届)
题目：铜藻纤维素酶解条件的初步研究
学院：生命与环境科学学院
专业：生物技术
班级：08生技一
姓名：叶伟芬
学号：0811*******
指导老师：周峙苗
完成日期：_____________________________
(注：本页面要求用彩色卡纸或70克的铜板纸做封面，字体要求用电脑打印，颜色由各学院统一)
铜藻纤维素酶解条件的初步研究
作者：叶伟芬指导老师：周峙苗
(温州大学生命与环境科学学院，浙江温州，325027)
摘要：纤维素的酶解与纤维素酶的用量、酶解液温度、pH以及酶解时间等因素有关，本研究以铜藻为原料进行纤维素酶解条件的初步研究，以纤维素降解后还原糖的含量为指标，考察了纤维素酶的用量、酶解液温度、 pH以及酶解时间等四个因素对铜藻纤维素酶解的影响。在以上四个单因素实验的基础上，通过正交试验对上述四个酶解条件进行优化，结果显示：在纤维素酶用量为100万U/g、酶解液温度为50℃、 pH为4.5和酶解时间2.0h条件下的铜藻的纤维素酶解效率最高，其酶解液中的还原糖含量为0.767mg/ml。
关键词：铜藻、纤维素、酶解
Preliminary Study On The Conditions of Cellulose Enzymolysis of Sargassum horneri
Ye Weifen Zhou Shimiao
(College of Life and Environment Science ,Wenzhou
University,Wenzhou,Zhejiang,325027)
Abstract :The efficiency of Cellulose enzyme is related to the dosage of cellulose enzyme , temperature, pH and the time of enzymolysis,etal. The Conditions of Cellulose Enzymolysis was studied on the dosage of cellulose enzyme, temperature, pH and the time of enzymolysis, using Sargassum horneri as material and the content of reducing sugar after cellulose enzymolysis as inspection index. Based on the experiment of single factor, orthogonal experiment was taken to optimize the four conditions of cellulose enzymolysis. It was apparent that the effect of cellulose enzymolysis is the optimum under the conditions of 1 million U/g for cellulose enzyme dosage, 50℃,pH4.5 and 2.0 h for enzymolysis, in which the content of reducing sugar after cellulose enzymolysis is 0.767mg/ml.
Key words: Sargassum horneri、Cellulose、Enzymolysis
前言
纤维素（Cellulose）是一种广泛存在的可再生资源，它是地球上最丰富的多糖化合物，是植物细胞壁的主要成分，其含量可高达植物干重的55％，有研究资料显示，地球上的绿色植物每年进行光合作用可生成4．5×1010吨左右的纤维素[1]。纤维素是葡萄糖分子通过β-1,4-糖苷键连接而形成的葡聚糖，天然纤维素以直链式结构存在, 键与键之间有一定的晶状结构和排列次序较差的无定形结构许多纤维素分子以定形或无定形方式组合成微原纤维, 许多微原纤维集束成微纤维, 微纤维穿插于填充性物质之中[2]。纤维素属于大分子多糖, 分子量可达数十万甚
至数百万, 不能为微生物细胞直接利用, 而是需要通过纤维素酶进行降解, 再被微生物吸收
利用[3]。纤维素酶（Cellulase）于1906年在蜗牛的消化道中被首次发现，而后自1954年开始，美国的Natick 实验室就已着手研究军用纤维素材料微生物降解的防护问题[4]。在后来的研究中人们发现纤维素经微生物降解后,可产生经济、丰富的生产原料，于是纤维素酶得到了广泛的关注。目前利用纤维素酶水解纤维素的方法因其酶解速度较慢，并且受到纤维素酶用量、酶解温度、pH值、酶解时间等多种因素的影响，使得目前纤维素酶对纤维素降解效率较低，从而使纤维素酶降解纤维素的工业化应用无法实现规模化[5]。
目前，研究最多的生物可降解纤维主要有海藻纤维、聚乳酸纤维、Loycell纤维、牛奶纤维、甲壳质与壳聚糖纤维、合成蜘蛛丝纤维等。海藻纤维的原料来自天然海藻，产品具有良好的生物相容性、可降解吸收性等特殊功能，属可再生资源，是一种良好的环境友好材料[6]。
海藻纤维属硫酸多糖或酸性多糖之类的物质，除具有食用功能外，有些还具有抗癌活性。褐藻的褐藻糖是海藻的抗肿瘤及抗凝血活性成分中研究得最多的一种化合物，此单糖可抗肿瘤及延长小老鼠寿命；许多种褐藻，如裙带菜及马尾藻的褐藻聚糖，同样能抑制肿瘤及增强老鼠的免疫抗体机能；褐藻酸是褐藻细胞壁的主要成分，其抗癌活性，和所含的甘露糖醛酸及古罗糖醛酸成分有关[7]。
铜藻Sargassum horneri( Turn.) Ag, 又称竹茜菜、丁香屋, 属于褐藻的一种。铜藻藻体呈黄褐色，广泛分布于我国沿海地区，浙江沿海地带的铜藻为其优势种，主要产于嵊山、中街山、渔山、韭山、大陈和南麂等，资源丰富[8]。铜藻是藻胶工业的重要原料，在食品、有机肥料、医学以及饲料等方面具有广泛应用，因而具有较高的商品价值[9]。本课题采用铜藻为材料，采用单因素实验和多因素正交实验方法，以纤维素降解后还原糖含量作为主要考察指标，对纤维素酶解的条件进行初步研究，获得最佳的工艺参数，为铜藻的开发利用提供基础数据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1原料：铜藻：取自浙江温州南麂。铜藻经清洗干净后置于恒温干燥箱内70o C下烘干，再放入组织绞碎机内进行粉碎。预处理后的铜藻常温下保存待用。
1.1.2 试剂：纤维素酶：140万U/g，甘肃华羚生物科技有限公司生产, 醋酸，醋酸钠，葡萄糖，3，5-二硝基水杨酸，氢氧化钠，四水酒石酸钾钠，无水亚硫酸钠，苯酚均为分析纯。
1.1.3 仪器设备：
722可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司生产）、组织绞碎机、台式离心机（TDL-60B 型、上海安亭科学仪器厂）、pH酸度计、电子天平（北京赛多利仪器系统有限公司）、微电脑智能化控制恒温干燥箱（101-2型、宁波莱福科技有限公司）、恒温培养振荡器（ZHWY-2102型、上海智城分析仪器制造有限公司）
1.2方法
1.2.1 1％DNS试剂的配制
称取3，5-二硝基水杨酸3.15 g，加水500 mL，搅拌5 s，水浴至45 ℃。然后逐步加入100 mL 0.2g/ mL的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌。直到溶液清澈透明(注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃)。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0 g、苯酚2.50 g和无水亚硫酸钠2.50 g。继续45 ℃水浴加热，同时补加水300 mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000 mL。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后方可使用[10]。
1.2.2葡萄糖标准曲线的绘制
准确称取1.000g经预先烘干的葡萄糖，将其溶解在适量水中，然后转移至容量瓶定容至1L，制得1mg/ mL葡萄糖标准溶液。吸取1mg/ mL葡萄糖标准溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL于试管中，补水至2 mL，分别加入3 mL 的1％DNS试剂。充分混匀后置于100℃恒温水浴保温5min，之后立即用流动水进行冷却。最后加蒸馏水稀释至25mL。充分混匀后，于550nm处测吸光度。
1.2.3酶解液中还原糖含量的测定
纤维素酶解结束后，将锥形瓶放入沸水中水浴加热5min以灭酶活（灭酶活的时间不能过长，防止酶解液因受热过久引起颜色的变化而影响实验结果），将酶解液离心，取上清液和对照(蒸馏水)各2mL，分别加入3 mL的1％DNS试剂，沸水浴煮沸5分钟显色，冷却后用蒸馏水稀释至25 mL，充分混匀后用分光光度计在550nm比色，以对照液调零点，测得吸光度。对照葡萄糖标准曲线计算酶解液中的还原糖含量。
1.2.3单因素实验
1.2.3.1纤维素酶的用量对酶解效果的影响
在五个锥形瓶中准确加入2.0g经粉碎预处理的铜藻，分别称取一定量的纤维素酶使其加入20ml Hac-NaAc 缓冲液后的的浓度分别为70万U/g、80万U/g、90万U/g、100万U/g和110万U/g，混合均匀，调节酶解液pH至5.0，用保鲜膜封住瓶口以防止酶解过程中水分的蒸
发，然后将锥形瓶置于温度为55℃恒温培养振荡器内振荡酶解1.5h。
1.2.3.2酶解液温度对酶解效果的影响
在五个锥形瓶中准确加入 2.0g经粉碎预处理的铜藻，称取一定量的纤维素酶使其加入20ml Hac-NaAc 缓冲液后的的浓度为100万U/g，混合均匀，调节酶解液pH至5.0，用保鲜膜封住瓶口，然后将锥形瓶分别置于温度为40℃、45℃、50℃、55℃和60℃的恒温培养振荡器内振荡酶解1.5h。
1.2.3.3溶液pH对酶解效果的影响
在五个锥形瓶中准确加入 2.0g经粉碎预处理的铜藻，称取一定量的纤维素酶使其加入20ml Hac-NaAc 缓冲液后的的浓度为100万U/g，混合均匀，分别调节酶解液pH至3.5，4.0,4.5，5.0和5.5，用保鲜膜封住瓶口，然后将锥形瓶置于温度为55℃的恒温培养振荡器内振荡酶解1.5h。
1.2.3.4酶解时间对酶解效果的影响
在五个锥形瓶中准确加入 2.0g经粉碎预处理的铜藻，称取一定量的纤维素酶使其加入20ml Hac-NaAc 缓冲液后的的浓度为100万U/g，混合均匀，调节酶解液pH至5.0，用保鲜膜封住瓶口，然后将锥形瓶置于温度为55℃的恒温培养振荡器内振荡酶解，酶解时间分别为0.5h，1.0h，1.5h，2.0h和2.5h。
上述各单因素实验均进行三次平行实验，每次酶解结束后需测量酶解液中的还原糖含量，并计算平均值。
1.2.4正交试验
在单因素实验的基础上，以纤维素酶用量(A)、酶解液温度 (B)、pH (C)、酶解时间(D) 四因素各三个水平，按L9 (34 )正交表[11]，对铜藻纤维素酶酶解的条件进行优化，试验因素与水平如表 1 所示。
表1 正交实验因素与水平表
Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment
纤维素酶用量（万U/g）温度(o C) pH 酶解时间(h) 水平
A B C D
1 90 45 4.5 1.5
2 100 50 5.0 2.0
3 110 55 5.5 2.5
2. 实验结果及分析
2.1葡萄糖标准曲线绘制
以光吸收值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。结果如图1 所示。
图1 葡萄糖标准曲线
Figure 1. The Standard Curve of Glucose
由图1显示的相关系数R2=0.9983可知，葡萄糖浓度在0—1mg/mL的范围内，与吸光度呈较好的直线关系，可为下面的单因素实验和正交实验过程中的还原糖含量的测定提供可靠的参考标准。
2.2单因素实验
2.2.1纤维素酶的用量对酶解效果的影响
纤维素酶作为催化剂，其用量的大小对纤维素的酶解过程起重要影响。一般而言，酶解反应速率随纤维素酶用量增加而增大。但出于经济效益以及酶用量对底物浓度造成一定的影响等方面的考虑，研究酶用量对酶解的影响就显得尤为重要。实验结果如图2所示。
图 2 纤维素酶用量对酶解效果的影响
Figure 2. The Effect of Enzymolysis on the Dosage of Cellulose Enzyme 从图 2 可以看出，随着纤维素酶用量的增加，酶解液中的还原糖含量呈上升趋势，这意味着酶解效率与纤维素酶用量是正相关。100万U/g的纤维素酶用量情况下测得的还原糖含量为0.738mg/mL,比90万U/g增加约60%，而100-110万U/g的增幅仅为7.3%；另外，实验过程中，纤维素酶用量的增加可能会对实验结果造成一定的影响，并增加成本投入。综上所述，纤维素酶的用量选取100万U/g较为适宜。
2.2.2 酶解液温度对酶解效果的影响
酶的催化作用受温度的影响很大，一方面与一般化学反应一样，提高温度可以增加酶促反应的速度，最后反应速度达到最大值。另一方面酶的化学本质是蛋白质，温度过高可引起蛋白质变性，导致酶的失活。因此，反应速度达到最大值以后，随着温度的升高，反应速度反而逐渐下降，以至完全停止反应。反应速度达到最大值时的温度称为某种酶作用的最适温度。高于或低于最适温度时，反应速度逐渐降低。大多数植物酶的最适温度为50℃～60℃[12]。不同温度对铜藻纤维素酶解影响的实验结果如图 3 所示。
图 3 酶解液温度对酶解效果的影响
Figure 3. The Effect of Enzymolysis on Temperature 由图 3可知，纤维素酶解过程受温度的影响明显。在40℃～55℃温度范围内，随着温度的升高，酶解液中的还原糖含量呈上升趋势，当温度达到55℃时，酶解效率达到最大，此时酶解液还原糖含量为0.758mg/mL，当温度超过55℃时，酶解效率则呈明显下降趋势。该实验结果符合上述内容：大多数植物酶的最适温度为50℃～60℃。综上所述，在铜藻纤维素酶解过程中，酶解液最适温度为55℃，使纤维素酶得以发挥最大活性。
2.2.3 溶液pH值对酶解效果的影响
酶的生物学特征之一是它对酸碱的敏感性，这表现在酶的活性和稳定性易受环境pH的影响。pH 值对纤维素酶的活性影响极大。通常各种酶只在一定的pH范围内才表现出活性，同一种酶在不同的pH值下所表现的活性不同，与温度效应类似，酶在最适pH 值条件下，其活性表现出最大，此时的pH值称为酶的最适pH。各种酶在特定条件下都有它各自的最适pH。不同种类的纤维素酶的最适pH 也不一样，一般在4.0～5.5 之间。不同 pH对酶解得率的影响结果如图 4 所示。
图 4 溶液pH对酶解效果的影响
Figure 4. The Effect of Enzymolysis on pH
由图4可知， pH 小于4.5 时，酶解效率随pH的上升而增大，当pH 处于 4.5到 5.5之间时，酶解效率渐趋平稳下降趋势。这与多数文献资料报道的纤维素酶最适宜pH为4.5相符[13]。因而确定最佳pH为4.5。
2.2.4 酶解时间对酶解效果的影响
一般而言，随着酶解时间的延长，纤维素酶解得率呈上升趋势。但由于酶的稳定性较差，因而不同的时间段纤维素酶的效率不同。实验结果如图 5 所示。
图 5 酶解时间对酶解效果的影响
Figure 5.The Effect of Enzymolysis on Enzymatic Hydrolysis Time
由图 5可以看出，随着酶解时间的延长，还原糖的产生量逐渐增加，即纤维素被酶水解程度逐渐提高。但在0.5—1.0h的时间范围内，酶解速率上升相对较快，酶解1.0h的时候还原糖的含量比0.5h时提高了37.5%。当超过1.0h之后，随着产物的增多，酶解得率的上升趋势逐渐平缓，酶解2.5h的还原糖得率仅比酶解2.0h的提高了2.3%。有研究表明，出现这个现象的原因是产物对酶解反应具有一定的抑制作用。随着反应时间的延长，抑制作用逐渐增强[14]。为获得较高的酶解得率，确定2h为最佳的酶解时间。
2.3 正交试验
结果如表6所示。
表6 正交实验结果
试验序号
因素
吸光度
还原糖浓度
（mg/ml）
A B C D
酶用量（万U/g）温度(o C) pH 酶解时间(h)
1 1 1 1 1
0.254 0.694 2 1 2 2 2
0.286 0.779 3 1 3 3 3
0.224 0.614 4 2 1 2 3
0.232 0.635 5 2 2 3 1
0.282 0.768 6 2 3 1 2
0.276 0.752 7 3 1 3 2
0.232 0.635 8 3 2 1 3
0.268 0.731 9 3 3 2 1
0.256 0.699 K1 2.087 1.982 2.177 2.161
K2 2.155 2.278 2.113 2.166
K3 2.065 2.065 2.017 1.826
k10.6960.6610.7260.720
k20.7180.7590.7040.722
K30.6880.6880.6720.609
极差
R
0.030 0.098 0.054 0.113
由表6可知，极差D＞B＞C＞A，由此可见影响酶解的四个因素中首先是酶解时间，然后依次是酶解液温度，pH，纤维素酶用量对酶解效果影响最小。根据表6中各项因素的K值，可确定铜藻纤维素酶解的最优组合条件为A2B2C1D2，即：纤维素酶用量100万U/g，酶解液温度50℃，pH4.5，酶解时间2.0h。
2.4 验证实验
将优化获得的工艺条件与正交实验中获得结果最好的第2组条件进行验证实验，结果如表7所示。
表7 验证实验
序号
纤维素酶用量
（万U/g）温度(o C) pH 酶解时间(h) 吸光度
还原糖浓度
（mg/mL）
1 90 50 5.0 2.0 0.277 0.754
2 100 50 4.5 2.0 0.281 0.767
结果表明，优化条件下的酶解效率比正交实验第2组中的条件高出1.7%，因而确定优化得到的最佳组合条件：纤维素酶用量100万U/g，酶解液温度50℃, pH4.5，酶解时间2.0h为铜藻纤维素酶解的最优条件。
3.结论
纤维素酶对铜藻纤维素具有一定的降解作用，其降解效率与纤维素酶的用量、酶解液温度、pH以及酶解时间等因素有关，通过正交实验法优化得到铜藻纤维素酶解的最佳条件为: 纤维素酶用量100万U/g，酶解液温度50℃,酶解液pH4.5，酶解时间2.0h。在本工艺条件下铜藻纤维素酶解液中的还原糖含量为0.767mg/mL。
结束语
我国海藻资源极其丰富，充分开发并利用这些自然资源对于我国发展海洋事业、保护生态环境都有很重要的意义。另一方面食品工业是我国的一个重要支柱行业，海藻酸钠等海藻纤维作为重要的天然食品添加剂，具有性质优良、无毒无味等特点，具有广阔的开发前景[15]。
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致谢：
历时将近半年的时间终于将这篇论文写完，在完成此篇论文的过程中，尤其要感谢我的指导老师周峙苗老师，感谢他在实验和论文修改过程中给予我悉心的指导和无私的帮助。另外，在前期查找文献资料的时候，已毕业的学长学姐们也给我提供了很多方面的支持与帮助。在此向帮助和指导过我的各位老师和学友表示最衷心的感谢！
感谢这篇论文所涉及到的各位学者。本文引用了数位学者的研究文献，如果没有各位学
者的研究成果的帮助和启发，我将很难完成本篇论文的写作。
感谢我的同学和朋友，在我完成论文的过程中给予我了很多技术上的支持和精神上的鼓励，还在论文的撰写和排版过程中提供热情的帮助。
由于我的学术水平有限，所写论文难免有不足之处，恳请各位老师批评和指正！