大叶白蜡树种子中植物多酚及色素的研究
最有效的多糖多酚植物RNA提取方法
华越洋多糖多酚植物RNA提取试剂盒 （Quick RNA isolation Kit) 由于一些植物组织中富含多糖、多酚类物质,细胞破碎后多酚类物质极易被氧化成红褐色物质,然后和核酸不可逆地结合;多糖与RNA共沉淀,对RNA提取造成很大的干扰。另外,RNA 极不稳定,易降解,因此,从富含多糖、多酚植物组织中获得高质量的RNA比较困难。针对多糖、多酚植物组织RNA的提取,华越洋自主研发生产，博取众家之长，根据多年来市场反馈不断进行技术升级和改良得来。具有操作步骤少，实验快捷，RNA产量纯度高，充分满足后续实验要求的需要，适用提取样品广泛等特点。 产量：每100mg样品提取的RNA平均值在20-50ug不等。 纯度：OD值一般在1.9以上。得到的RNA无DNA污染，可直接用于反转录，实时荧光定量PCR（尤其对RNA溶液中DNA非常敏感）等所有后续实验。 1、快速：本试剂盒提取RNA的整个实验操作步骤简化快捷从时间因素考量上最大限度的防止RNA在提取中的降解（一般样品十多分钟就能完一个样RNA的提取，大大缩短了一般试剂盒提取所需要的半小时甚至更长的时间，）。 2、高产量：试剂盒拥有超强细胞裂解液，保证后续RNA提取的得率。（能完全通过化学方法彻底裂解细胞让RNA释放完整，并且有效成分能抑制内源RNA酶的降解作用）。 3、高纯度：进口吸附柱具有的专一吸附特性和强吸附力。三管齐下保证所提取RNA的产量和纯度，前期得到的高质量RNA才能保证后续实验成功，尤其是对荧光定量PCR实验等。
4、无DNA污染可直接用于荧光定量PCR：目前市面上的试剂盒大多提出的RNA会出现DNA污染其结果严重影响后续实验，特别是非常灵敏的荧光定量PCR的实验。一些市面上单独卖的去DNA污染的试剂，效果不稳定，去除DNA污染不彻底。本产品操作简单，去除DNA 彻底，得到的RNA样品可直接用于荧光定量PCR，反转录等各种后续实验。 5、产品整合了在提取过程中去除干扰物的技术，有去除多糖多酚类的植物RNA提取试剂盒，已成功用于葡萄，中草药等多糖含量高的样品，成功用于棉花等多酚含量高的样品。华越洋还开发了有强力去腐殖酸型的土壤DNA，RNA提取试剂盒，技术国内领先。另外华越洋还开发了糖类清除剂，腐植酸去除剂，核酸提取优化剂，样品核酸稳定剂，组织核酸保存液等核酸提取辅助产品。 6、适用材料广泛：本产品尤其适合植物组织，全血和病毒等样品的RNA提取，另有专门针对难提材料的RNA升级版试剂盒（已成功用于棉花、葡萄、番茄等多糖多酚类植物，小麦，水稻，玉米等农作物，果实、干枯树皮、病毒、全血、微量细胞、水溶液、土壤、粪便、岩石样本等），动物组织，微量细胞等45种复杂样品的核酸提取。 另有microRNA．SiRNA提取试剂盒。 姊妹产品推荐：Trizol 用法和质量与进口同类产品一致，华越洋常年特价销售。 反转录试剂盒（RT）：用于第一连CDNA合成，低拷贝基因的检测。本试剂盒所含的反转录酶与市面上的常用的反转录酶相比有更高的效率和延伸能力和稳定性。合成CDNA长度最高可达15KB。 普通PCR扩增用MIX：本混合液优化了体系中Taq酶，DNTP，Mg离子浓度，电泳染料等各种试剂比例，用户不需要摸条件只需要引物和模板就可轻松完成PCR的扩增。 荧光定量PCR试剂（一般实验室常用版本）：属于经典的SybrGreen荧光染料的高效高活性荧光定量检测试剂。用于绝大多数的CDNA模板和不同长度的CDNA片段高质量扩增。
多酚氧化酶
多酚氧化酶 1 多酚氧化酶的概念 植物多酚氧化酶是一类多基因家族表达的产物，是含Cu元素的膜结合蛋白，具有基团专一性，主要与植物色素的生成及其产品的色变有关。多酚氧化酶最早发现于1895年，1937年KubOwitz在实验室中第1次分离出多酚氧化酶。1907年Bertrand等从小麦麸皮中发现多酚氧化酶(酪氨酸酶，TyrOsinase)的存在。多酚氧化酶是一种蛋白体，在茶树生命活动和茶叶加工过程中参与一系列由酶促活动而引起的化学变化，故又被称为生物催化剂。茶叶中的酶较为复杂，种类很多，包括氧化还原酶、水解酶、裂解酶、磷酸化酶、移换酶和同工异构酶等几大类。酶蛋白具有一般蛋白质的特性，在高温或低温条件下有易变性失活的特点。各类酶均有其活性的最适温度范围，一般在30C～50℃范围内酶活性最强。酶若失活、变性，则就丧失了催化能力。酶的催化作用具有专一性，如多酚氧化酶，只能使茶多酚物质氧化，聚合成茶多酚的氧化产物茶黄素、茶红素和茶褐素等;蛋白酶只能促使蛋白质分解为氨基酸。茶叶加工就是利用酶具有的这种特性，用技术手段钝化或激发酶的活性，使其沿着茶类所需的要求发生酶促反应而获得各类茶特有的色香味。如绿茶加工过程中的杀青就是利用高温钝化酶的活性，在短时间内制止由酶引起的一系列化学变化，形成绿叶绿汤的品质特点。红茶加工过程中的发酵就是激化酶的活性，促使茶多酚物质在多酚氧化酶的催化下发生氧化聚合反应，生成茶黄素、茶红素等氧化产物，形成红茶红叶红汤的品质特点。 2 多酚氧化酶的分布 多酚氧化酶是一种由核基因编码的质体酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，即主要存在于叶绿体、黄色体和白色体等的内膜上。植物多酚氧化酶广泛存在于植物体的各种器官和组织中。各种器官和组织中PPO分布是不均匀的，具有时间和空间特异性，幼嫩部位的PPO活性较高，成熟或衰老部位活性较低。另外，环境胁迫、化学药品也能诱导PPO的表达，植株组织受到机械损伤或病虫害的侵染，该部位的PPO活性也将上升。对于小麦，从植株幼苗到成熟籽粒都含有PPO，但是其活性和种类有差异，籽粒中的PPO主要存在于麸皮中。不同生物体、同一生物体的不同部位和不同发育时期PPO的含量和种类均有所不同。20世纪60年代以来，研究者们曾从不同的植物中分离出PPO，其中以茶叶、葡萄、荔枝及番茄等中的PPO含量较为丰富，而小麦等禾谷类作物中PPO不是太丰富。虽然几乎所有的质体中都包含PPO，但在某些组织中很难检测到PPO的活性，如C4植物的维管束鞘细胞和保卫细胞的质体。 3 多酚氧化酶的生理生化特性及功能 高等植物组织发生褐变主要是PPO活动的结果。PPO催化单酚羟基化为O﹣二酚，二羟酚氧化为O﹣醌，醌聚合并与细胞内蛋白质的氨基酸反应，产生黑色或褐色色素沉淀，最终导致水果、蔬菜等经济作物外观和风味变差，营养价值下降，造成经济损失。但关于PPO 的生理功能问题，至今尚未有一个比较明确的认识。目前研究比较多的都集中在它与植物抗病性的关系上。多酚氧化酶位于质体的类囊体膜上，作为氧化还原酶，被认为与呼吸链末端的电子传递有关，能消除氧自由基的伤害，从而达到抗病的目的。随着研究的深入，人们还逐步发现了多酚氧化酶的其他生理功能。PPO参与植物色素的生成；还与植物抗逆、生长发育有关，可能促进已烯代谢；在光合作用中，可能在叶绿体内起着能量转换作用，传递光还原产生的分子氧；与植物的抗病虫等方面相关，大多数研究表明，PPO与植物的免疫抗性有关，如烟草对炭疽病、黄瓜对黑星病、苹果对轮纹病、棉苗对枯萎病、水稻对白叶枯病以
植物多酚的抑菌特性—天然防腐剂
植物多酚的抑菌特性—天然防腐剂 植物多酚对微生物的抑制作用是多种因素共同作用的结果。植物多酚与蛋白质的高度结合能力，可以改变微生物酶的活性，减少微生物对外源性蛋白质的利用；植物多酚与金属离子的络合特性可以使某些金属酶失活；植物多酚对细胞膜的作用可以影响微生物的代谢。其中，植物多酚对酶的抑制作用是其抑菌的主要原因。 早在1947年，我国对紫苏叶的抗菌性能进行了研究。结果表明紫苏叶能有效地抑制一些葡萄球菌的生长。 通过对紫苏抗菌作用的研究，发现紫苏油中的挥发性成分紫苏醛和柠檬醛具有一定的协同抗真菌能力。 研究表明紫苏精油对金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、大肠杆菌、假结核棒状杆菌等细菌有明显的抗菌活性，不仅可以治疗牙科感染，而且可以抑制链球菌的生长。张子扬研究表明，紫苏油和桂皮油对蜂蜜的保藏存储中自然污染的霉菌和酵母菌的抑制能力明显高于尼泊金乙酯和苯甲酸。 丁香油酚和乙酰基丁香油酚及紫苏醛可以抑制绿脓杆菌的传染，等采用蒸馏法以甲醇作为提取剂提取紫苏茎叶中的精油，并对其抗菌活性进行了研究。 结果表明，紫苏的水蒸气提取物具有广谱的抗菌活性，其中的主要成分紫苏醛具有中等广谱的抗菌活性，且与水寥中的寥二醛具有较明显的协同效应。 将紫苏醛应用在肉制品防腐试验中，发现紫苏醛可以有效降低微生物的生长能力，减少其生长量‘紫苏叶水浸液、水煎液和乙醇提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌也具有一定的抑制能力。 在紫苏愈伤组织迷迭香酸的纯化及抗菌活性研究中发现，迷迭香酸水溶液对以大肠杆菌为代表的杆状菌和以金黄色葡萄球菌为代表的球状菌的生长均有一定程度的抑制作用。 紫苏抗菌防腐性能，紫苏不同溶剂提取物、紫苏不同提取条件提取物、紫苏不同部位提取物都对细菌、酵母菌和霉菌有一定的抑制效果，添加浓度1.25%。紫苏提取液到卤肉中的防腐效果与浓度0.5% 山梨酸钾溶液浸2min处理的效果相似，与不添加防腐剂的对照相比，均能明显延长保质期。 紫苏提取物对革兰氏阳性和阴性菌均具有不同程度的抑制能力，且酚羟基对多酚类物质的抑制作用起决定性作用。黄丹等研究了紫苏乙醇提取物对细菌、酵母菌和黑曲霉
植物总多酚常用的含量测定方法有Folin
植物总多酚常用的含量测定方法有Folin- Ciocalteu 法, 酒石酸亚铁法, 普鲁士蓝法和高锰酸钾法等。 1.福林试液的配制： 取钨酸钠10g与钼酸钠2.5g，加水70ml、85％磷酸5ml与盐酸10ml,置200ml 烧瓶中,缓缓加热回流10小时，放冷，再加硫酸锂15g、水5ml与溴滴定液1滴煮沸约15分钟，至溴除尽，放冷至室温，加水使成100ml。滤过,滤液作为贮备液。置棕色瓶中,于冰箱中保存。临用前，取贮备液 2.5ml，加水稀释至10ml，摇匀，即得。 用10mL乙醇溶液溶解0.5000g没食子酸，定容至100mL，分别移取3.0mL 到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容。加入福林－薛卡多（Folin-Ciocalteu）试剂显色，在765nm波长下测定吸光度。每个浓度做三个平行试验，取平均值，根据标准曲线。 取样品溶液1mL，按照上述的制作方法，测定其吸光度，每个样品做三个平行试验，取平均值，计算样品中的多酚含量。 反应原理为酚类化合物在碱性条件下可以将钨钼酸还原，生成蓝色的化合物，颜色的深浅与酚类化合物含量呈正相关，在波长760 nm左右有最大吸收。 2. 酒石酸亚铁比色法。 其测定原理是茶多酚类物质能与亚铁离子形成紫蓝色络合物。用分光光度法测定其含量。 茶多酚标准溶液的配制称取提取纯品0.2500g,加水溶解定容至250mL,混匀,即为每毫升含1mg提取纯品的标准溶液(mg/mL) 。 茶多酚的含量。茶多酚标准曲线的绘制。分别吸取茶多酚标准溶液1. 0mL、2. 0mL、3. 0mL、4. 0mL 于4 个50mL 容量瓶中,各加水至10mL,再加酒石酸亚铁溶液10mL,加入pH为7. 5的磷酸缓冲液至刻度,混匀后用1㎝比色皿,以空白试剂作参比,于波长540nm处测定吸光度(A) ,绘制出标准曲线。
4种植物多酚对生物大分子的保护作用
第41卷第1期华中师范大学学报(自然科学版) Vol.41No.1 2007年3月 J OU RNAL OF HUAZHON G NORMAL UNIV ERSIT Y (Nat.Sci.) Mar.2007 收稿日期:2006210220. 基金项目:国家自然科学基金资助项目(20274034);西北师范大学博士科研启动基金资助项目.3Email :nwnuming @https://www.360docs.net/doc/277296056.html,. 文章编号:100021190(2007)01201172034种植物多酚对生物大分子的保护作用 刘国安3,杨庆明,杨 红,丁 兰,候国鹏 (西北师范大学生命科学学院,兰州730070) 摘 要:为了研究多酚类化合物对生物大分子氧化损伤的保护作用,采用MDA 测定、SDS 2 PA GE 、琼脂糖电泳,检测了4种多酚对由自由基引起的脂质过氧化、蛋白质氧化降解、DNA 断裂 的保护作用.结果表明:槲皮素在抑制脂质过氧化中作用最突出,在保护蛋白质氧化降解中香草醛作用最强;芦丁在保护DNA 的氧化性损伤中最有效.说明4种化合物在不同的抗氧化体系中有不同的活性. 关键词:植物多酚;脂质过氧化;蛋白质氧化;DNA 损伤;抗氧化作用中图分类号:R963 文献标识码:A 自由基是人体中的正常代谢产物,如果自由基产生过多或清除过少,过量的自由基就会攻击生物大分子,导致细胞结构和功能破坏.因此,自由基是人类衰老和许多疾病如肿瘤、心脑血管病等的重要诱因[1].寻找能够有效清除自由基而无毒副作用的抗氧化剂,预防和减轻上述疾病的发生和发展,是研究的重要课题之一.本实验用丙二醛(MDA )测定、蛋白质凝胶电泳、DNA 电泳技术,测定了槲皮素、芦丁、香草醛、姜黄素对脂质过氧化、蛋白质和DNA 的氧化损伤的保护作用,并对其保护作用进 行了比较和分析,为进一步研究抗氧化机理及临床应用提供理论基础. 1材料与方法 1.1试剂 槲皮素、姜黄素、AA P H (2,22偶氮二(22脒基丙烷)二盐酸盐)、B H T (2,62二叔丁基对甲基苯 酚)、琼脂糖、溴化乙锭均购自Sigma ,芦丁为西安惠丰生物工程公司产品,牛血清白蛋白(BSA )、质粒pBR322DNA 均购自华美生物工程公司,十二烷基磺酸钠(SDS )购自Serva ,实验用鼠由甘肃省肿瘤医院动物房提供,其余试剂均为国产分析纯.1.2脂质过氧化的测定 微粒体的制备参照文献[2]的方法.Lowry 法测定蛋白质浓度. 脂质过氧化的测定参照文献[3],稍作修改. 1mL 反应体系中含有0.2mol/L PBS ,240～400μg 的微粒体蛋白,加入0.1m mol/L 抗坏血酸及10μmol/L FeSO 4启动反应.于37℃振荡孵育1h 后,1.0mL 20%三氯醋酸终止反应,硫代巴比妥酸法测定MDA ,所有实验重复3次.1.3蛋白质氧化实验方法 蛋白质氧化测定按H.Y.Kwon 等[4]的方法稍加改进.10μg 牛血清白蛋白(BSA )的氧化在0.2mol/L PBS 中由水溶性偶氮引发剂 20m mol/L AA P H 启动.加入不同浓度的待测物.37℃水浴孵育24h 后,加入0.02%B H T 以防止氧 自由基的进一步形成.样品按常规SDS 2PA GE 电泳,0.05%考马斯亮蓝R 2250染色.1.4D NA 氧化断裂实验方法 pBR322质粒DNA 主要以超螺旋型存在,当 受到氧化损伤时,质粒超螺旋的DNA 会打开1条核酸链而降解为环状,当损伤程度进一步加强时,2条核酸链会被同时打开而降解为线型的DNA ,电泳后位于超螺旋和开环之间[5].将100ng pBR322质粒DNA 与溶于0.15mol/L PBS 的10m mol/L AA P H 混匀,使终体积为25μL ,37℃孵育1h.抗氧化剂在加入AA P H 之前加入.孵育后立即上样电泳.0.8%琼脂糖凝胶以TA E 缓冲液(40m mol/L Tris 、20m mol/L 冰乙酸、2m mol/L ED TA p H
多酚类化合物
多酚类化合物 多酚类化合物又称黄酮类，由40多种化学成分组成，具有抗氧化、强化血管壁、促进肠胃消化、降低血脂肪、与增加身体抵抗力，并防止动脉硬化、血栓形成的作用；还能利尿、降血压、抑制细菌与癌细胞生长，及帮助消化。 简介 多酚类是指一组植物中化学物质的统称，因具有多个酚基团而得名。多酚在一些植物中起到了呈现颜色的作用，如秋天的叶子。 功效 多酚类化合物多酚类化合物对人体健康的重要越来越受 科学界的关注。葡萄酒中含有许多有益健康的非酒精成分，包括白藜芦醇和多种类黄酮成分，这些强力抗氧化物都属于多酚类化合物，对冠心病有良好的防治作用。 多吃蔬菜、水果有益健康，而蔬果的抗氧化作用主要就来自其中所含的多酚类物质。 另一类富含多酚物质的饮料是茶，多喝茶也有预防肿瘤和冠
心病的作用。含有多酚物质的豆类食品则有防治乳癌和骨质疏松的作用。 共同特点 多酚化合物的共同特点是具有良好的抗氧化活性，能与维生素C 、E和胡萝卜素等其他抗氧化物在体内一起发挥抗氧化功效，清除有害人体健康的坏分子——自由基。 种类 多酚物质的种类很多，结构各异，其生物利用率、抗氧化性及对人体的影响也有差异。多酚类物质按结构大致可分为类黄酮、芪、酚酸和木酚素。目前科学界已经分离鉴定出八千多种多酚类物质。 常见多酚类化合物 儿茶素 儿茶素在茶叶、银杏、罗布麻、槟榔存在，表儿茶素在茶叶、银杏、越橘、贯叶连翘等中存在。它们具有止泻、保肝、降低胆固醇、抗炎等方面的作用。茶多酚是茶叶中儿茶类成分和其他多酚类成分，如花青素、黄酮类成分、酚酸等成分的总称，占茶叶的10%~20%。在未经过发酵的绿茶中儿茶素类成分含量最高，可达25%，主要以儿茶素、表儿茶素、没食子酚儿茶素（Gallocatechin）、表没食子酚儿茶素（Epigallocatechin），经过发酵的茶叶如红茶、乌龙茶等主要含有上述多酚的缩合物、茶黄素（Theaflavins）、花青素
多酚氧化酶6页
多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一。自1883年Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物质相关，1938年Keilin D.和Mann G.研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化，得到多酚氧化酶并将这类酶称为polyphenol oxidase。多酚氧化酶又称儿茶酚氧化酶，酪氨酸酶，苯酚酶，甲酚酶，邻苯二酚氧化还原酶，是六大类酶中的第一大类氧化还原酶。 多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。现在大部分文献所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。 编辑本段 二、多酚氧化酶在自然界的分布 1植物中的多酚氧化酶及作用
在植物(如苹果、荔枝、菠菜、马铃薯、豆类、茶叶、桑叶、烟草等)组织中，PPO是与内囊体膜结合在一起的，天然状态无活性，但将组织匀浆或损伤后PPO被活化，从而表现出活性。在果蔬细胞组织中，PPO存在的位置因原料的种类、品种及成熟度的不同而有差异，绿叶中PPO活性大部分存在于叶绿体内[7]；马铃薯块茎中几乎所有的亚细胞部分都含有PPO，含量大约与蛋白质部分相同[8]；在茶叶中的PPO 分为游离态和束缚态，前者主要存在于细胞液中属可溶态PPO，而后者则主要存在于叶绿体、线粒体等细胞器中，与这些细胞器的膜系统或其他特异部位结合呈不溶态[9]，ThanarajS.N.(1990)研究了茶树新梢中PPO活性及多酚含量对红茶品质的影响，发现PPO活性强，多酚含量高，对红茶品质有利，相反则利于绿茶的生产[10]；新鲜的苹果中，多酚氧化酶几乎全部存在于叶绿体和线粒体中。从这两部分分别制备的PPO，其底物专一性稍有差异[11]。刘乾刚认为，PPO在细胞内除了存在于叶绿体及线粒体上外，细胞壁也可能存在PPO，且对发酵产生影响，细胞只要轻微破损便有PPO的作用。多酚氧化酶是一种质体酶，有些研究人员认为多酚氧化酶可能仅存在于质体中[12]，缺乏质体的组织就不存在多酚氧化酶，例如筛管和筛胞等，但是有质体的组织也可能没有多酚氧化酶，如C4植物叶。含有质体的植物组织不一定都存在多酚氧化酶，而多酚氧化酶一定在含有质体的植物组织中。 随分子生物学的发展，象西红柿、苹果等的多酚氧化酶的基因已被克隆。浙江大学赵东等[12]对茶树多酚氧化酶的克隆及其序列进行了比较。从已经克隆的多酚氧化酶的基因看，均属于基因家族，多则
多酚氧化酶特性研究
多酚氧化酶特性研究 摘要: 采用分光光度法, 对板栗仁多酚氧化酶( PPO) 的催化特性、最适波长、最适反应时间、最适温度、最适pH 值、热稳定性等性质进行了研究, 同时研究了Vc、EDTA、NaCl、柠檬酸4种添加剂对板栗仁多酚氧化酶活性的影响。结果表明: 板栗仁多酚氧化酶催化氧化产物的最大吸收波长为410nm, 最佳反应时间为3min, 最适反应温度为30℃ , 最适pH 值为6. 0, 米氏常数Km = 0.0694mo l/L, Vmax = 3.918OD/min。95℃水浴处理5min该酶已基本失活, 其中V c和EDTA对板栗仁多酚氧化酶酶促褐变有很好的抑制效果。 关键词: 板栗; 多酚氧化酶; 褐变; 抑制多酚氧化酶( Polyphenolox idase, PPO ) 是由核基因编码的铜金属酶, 其酶促褐变机制是: 内源性酚类物质在多酚氧化酶的催化下氧化生成醌, 醌再相互作用生成高分子聚合物, 从而导致褐色素的生成。它能催化两类不同的反应, 可以使一元酚羟基化, 生成相应的邻二羟基化合物;也可以氧化邻苯二酚生成醌[ 1]。而酚类物质是果疏组织褐变的物质基础, 不同植物、同一植物的不同组织, 同一植物的不同品种、生长环境以及不同的发育期, 其褐变的主要酚类物质均有所不同, 导致酶褐变活性也有所差异。云南富产板栗, 但对板栗仁PPO 的活性及影响活性因素的研究则未见报道。1材料与方法 1.1材料 板栗市场购外观良好, 无病虫害, 无机械损伤新鲜的云南板栗。 1.2试剂与仪器 主要试剂: 聚乙烯吡咯烷酮( PVPP)、邻苯二酚、乙酸钠、冰乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甲醇、乙醛、盐酸、维生素C ( V c)、EDTA、柠檬酸、氯化钠等, 均为国产分析纯。 主要试验仪器: TGL - 16G 高速台式冷冻离心机、722W 型分光光度计、HH - 4型数显恒温水浴锅、冰箱等。 1.3试验方法 1.3.1粗酶液的制备 酶液提取参照文献[ 2] 的方法, 有所改进。称150g 冷冻鲜样, 加入PH 值6.0 的0.05mol /L冷冻磷酸缓冲液150mL 和15gPVPP, 打浆, 过滤, 于3℃下12000r /min 离心15min, 取上清液置于0~ 4℃保存备用。 1.3.2褐变度( BD) 的检测 称5g 样品加入15mL 蒸馏水中研磨, 离心( 14000r/min、15min)。沉淀溶于15mL 甲醇甲酸溶液(体积比1:1), 充分浸提15min 后离心。 将两次所得上清液混匀后用蒸水定容为25mL, 离心, 取上清液检测410nm 下的吸光值An ×10 表示。 1.3.3总酚( TP) 的提取和含量检测 称取5g 样品, 加入15mL 乙醛- 盐酸溶液( pH3.0) 研磨, 在恒温水浴中震荡1h, 取出离心15000r /min, 30min, 量取滤液体积, 吸取5mL, 用蒸水定容到50mL, 测定A 值, 用邻苯二酚做标准曲线。 1.3.4酶活性的测定 取2mL 0.2mol/L 邻苯二酚溶液和2mL一定pH值的磷酸缓冲溶液加入到试管中, 然后加入0.5ml的粗酶液, 水浴保温3min后立即倒人比色管中, 在410nm波长处测定反应混合液的吸光值变化(△A), 每30s读数1次, 共记录3min。空白用
植物多酚提取方法
植物多酚提取方法 1.1溶剂萃取法 原理：溶剂萃取是根据被提取成分在不同溶剂中的溶解性差异，选用适当的溶剂将有效成分从提取原料中分离出来的过程。 注意：除溶剂极性大小外，溶剂萃取法还易受到溶剂pH值、提取温度、提取次数、溶剂体积和样品颗粒大小等多种因素的影响。 1.2超声辅助提取 原理：利用超声波的机械破碎和空化作用，物料周围空穴形成、增大和闭合回产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎，增加有效成分的溶出速度和数量，加速多酚等浸提物从原料向溶剂的扩散速度，从而提高了有效成分的浸提率，缩短浸提时问，浸提液采用与传统工艺相同处理精制过程取得产品。 优势：浸提所需的时间短，因此避免了长时间处于高温下茶多酚的氧化，收率和产品质量都较传统方法高。 1.3微波辅助提取 原理：利用在微波场中分子发生高频的运动，扩散速率增大，因此多酚等浸提物在微波的辐射作用下可快速浸取出来。 优点：大大的减少了多酚长时间在高温下的氧化，提高品质与收率。微波技术应用于多酚的提取具有短时、高效、节能等优点，微波结合水浴提取，不仅茶多酚浸出率高，优于乙醇、水提取，而且降低了成本和减少了污染。 1.4超临界流体萃取 原理：在超临界状态下，流体对被萃取物的萃取能力和选择性较之常温常压条件下大大的提高。一般情况下，超临界流体萃取技术采用CO为超临界流体溶剂。然而单一组分的超临界溶剂存在一定的局限性，因此可加入一定量的夹带剂来提高萃取效果。常用的夹带剂有水、丙酮、乙醇、甲醇等。
优点：超临界流体萃取低黏度、高扩散性，具有更高的传质效率；可以实现定量萃取和完全萃取；可以通过调节压力与温度实现对流体溶解能力大小的调控；超临界流体萃取在接近室温下操作，特别适合热敏性天然产物的提取分离甚至于发现新物质。 1.5离子沉淀提取 原理：利用茶多酚能与某些金属离子络合成结晶性沉淀物的特点，使其从浸提液中分离出来，实现分离。目前，已有 Ca2+、Mg2+、Ba2+、Fe2+、Zn2+、Al3+等多种离子用于沉淀提取茶多酚的工艺报道。 优点：原料经热水浸提后，加入沉淀剂即得多酚与金属离子的结晶性沉淀物，不必浓缩浸提液，同时由于这些沉淀的选择性较高，得到茶多酚的纯度相对较好。缺点：在其后的稀酸转溶过程中茶多酚损失较大且沉淀剂有的是有一定毒性的金属离子，有的偏碱性易造成多酚的氧化，因此在产品的纯度、收率、成本及安全性上仍不是完全令人满意。 1.3吸附分离提取 原理：将原料加热水浸提后合并提取液。提取液通过高分子吸附剂进行吸附，然后用95%乙醇洗脱，使吸附剂上吸附的GTP脱附于乙醇中，经减压蒸馏，浓缩液经真空干燥或喷雾干燥得到多酚。 特点：工艺技术简单、能耗低，但需要对GTP选择性强的高吸附量的吸附剂。 植物多酚分离方法 1.1制备HPLC 原理：一是将儿茶素粗品用亲脂性凝胶或吸附树脂多次层析纯化；另一种是制得粗品后直接用制备HPLC法分离纯化（用丙酮和水洗脱）。 特点：方法一操作过程复杂，周期长，条件不易控制；方法二难以得到大量的多种高纯儿茶素，而H柱子总负载量巨大，制备效果不高，色谱柱容易污染，寿命短。把两种方法结合起来，将粗提是先经柱层析分离，再用制备HPLC纯化精制，
植物多酚氧化酶(PPO)酶联免疫分析
植物多酚氧化酶（PPO）酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用。 检测范围：96T 0.1U/L – 4.0U/L 使用目的： 本试剂盒用于测定植物组织，细胞及其它相关样本中多酚氧化酶（PPO）含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物多酚氧化酶（PPO）水平。用纯化的植物多酚氧化酶（PPO）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入植物多酚氧化酶（PPO），再与HRP 标记的多酚氧化酶（PPO）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的植物多酚氧化酶（PPO）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中植物多酚氧化酶（PPO）浓度。 试剂盒组成 1 30倍浓缩洗涤液20ml×1瓶 6ml×1瓶 12孔×8条 6ml×1瓶 6ml×1瓶 6ml×1/瓶7 8 9 终止液6ml×1瓶 0.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 1份 2 酶标试剂标准品（8.0 U/L） 标准品稀释液 3 酶标包被板 4 样品稀释液 5 显色剂A液 6 显色剂B液10 说明书 11 封板膜 12 密封袋 2张 1个 标本要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 释。 4.0 U/L 2.0 U/L 1.0 U/L 0.5U/L 0.25U/L 5号标准品 4号标准品 3号标准品 2号标准品 1号标准品 150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液 150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液 150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液 150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液 150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、
磁珠法(多糖多酚)植物组织基因组DNA提取试剂盒
磁珠法多糖多酚植物组织基因组DNA提取试剂盒MagBeads Polysaccharide & Polyphenol Plant Genomic DNA Extraction Kit 【目录号】PTDE-6005、PTDE-6030； 【运输条件】2~25℃； 【保存条件】磁珠分散液、β-巯基乙醇2~8℃；蛋白酶K -20℃；其它组分室温保存； 【试剂盒组成】 【注意事项】 1. 使用前请检查裂解液（组分①）和结合液（组分②）是否出现结晶，如有结晶请置于 65℃温浴至重新溶解完全； 2. 初次使用全新试剂盒前，请按照结合液（组分②）标签标注量加入异丙醇，稀释备用； 3. 磁珠悬浮液（组分③）不可反复冻融或离心，使用前需充分摇匀； 4. 蛋白酶K（组分⑤）于-20℃长期保存，避免反复冻融；融化后4℃保存，并尽快使用； 5. 请仔细阅读本说明书，并按照操作指南建议操作。
【产品简介】 本试剂盒采用针对富含多糖多酚植物组织进行杂质去除的特殊磁珠，配合高性能缓冲液体系，可从各种富含多糖多酚植物组织样本中高质量的分离纯化基因组DNA。 特殊技术包埋的磁珠在特定条件下对核酸具有极强的亲和力，而当条件改变时，磁珠会释放所吸附的核酸，从而达到快速分离纯化核酸的目的。提取所得的基因组DNA产物片段大、纯度高、质量稳定可靠，尤其适合高通量仪器自动化提取，特别是本公司生产的各类型号自动化核酸提取仪或工作站。使用本试剂盒纯化所得核酸产物可适用于各种常规分子生物学下游实验，如：酶切、PCR、荧光定量PCR、文库构建、Southern杂交、芯片检测和高通量测序等。 【试剂盒说明】 【自备仪器及耗材】 研钵&研磨棒(或者研磨机、匀浆机)、水浴锅、涡旋混合仪、高速离心机、EP管（1.5mL 或2.0mL）、EP管配套用磁力架、核酸提取仪（仪器自动版操作步骤需准备）。 【自备试剂】 液氮、乙醇(80%, v/v)、异丙醇、RNase A溶液(100mg/mL，分散液10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH值8.0)。 【仪器自动法版操作步骤】 该方法配合磁棒法核酸提取仪使用，以英芮诚ETP-300型全自动核酸提取仪为例，可同步完成32份植物样本提取工作。 1. 准备96孔板 注：1）每次吸取磁珠悬浮液前尽量摇晃均匀；2）为提高效率建议使用排枪。 2. 组织样本前处理和裂解 取适量(≤100mg)植物组织样本，液氮研磨至粉末状，尽量完全转移至EP管中。加入400μL 裂解液、0.8μL β-巯基乙醇和20μL蛋白酶K，涡旋振荡1~3min至混合均匀，呈云雾状。65℃温浴15min，每隔5~10min上下颠倒混匀一次。 注：1）若样本量大于100mg，但不超过400mg，需增加裂解液使用量，可按照每增加100mg组织样本增加150μL裂解液使用量，并延长裂解时间，其余试剂用量不变； 2）若样本个数较多，可预先将蛋白酶k、β-巯基乙醇和裂解液提前混合备用；
多酚氧化酶培训资料
多酚氧化酶
多酚氧化酶的酶学性质及其应用 摘要：本文论述了多酚氧化酶的酶学性质和它对果蔬类食品的影响，以及如何利用它的酶学性质加以控制。 关键词：多酚氧化酶性质抑制 0引言 多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一。自1883年Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物质相关，1938年Keilin D.和Mann G.研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化，得到多酚氧化酶并将这类酶称为polyphenol oxidase。多酚氧化酶又称儿茶酚氧化酶，酪氨酸酶，苯酚酶，甲酚酶，邻苯二酚氧化还原酶，是六大类酶中的第一大类氧化还原酶[1]。 1多酚氧化酶的结构特性 多酚氧化酶是一种含有Cu2+离子的结构蛋白，可以催化酚类上的羟基，使之转化为醌或催化多酚类变为氧合醌。因为醌类具有较强的电化学性质，会发生自动氧化、蛋白质的亲核聚合反应及一些二级反应，而这些反应都会导致酶促褐变反应的发生[2]。 多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶(酪氨酸酶 tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)
和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。 2 多酚氧化酶的来源和制备 2.1多酚氧化酶的来源 多酚氧化酶普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。 2.2多酚氧化酶的制备 制备马铃薯丙酮粉：取50g去皮切丁的马铃薯与60mL丙酮（-20℃）混合 粉碎抽滤，滤渣用-20 ℃的丙酮冲洗至白色室温下晾干。 PPO粗提液的制备： 5g马铃薯干粉与40mL粗酶提取液混合搅拌1min 静止1hr，4℃离心（4℃，15000rpm，15min）过滤取上清，即得PPO粗提液，粗酶提取液为4.2g+1000mL0.2M PB。 PPO纯化之盐析：PPO的纯化常采用盐析法。盐析主要是利用酶蛋白在高 浓度的盐溶液中溶解度减小而析出的原理。硫酸铵由于价廉、溶解度大，且能 使蛋白质稳定，故是最常用的盐析剂。 粗酶制剂加入等体积饱和(NH4)2SO4静置1hr，4℃离心（4℃，17000rpm， 10min）收集沉淀加15mL0.2MPB溶解再次离心（条件同前）收集上清，即得PPO粗酶制剂取4mL粗酶制剂于冷冻干燥机上冻干，得PPO干粉[3]。 3多酚氧化酶的催化机理 多酚氧化酶(PolyphenolOxidase，PP0)是从真菌到植物乃至哺乳动物体内都 广泛存在的一类铜蛋白，它能有效催化多酚类化合物氧化形成相应的醌类物 质。在茶儿茶素氧化PPO底物儿茶素(eatechin)类能和许多金属离子络合，Cu2+离子形成的配位物中的配位数为4或6，可以从配位体的配位键来阐明PPO的
植物多酚
植物多酚的分类及生物活性的研究进展随着生活质量的提高，各种现代慢性疾病（包括心血管疾病、癌症、老年痴呆症等）的发病率不断上升。医学研究者发现，植物多酚对此类病症有良好治疗和预防效果，因此，植物多酚的研究引起全球极大的关注。目前研究较多的有茶多酚、葡萄多酚、苹果多酚、石榴多酚等。植物多酚是指来源于莽草酸途径和苯丙氨酸代谢途径的化合物，它具有芳环结构并结合有1个或多个羟基。植物多酚又称植物单宇，是植物体内重要的次生代谢产物，可以抵御紫外线的辐射和病原体的侵染，主要存在于植物体果实、皮、根和叶中。 1 植物多酚分类 人们最初研究的植物多酚是单宁。1920年K·Frendenberg按照单宁的化学结构特征，将单宁分为水解单宁和缩合单宁两大类，这类方法得到公认并一直沿用至今。按照多酚来源的不同，也有人将其分为茶多酚、葡萄多酚、苹果多酚、石榴多酚等。此外，按照酚环的数量以及其他环结合的结合元素的作用不同分成酚酸、类黄酮、木聚素和木酚素等，还有人将植物多酚按照其化学结构中碳原子的骨架结构进行分类，这种分类方法一目了然，使人很容易掌握植物多酚的结构。 植物多酚的主要类别见表1。
表1 植物多酚的主要类别 2植物多酚生物活性 多酚是重要的风味物质和呈色物质，广泛存在于药用植物中，可调节大部分酶和细胞接收器的活性，对癌症、心血管疾病和神经组织退化具有积极的治疗和预防作用。 2.1抗氧化合清除自由基作用 随着自由基生物学和医学研究的日趋深入和发展，研究者通过动物模型验证了植物多酚具有较强的抗氧化能力，其抗氧化性体现在：①通过还原反应降低环境中的氧含量；②作为氢供体释放出氢与环境中的自由基结合，中止自由基引发的连锁反应，从而阻止氧化过程的继续进行。同时，植物多酚能有效清除体内过剩的自由基，抑制脂质过氧化，对自由基诱发的生物大分子损伤起到保护作用，减缓人体组织器官的衰老。 2.2抑菌消炎、抗病毒作用 多酚对多种细菌、真菌、酵母菌均有明显的抑制能力，且在相应的抑制浓度下不影响动物的生长。苹果多酚可有效地防止由大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等引起的食物中毒和其他疾病，其抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的临界生长用药质量浓度分别为
多酚抗氧化性研究报告进展(张云丽)
植物多酚抗氧化性的研究进展及其运用 摘要：植物多酚( 植物单宁> 是一类广泛存在于植物体内的重要的天然产物，叙述了多酚的抗氧化性及多酚在国内外食品工业、医药保健、日用化学品等方面的应用现状, 展望了多酚在国际市场上的广阔前景。 关键词:植物多酚；抗氧化性； 植物多酚
植物多酚氧化酶、超氧化物歧化酶的测定
植物体内多酚氧化酶活性的测定 一、目的 通过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。 二、原理 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。用分光光度法在525nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。反应式如下： 多酚氧化酶 邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2 ——————→ 邻醌＋H2O 三、材料、仪器及试剂 1. 材料：马铃薯块茎等 2. 仪器：UV－1206或UV－1240分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。 3. 试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.01mol·L－1 pH 6.5磷酸缓冲液；0.1m mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液；0.05 mol·L－1 pH5.5磷酸缓冲液；30%饱和度硫酸铵；0.1 mol·L－1儿茶酚； 20％三氯乙酸。 四、实验步骤 1. 粗酶液的制备
称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。将所得沉淀溶于2～3ml 0.01mol·L－1 pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。 2. 活性酶的测定 在试管中加入3.9ml 0.05 mol·L－1 pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 mol·L－1儿茶酚在37℃恒温水浴中保温10min ，然后加入0.5ml酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1～2min内测定吸光度变化（A）值。 五、酶活性的计算 以每min内A525值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力和比活性。 A 酶提取液总量（ml） 酶活力（0.01A·min－1）＝———————×——————————— 0.01×反应时间测定时酶液用量（ml） A 酶提取液总量（ml） 酶的比活性(0.01A·g－1Fw·min)＝—————————×—————————— 0.01×W×反应时间测定时酶液用量（ml） 公式中：A —为反应时间内吸光度的变化值；W为样品鲜重（g）。 植物超氧化物歧化酶活性测量
多酚氧化酶
多酚氧化酶的酶学性质及其应用 摘要：本文论述了多酚氧化酶的酶学性质和它对果蔬类食品的影响，以及如何利用它的酶学性质加以控制。 关键词：多酚氧化酶性质抑制 0引言 多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一。自1883年Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物质相关，1938年Keilin D.和Mann G.研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化，得到多酚氧化酶并将这类酶称为polyphenol oxidase。多酚氧化酶又称儿茶酚氧化酶，酪氨酸酶，苯酚酶，甲酚酶，邻苯二酚氧化还原酶，是六大类酶中的第一大类氧化还原酶[1]。 1多酚氧化酶的结构特性 多酚氧化酶是一种含有Cu2+离子的结构蛋白，可以催化酚类上的羟基，使之转化为醌或催化多酚类变为氧合醌。因为醌类具有较强的电化学性质，会发生自动氧化、蛋白质的亲核聚合反应及一些二级反应，而这些反应都会导致酶促褐变反应的发生[2]。 多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。 2 多酚氧化酶的来源和制备 2.1多酚氧化酶的来源 多酚氧化酶普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。 2.2多酚氧化酶的制备 制备马铃薯丙酮粉：取50g去皮切丁的马铃薯与60mL丙酮（-20℃）混合粉碎抽滤，滤渣用-20 ℃的丙酮冲洗至白色室温下晾干。 PPO粗提液的制备：5g马铃薯干粉与40mL粗酶提取液混合搅拌1min 静止1hr，4℃离心（4℃，15000rpm，15min）过滤取上清，即得PPO粗提液，粗酶提取液为4.2g+1000mL0.2M PB。 PPO纯化之盐析：PPO的纯化常采用盐析法。盐析主要是利用酶蛋白在高浓度的盐溶液中溶解度减小而析出的原理。硫酸铵由于价廉、溶解度大，且能使蛋白质稳定，故是最常用的盐析剂。 粗酶制剂加入等体积饱和(NH4)2SO4静置1hr，4℃离心（4℃，17000rpm，10min）收集沉淀加15mL0.2MPB溶解再次离心（条件同前）收集上清，即得PPO粗酶制剂取4mL粗酶制剂于冷冻干燥机上冻干，得PPO干粉[3]。 3多酚氧化酶的催化机理 多酚氧化酶(PolyphenolOxidase，PP0)是从真菌到植物乃至哺乳动物体内都广泛存在的一类铜蛋白，它能有效催化多酚类化合物氧化形成相应的醌类物质。在