细菌的革兰氏染色法及形态观察
细菌的革兰氏染色法及形态观察
一、实验目的
1．了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
2．学习掌握革兰氏染色技术，巩固学习光学显微镜油镜的使用方法。
二、基本原理
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。革兰氏染色属于最重要的鉴别染色。一般认为革兰氏染色结果的主要原因是由于这两类细菌的细胞壁的结构和化学组成不同。革兰氏阳性菌细胞壁较厚（20-80nm)，主要成分为肽聚糖，网状结构紧密。而革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖层较薄（2-3nm)，主要成分是脂蛋白和脂多糖。细菌经过初染和媒染，在细胞内形成深紫色的结晶紫-碘复合物，当用酒精脱色时细胞壁脱水，阳性细菌细胞壁的肽聚糖层网状结构孔径收缩以至关闭，阻止不溶性复合物结晶紫-碘的逸出，这样使菌体呈蓝紫色。阴性菌脂类物质溶解，结晶紫－碘复合物随之被洗脱出，用复染剂复染后菌体呈复染后的红色。
三、实验器材
1．菌种大肠杆菌、藤黄八叠球菌约24小时营养琼脂斜面培养物。
2．仪器普通生物显微镜显微镜
3．材料载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、滤纸、酒精灯、接种环等
4．染料草酸钱结晶紫染色液、路哥氏（Lugol）碘液、95％乙醇、0.5 %番红染色液
四、实验流程
涂片→干燥→固定→初染1min→水洗→媒染1min→水洗→脱色10-30s→水洗→复染1min→水洗→滤纸吸干→镜检。
五、操作步骤
1．涂片
取洁净的载片一张，将其在火焰上微微加热，除去上面的油脂，冷却，在中央部位滴加一小滴生理盐水，用接种环在火焰旁从斜面上挑取少量菌体与水混合。烧去环上多余的菌体后，再用接种环将菌体涂成直径1cm 的均匀薄层，以淡淡的乳白色为宜。制片是染色的关键，载片要洁净，不得玷污油脂，菌体才能徐布均匀。注意初次涂片，取菌量不应过大，以免造成菌体重叠。
2．干燥
涂布后，待其自然干燥或在酒精灯上方稍微加热，切勿靠近火焰。
3．固定
将已干燥好的涂片标本向上，在微火上以钟摆速度通过3-4次进行固定。固定的作用为：a.杀死细菌；b.使菌体蛋白质凝固，菌体牢固粘附于载片上，染色时不被染液或水冲掉；c.增加菌体对染料的结合力，使涂片易着色。
4．染色
a．初染在涂片处加草酸按结晶紫染色液（加量以盖满菌膜为度），染色1min。倾去染色液，用自来水细水小心地冲洗至洗出液为无色，水洗时水流不要直接冲洗涂面，以免水流过大将菌体冲掉。
b．媒染滴加（Lugol）碘液，染lmin，水洗。
c．脱色用滤纸吸去残水，滴加95％乙醇，轻轻摆动玻片脱色10-30s立即水洗，以终止脱色。
d．复染滴加番红，染色1min，水洗后晾干，也可以用吸水纸轻轻吸干。
e．镜检干燥后，置油镜下观察。被染成紫色者即为（G+)；被染成红色者是革兰氏阴性菌（G-）。
六、注意事项
1.涂片不宜过厚，否则宜脱色不完全造成假阳性。
2.火焰固定不宜过热，以玻片不烫手为宜，否则菌体细胞容易变形。
3.滴加染色液和酒精时一定要覆盖整个菌膜，否则部分菌膜未受处理，亦可造成假象。
4.乙醇脱色是关键，如脱色过度，则G+菌被误染成G-菌；脱色不足，G-菌被误染成G+菌。
5.染色要用处于活跃生长期的幼龄培养物，如菌龄过长，死亡或细胞壁受损的G+菌也会成阴性反应。
七、实验结果
根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。
八、混合方式的革兰氏染色（了解）
对于初学染色的同学，用于经验不足，特别是脱色掌握不好，往往容易将革兰氏阳性菌误认为革兰氏阴性菌，为了避免出现差错，可以将菌体与典型的革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌混合后染色，再观察结果，就可以避免错误。在进行这个实验中，选用的用来混合的菌种应该在形态上与未知菌株有较大差异，而且实验者对选用的对照菌种的形态比较熟悉。
九、思考题
1. 为什么必须用培养24h以内的菌进行革兰氏染色？
2. 要得到正确的革兰氏染色结果，必须注意哪些操作？哪一步是关键？为什么？
实验二+细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察
实验二细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察 1. 目的要求 （1）学习细菌涂片、染色的基本技术及无菌操作技术。 （2）掌握细菌的简单染色法，初步认识细菌的形态特征。 （3）了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。 2. 基本原理 （1）简单染色法 用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观 察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细 菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。 （2）革兰氏染色法 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为 两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类
物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现 红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革 兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或 附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。 脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱 色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不 同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色 的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。 3. 材料及器材 (1) 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌 (2) 革兰氏染色液，载玻片，显微镜等 4. 方法与步骤 Ⅰ涂片取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌 操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。 载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。 Ⅱ干燥室温自然干燥。 Ⅲ固定固定时通过火焰2～3次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。
细菌鉴定及检测方法
细菌鉴定及检测方法 一、启动条件 1、目的样出现坏包，若批次相同，取表现性状相同的任意一包进行细菌初步鉴 定。若批次不同则分别进行细菌初步鉴定。 2、随机样出现坏包，必须进行细菌初步鉴定。 二、胀包 1、记录批次。 2、及时用72%的酒精对样品的外表进行消毒，尽量不损坏封合待以后检查。在 超净台内以无菌操作剪开包装，再避开横竖封处剪开一个圆形或三角形。3、对样品进行微生物划线培养。 3.1采用普通营养琼脂培养基做细菌的划线培养36±1℃、48小时。 3.2分别吸取10毫升样品到两个无菌的小试管中，，分别在80和100℃的水 浴中加热10分钟，冷却用营养琼脂分别做芽孢（36±1℃、72小时） 和耐热芽孢（55±1℃、72小时）的划线培养。 3.3采用普通营养琼脂培养基或快速检测培养基做嗜冷菌/低温菌的划线培 养（4—6℃ 10天或21±0.5℃ 25小时）。 3.4 必须用高盐察氏或虎红琼脂培养基做霉菌和酵母菌的划线培养 （25—28℃ 5--7天） 4、对样品做感官检测。 5、用PH计检测样品的PH值。 6、将样品倒掉，进行包装密封性检查，并进行记录。 7、记录菌落特征。 8、选区不同形态的单一菌落进行坚定。 8.1 革兰氏阴性菌和阳性菌的鉴定： 8.1.1涂片、革兰氏染色、镜检。或结晶紫染色、镜检、氢氧化钾拉 丝试验。 8.1.2革兰氏染色、结晶紫染色方法见《微生物检测》 8.1.3氢氧化钾拉丝试验 在微生物载物片上滴一滴3%氢氧化钾，用接种针从培养皿上的
菌落中挑取微生物，放在氢氧化钾溶液中用力搅拌。7—10秒后，抬 起针头，观察针头和玻片之间是否有丝状物，如果15—20 秒后二者 之间无丝状物，停止搅拌。 判定：无丝状物阳性；有丝状物阴性。 8.2 过氧化氢酶试验（或过氧化氢酶试纸）（产气试验）： 试剂：10%过氧化氢溶液 步骤：在微生物载物片上滴一滴10%过氧化氢，用接种针从培养皿上的菌落中挑取微生物，放在过氧化氢溶液中看是否有气体产生。 判定：产气阳性；不产气阴性。 8.3氧化酶试验 试剂：含1%四甲基双噻二胺和99%的乙醇溶液。 步骤：用上述试剂将一张滤纸浸透（或直接采用氧化酶试纸条），然后进行细菌培养物的涂片试验。 判定：30秒内使显色物质变为深蓝色阳性，不变色阴性。 三、酸包 1、发现酸包后，及时将料液快速转入无菌瓶中。 2、记录批次 3、其它项目检测同胀包。
细菌形态学检查法二
细菌形态学检查法（二） 三、染色标本的检查细菌标本经染色后，不仅能清晰地看到细菌的形态、大小及排列方式，还可根据染色结果将细菌进行分类。染色标本与周围环境在颜色上形成鲜明对比，可在普通光学显微镜下进行观察。一般形态学检查均需染色。 （一）常用染料用于细菌染色的染料，大部分是人工合成的含苯环的有机化合物，在其苯环上带有色基和助色基。色基赋予化合物颜色，助色基可增加色基与被染物的亲和力。助色基有的为碱性（如一NH2），有的为酸性（如一0H），因此助色基的性质决定染料的酸碱性。常用染料一般均难溶于水，易溶于有机溶剂，实验室配制时通常制成盐类水溶液。 1?碱性染料常用的碱性染料有碱性亚甲蓝、结晶紫及碱性复红等，这些染料电离后色基带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。多数细菌等电点（pl）在2?5 之间，在中性、碱性以及弱酸性环境中都带负电荷，易被碱性染料着色，故细菌学检查中常用此类染料。 2.酸性染料常用的有伊红、酸性复红及刚果红等，这些染料电离后色基带负电荷，不易与细菌结合，不常用于细菌染色。必要时可降低菌液的pH，使细菌带正电荷，方可着色。 3.中性染料是碱性染料与酸性染料的复合物，如瑞氏染液中的伊红亚甲蓝、吉姆萨染液中的伊红天青等，可用于较特殊染色技术。 （二）常用的细菌染色法根据所用染料是一种还是多种，细菌染色法分为单染色法和复染色法。单染色法是用一种染料染色，细菌涂片染成同一颜色，可观察到形态、大小及排列等特点，但不能显示细菌染色特性。复染色法是用两种或两种以上染料进行染色，将不同细菌或同一细菌的不同结构染成不同颜色。复染色法不仅可以观察细菌的形态结构，还可根据染色反应鉴别细菌，故又称鉴别染色法。临床常用的主要有革兰染色和抗酸染色。 革兰染色本法是细菌学检验中最经典、最常用的染色方法，沿用至今已有百余年历史，是一种包括初染、媒染、脱色和复染的鉴别染色技术。通过此染色法，可将细菌分为革兰阳性（G +）菌和革兰阴性（G —）菌两大类，并可初步识别细菌，缩小范围，有助于进一步鉴定。有时结台细菌特殊形态结构及排列方式，对病原茵可做出初步鉴定。革兰染色的原理至今尚未完全清楚，有以下几种学说：① 细胞壁学说：G+菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入，G—菌细胞壁结构较疏松，肽聚糖层少，脂质含量多，乙醇易渗入；②等电 点学说：G+菌的等电点低（pl 2?3）, G—菌等电点较高（pl4?5），在相同pH 条件下，G+菌所带负电荷比G —菌多，与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固且不易脱色；⑧化学学说：G+菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐，可与结晶紫和碘牢固地结合成大分子复合物，不易被乙醇脱色，G —菌细胞内含极少量的核糖核酸镁盐，吸附染料量少，形成的复合物分子也较小，故易被乙醇脱色。目前认为，细胞壁结构与化学组成上的差异是染色反应不同的丰要原因。
细菌的染色检查法
作细菌染色检查，首先要制备细菌涂片。制备细菌涂片一般包括涂片、干燥、固定三步。1．涂片：取洁净玻片一张，按以下步骤操作 肉汤培养物涂片： ①右手拿接种环的黑色胶柄部分，左手托持试管。 ②接种环以15°角置于酒精灯的外焰中烧灼灭菌，直至金属丝烧红(图1-3)，然后将金属柄部也回旋通过火焰烧灼灭菌。 ③用右手小指和手掌小鱼肌侧拔掉左手所持试管的棉塞，并立即火焰烧灼试管口灭菌。 ④用已灭菌冷却的接种环伸入试管中取出菌液(图1-4)。注意勿使沾有菌液的接种环触及试管壁及试管口。 ⑤再次灭菌试管口，将棉塞在火焰上略加烧灼（时间要短，以免点燃棉塞），塞好棉塞，放回原处。 ⑥将接种环上之菌液涂于载玻片上，制成的菌膜直径约1cm左右。然后将接种环用火焰烧灼灭菌。为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。液体标本（如脓液、痰液等）均可照此法涂片斜面培养物涂片： 用细菌斜面（或平板）培养物涂片，需预先取一接种环无菌生理盐水置于载玻片上，然后再按上述无菌操作法从斜面培养物上取少量菌苔，放入生理盐水内轻轻研匀，制成直径lcm左右的菌膜。 如有多个标本行同一方法染色时，可用蜡笔在玻片上划出数格，做好标记再分别进行涂片，以免混淆。 2、干燥： 涂片最好在室温中自然干燥，如需加速干燥，可将标本向上小心地放置离火焰半尺高处，略烘促使干燥，切不可在火焰上烧干。 3、固定： 常用加热固定法。涂片干燥后，让玻片有菌膜的面向上，在火焰的最热部分迅速通过三次。固定之目的是使细菌蛋白变性，菌体牢固黏附于玻片上，还可杀死细菌，改变菌体对染料的通透性。 以上步骤完成后，便可进行各种染色。
细菌简单染色法.
简单染色 微生物染色原理 简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷(酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷)，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着。染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。 常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。 使用草酸铵结晶紫染色液，染色迅速，着色深，菌体呈紫色。 步骤 1、涂片 1.取一块干净的载玻片，平放，在载玻片中央滴一小滴生理盐水； 2.用接种环无菌操作从琼脂斜面上挑取适量菌苔； 3.将挑取的菌苔沾入载玻片中央生理盐水中混匀并涂成薄膜。 注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。 2、干燥 将涂好菌膜的载玻片平放在室温下自然干燥。也可用电吹风低温吹干。 3、固定 手持(木夹夹住)已干燥的涂有菌膜的载玻片，涂面朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次。 原理：加热使细菌细胞的蛋白质凝固，从而固定细菌细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。 注意：热固定温度不宜过高，否则会改变甚至破坏细胞形态。 4、染色 将热固定的细菌涂片平放于在载玻片架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。 染色时间：吕氏碱性美蓝染色1~2min；石炭酸复红染色约1min；草酸铵结晶紫染色约1min。 5、水洗 将细菌涂片上染液倒入废液缸中；手持细菌染色涂片，置于废液缸上方，用洗瓶中自来水冲洗涂片，直至流下的水无色为止。 注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜过急，过大，以免涂片薄膜脱落。 6、干燥 自然干燥：平放于室温，自然干燥； 吹干：用电吹风冷风或低温热风吹干； 吸干：平放在一张吸水纸上，上面覆盖一张吸水纸，将细菌涂片两面水分吸干。 配方 1、吕氏碱性美蓝染液 溶液A 美蓝0.6克；95%乙醇30毫升 溶液B 氢氧化钾0.01克；蒸馏水100毫升 分别配制溶液A和B 配好后混合即可。
细菌的革兰氏染色法及形态观察
细菌的革兰氏染色法及形态观察 一、实验目的 1．了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 2．学习掌握革兰氏染色技术，巩固学习光学显微镜油镜的使用方法。 二、基本原理 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。革兰氏染色属于最重要的鉴别染色。一般认为革兰氏染色结果的主要原因是由于这两类细菌的细胞壁的结构和化学组成不同。革兰氏阳性菌细胞壁较厚（20-80nm)，主要成分为肽聚糖，网状结构紧密。而革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖层较薄（2-3nm)，主要成分是脂蛋白和脂多糖。细菌经过初染和媒染，在细胞内形成深紫色的结晶紫-碘复合物，当用酒精脱色时细胞壁脱水，阳性细菌细胞壁的肽聚糖层网状结构孔径收缩以至关闭，阻止不溶性复合物结晶紫-碘的逸出，这样使菌体呈蓝紫色。阴性菌脂类物质溶解，结晶紫－碘复合物随之被洗脱出，用复染剂复染后菌体呈复染后的红色。 三、实验器材 1．菌种大肠杆菌、藤黄八叠球菌约24小时营养琼脂斜面培养物。 2．仪器普通生物显微镜显微镜 3．材料载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、滤纸、酒精灯、接种环等 4．染料草酸钱结晶紫染色液、路哥氏（Lugol）碘液、95％乙醇、0.5 %番红染色液 四、实验流程 涂片→干燥→固定→初染1min→水洗→媒染1min→水洗→脱色10-30s→水洗→复染1min→水洗→滤纸吸干→镜检。 五、操作步骤 1．涂片 取洁净的载片一张，将其在火焰上微微加热，除去上面的油脂，冷却，在中央部位滴加一小滴生理盐水，用接种环在火焰旁从斜面上挑取少量菌体与水混合。烧去环上多余的菌体后，再用接种环将菌体涂成直径1cm 的均匀薄层，以淡淡的乳白色为宜。制片是染色的关键，载片要洁净，不得玷污油脂，菌体才能徐布均匀。注意初次涂片，取菌量不应过大，以免造成菌体重叠。 2．干燥 涂布后，待其自然干燥或在酒精灯上方稍微加热，切勿靠近火焰。 3．固定 将已干燥好的涂片标本向上，在微火上以钟摆速度通过3-4次进行固定。固定的作用为：a.杀死细菌；b.使菌体蛋白质凝固，菌体牢固粘附于载片上，染色时不被染液或水冲掉；c.增加菌体对染料的结合力，使涂片易着色。
细菌形态学检查法(一)
细菌形态学检查法（一） 细菌形态学检查是细菌检验的重要方法之一，不仅可以为后续的进一步检验提供参考依据，更重要的是可以通过细菌形态学检查迅速了解标本中有无细菌及菌量的大致情况；对少数具有典型形态特征的细菌可以作出初步诊断，为临床选用抗菌药物治疗起到重要的提示作用。临床标本的细菌形态学检查方法主要包括染色标本和不染色标本的检查。 一、显微镜 细菌体积微小，必须借助显微镜放大后才能观察。细菌的一般形态结构可用光学显微镜观察，而细菌内部的超微结构则需用电子显微镜观察。 1．普通光学显微镜普通光学显微镜以可见光作为光源，波长0.4～0.7μm，最大分辨率0．2μm，约为波长的一半。人肉眼能分辨的最小距离是0．2mm，因此用油镜放大1000倍，0．2μm的微粒即被放大到肉眼可见的0．2mm。一般细菌都大于0．μm，故可用普通光学显微镜进行观察。 2．暗视野显微镜暗视野显微镜是在普通光学显微镜上装暗视野聚光器，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，背景视野变暗，菌体发亮。观察时黑暗的背景中可见到发亮的菌体，明暗反差提高了观察效果，常用于不染色标本的动力及运动状况检查。 3．荧光显微镜荧光显微镜以高压汞灯作为光源，能发出280～600nm波长的光线，主要在365～435nm之间。根据使用荧光素的不同选择不同波长的光线作为激发光。因其波长比可见光短，故分辨率高于普通光学显微镜。细菌预先经相应的荧光素处理，然后置荧光显微镜下激发荧光，在暗色背景中可见到发荧光的菌体。用于观察细菌的结构及鉴别细菌。 4．相差显微镜相差显微镜是利用相差板的光栅作用，在普通光学显微镜基础上配制特殊相差板，采用特殊相差目镜制成。当光线透过标本时，标本不同部位因密度不同，引起光位相差异，相差板的光栅作用改变直射光的光位相和振幅，把光位相差异转为光强度差异，从而显示细菌不同部位的差异。多用于不染色活细菌的形态、内部结构及运动方式的观察。 5．电子显微镜电子显微镜以电子流代替光源，其波长与可见光相差几万倍，因而分辨能力得到极大提高，能分辨1am的微粒。目前使用的电子显微镜有透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)两类。TEM可用于观察细菌、病毒的超微结构；SEM主要适合对细菌、病毒等表面结构及附件和三维立体图像的观察。电子显微镜观察须经特殊制片，无法观察活体微生物，因而在微生物学检验中不常使用。 二、不染色标本的检查
细菌的简单染色法和革兰氏染色法 1
细菌的简单染色法和革兰氏染色法 陈慧霞食品13102班201313040201 一引言 1.学习并掌握细菌简单染色法的原理和方法。 2. 掌握革兰氏染色法的原理和操作技术，进一步巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。 二实验原理 1.简单染色法 用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。 一般情况下，细菌细胞通常带负电荷，易于和带正电荷的碱性染料结合而被染色。因此，常用碱性染料进行简单染色。 常见的碱性染料有亚甲蓝、甲基紫、结晶紫、碱性复红、中性红、孔雀绿和番红等。 2.革兰氏染色法 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。革兰氏染色的原理主要是因为两类细菌的细胞壁成分和结构不同。革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时， 脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫－碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了番红的颜色，因此呈现红色。而革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖的含量多且交联度大，类脂质含量少，当用乙醇处理时，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，使
结晶紫－碘复合物被保留在细胞内而不易着色，因此，细胞仍保留初染时的颜色即呈现紫色。 细菌先经碱性染料结晶紫染色，再经碘液媒染（以增加染料与细胞的亲和力）后，用乙醇脱色，再用番红染色。不被脱色而保持原颜色者为革兰氏阳性菌（G+）；被脱色后又被染上复染剂的颜色者为革兰氏阴性菌（G-）。 三实验材料 1简单染色法 菌种：枯草芽孢杆菌 试剂与器材：复红，接种环，酒精灯，打火机，载玻片，吸水纸。2革兰氏染色法 菌种：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌 染液：结晶紫染液，碘液，95%乙醇，番红染液，香柏。 器材和试剂：洗净的载玻片，显微镜，酒精灯，接种环，擦镜纸，吸水纸，镊子，玻璃废液缸，蒸馏水等。 四实验步骤 1.无菌操作： 1.关闭窗户和风扇 2.用酒精棉双手表面消毒 3.接种环取菌前后焚烧灭菌 4.棉塞靠近火焰不离手 5.实验在酒精灯附近进行 6.少说话 2.简单染色法： ●准备玻片：取清洁干净的载玻片。 ●涂片：滴一小滴无菌水于玻片中央，用接种环取枯草芽孢杆菌少 许，与玻片上无菌水混匀，并涂成适当大小的薄层涂片。
微生实验报告 2012.10.10 实验一 细菌的简单染色和革兰氏染色
微生实验报告 姓名： xx 专业年级：2011级生物技术 学号：1032 实验二细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的 学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法的实验原理和实验操作。 二、实验原理 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电何，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红、或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多的易被乙醇溶解的类脂质，增加了细胞壁的通透性，使处染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔
径缩小，通透性降低，草酸铵结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细菌仍保留处染时的紫色。 三、实验器材 1、菌种： 金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。 2、染色剂和试剂： 草酸铵结晶紫染液，卢哥氏碘液，95%酒精，番红复染液，复红染液，吕氏美蓝染液，显微镜擦拭液（乙醚： 乙醇=7:3），xx柏油。 3、器材： 废液缸，洗瓶，载玻片，接种环，酒精灯，擦镜纸，双层瓶，显微镜。 四、实验方法 （一）简单染色 1．涂片： 取干净载玻片一片，在载玻片的左右各加一滴生理盐水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块将刚制成的金黄色葡萄球菌浓菌悬液挑1~2环涂在左边制成薄的涂片，将大肠杆菌的浓菌悬液取1~2环涂在右边制成薄涂片。亦可直接在载玻片上制薄的涂片，注意取菌不要太多。 2．晾干： 让涂片自然晾干。 3．固定：
三细菌的简单染色与形态观察
实验三细菌的简单染色与形态观察 一、目的要求： 1.了解并掌握细菌简单染色的机理及技术； 2.学会用油镜观察细菌细胞的形态。 二、实验材料： 1.菌种：枯草杆菌Bacillus subtilis、大肠杆菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌StapHyloccus aureus等培养好的细菌斜面； 2.染料：结晶紫 3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸。 三、基本原理： 染色是细菌学上一个重要而基本的操作技术。因细菌细胞小而且透明，当把细菌悬浮于水滴内，用光学显微镜时，由于菌体和背景没有显著的明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易识别其结构，所以，用普通光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助于颜色的反衬作用，可以更清楚地观察到细菌的形状及其细胞结构。 用于微生物染色的染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。发色基团赋予化合物的颜色特征，助色基团则给予化合物能够成盐的性质。染料通常都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类。在微生物染色中，碱性染料较常用，如常用的美蓝、结晶紫、碱性复红、沙黄、孔雀绿等都属于碱性染料。 简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性和弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料电离后带有正电荷，很容易与菌体结合使细菌着色。 通过本实验，学习和掌握细菌的染色技术，了解细菌细胞的形态，巩固课堂知识，增加感性认识。 四、方法与步骤： （一）制片 1.涂片：在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴蒸馏水，用接种环以无菌操作从枯草芽孢杆菌 斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜，涂布面积约1~1.5cm2。 2.干燥：室温自然干燥 3.固定：手执载玻片一端，使涂菌一面向上，通过火焰2~3次。此操作也称热固定，其目 的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在玻片上。 4.染色：将涂片置于水平位置，滴加结晶紫染色液（以刚好覆盖涂片薄膜为宜），染色1min 左右。 5.水洗：倾去染液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲洗在涂菌 处，直至载片上流下的水无色为止。 6.干燥：自然干燥，或用电吹风吹干，也可用滤纸吸干，注意不要檫掉菌体。 7.镜检：待标本片完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再 用油镜观察。
细菌的简单染色
实验二细菌的简单染色、革兰氏染色 虽然各种类型的显微镜能够观察到微生物的各种形态结构，但一般实验室常用的是普通光学显微镜。由于细菌体积小且透明，在活体细胞内又含有大量的水分，因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有显著的明暗差，难于看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。而经过染色，就可借助颜色的反衬作用比较清楚地看到菌体形态，亦即菌体表面及内部结构着色与背景形成鲜明对比，这样便可在普通光学显微镜下清晰地观察到微生物的形状和结构，而且还可以通过不同的染色反应来鉴别微生物的类型和区分死、活细菌等，因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。 本实验通过对细菌的染色观察，使同学们在掌握细菌染色技术的基础上，了解各种其他的染色制片技术；观察微生物的各种形态结构，以巩固课堂知识，增强感性认识。 一、目的要求 1．学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。 2．巩固显微镜的使用方法。 二、基本原理 1.简单染色法：所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。 在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐，它可被电离成正、负离子： 带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystal violet）、碱性复红（basicfu-chsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。 细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。 2.革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。 G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染
实验二 革兰氏染色法
实验二革兰氏染色法 【实验目的】 1.学习并初步掌握革兰氏染色法。 2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 3.巩固显微镜油镜的使用方法。 【实验仪器、材料】 1.菌种：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌菌液。 2.染色剂：革兰氏染色试剂盒（结晶紫染色液、碘液、脱色液（95%乙醇）、复红染液）。 3.仪器及其他物品： 显微镜、香柏油、无水乙醇、载玻片、擦镜纸、滤纸、酒精灯、试管架、废液缸、记号笔、接种环、镊子、打火机等。 【实验内容】 革兰氏染色法 一、染色标本制备 1.涂片取一张洁净的载玻片，滴加少许生理盐水，用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，与生理盐水研磨均匀，做一薄而均匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。（事先在载玻片的反面滴加菌液的相应位置做好标记） 2.干燥于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥。(温度不宜过高) 3.固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常
用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。 二、染色 l.初染滴加结晶紫覆盖菌膜，染lmin，自来水缓缓冲洗，甩去积水。 2.媒染滴加卢氏碘液，染lmin，水洗，甩去积水。 3.脱色滴加95%乙醇数滴，20s~30s，见紫色脱下立即用水冲洗，甩去积水。 4.复染滴加石炭酸复红液，染lmin，水洗，甩去积水，标本片用滤纸吸干。 三、镜检 待染色片充分干燥后，用油镜观察。 【实验结果】 葡萄球菌呈葡萄状排列，呈紫色，为革兰氏阳性菌； 大肠杆菌为散在的短小杆菌，呈红色，为革兰氏阴性菌。 注：绘图展示染色结果 【结果分析、讨论（结论与评价）】 注：分析你的染色结果是否正确？如果不正确，请分析原因。
微生实验报告 2012.10.10 实验一 细菌的简单染色和革兰氏染色
微生实验报告 姓名：王晶晖 专业年级：2011级生物技术 学号：040312011032 实验二细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的 学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法的实验原理和实验操作。 二、实验原理 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电何，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红、或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多的易被乙醇溶解的类脂质，增加了细胞壁的通透性，使处染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，草酸铵结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细菌仍保留处染时的紫色。 三、实验器材 1、菌种：金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。 2、染色剂和试剂：草酸铵结晶紫染液，卢哥氏碘液，95%酒精，番红复染液，复红染液，吕氏美蓝染液，显微镜擦拭液（乙醚：乙醇=7:3），香柏油。 3、器材：废液缸，洗瓶，载玻片，接种环，酒精灯，擦镜纸，双层瓶，显微镜。 四、实验方法 （一）简单染色 1．涂片：取干净载玻片一片，在载玻片的左右各加一滴生理盐水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块将刚制成的金黄色葡萄球菌浓菌悬液挑1~2环涂在左边制成薄的涂片，将大肠杆菌的浓菌悬液取1~2环涂在右边制成薄涂片。亦可直接在载玻片上制薄的涂片，注意取菌不要太多。 2．晾干：让涂片自然晾干。 3．固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰（通常2~3次）固定（具体温度以不烫手为宜）。 4．染色：将固定过的涂片加复红染色1~2min 5．水洗：用水洗去涂片上的染色液。 6．干燥：将吸过地涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。 7．镜检：先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上滴加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌形态。 （二）革兰氏染色
简单染色法与革兰氏染色法
简单染色法与革兰氏染色法 （一）细菌的简单染色法 1 目的 1.1 学习微生物涂片、染色的基本技术。 1.2 掌握细菌的简单染色法。 1.3 初步认识细菌的形态特征，巩固学习油镜的使用方法和无菌操作技术。 2 原理 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。 染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。 3 材料 3.1 菌种 枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)约24h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌（Escherichia coli）24h营养琼脂斜面培养物。 3.2 染色剂 吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)，石炭酸复红染液。 3.3 仪器或其他用具 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，玻片搁架、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)，擦镜纸，生理盐水或蒸馏水等。 4 流程
革兰氏染色法的过程及原理
革兰氏染色法的过程及原理一，过程 1 ．涂片将培养的不同菌分别作涂片(注意涂片切不可过于浓厚)，干燥、固定。固定时通过火焰l 一 2 次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2 ．染色 ( 1 )初染加草酸铰结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 ( 2 )媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 ( 3 )脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95 ％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20 一30 秒钟，立即用水冲净酒精。 ( 4 )复染用番红液染1 一2 分钟，水洗。 ( 5 )镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 ( 6 ) 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。二，原理 革兰氏染色法( Gram stain )不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示：染色反应呈红色(复染颜色) 的称为革兰氏阴性细菌，用G 一表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肤聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫一碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肤聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫一碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液 (番红)的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌：而脱色，不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 青霉素作用机制 干扰细菌细胞壁的合成。青霉素你的结果与细胞壁的成分粘肽结构中德D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可与后者竞争转肽酶，阻碍你粘肽的形成，造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。 溶菌酶与青霉素对细菌细胞壁的作用 溶菌酶作用机制：是一种能水解致病菌种黏 多糖的碱性酶，只要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的B-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物流出而使细菌溶解，溶菌酶还可以和带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA RNA脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活，因此该酶具有抗菌消炎，抗病毒等作用 判断细菌有无鞭毛的方法 电镜观察，鞭毛染色，半固体穿刺培养，菌落形态观察 描述细菌与古细菌在细胞膜上的主要化学区别 在革兰氏阴性菌的表层，有由肽葡聚糖形成的细胞壁，在壁的外面，又有由蛋白质、磷脂质、脂多糖形成的膜层，与里面的细胞质膜相对应，特称此层为细菌外膜。夕卜膜比细胞质膜的磷脂质含量低，但脂多糖的含量则比较高。夕卜膜的蛋白质与细胞质膜不同，主要部分为数种蛋白质所构成。其主要蛋白质的部分与特异的内面的肽葡聚糖以共价键结合。脂多糖存在于外膜的最外层。在
细菌的简单染色和革兰氏染色
实验细菌的简单染色和革兰氏染色一、目的要求 1、学习制染色片技术，学习简单染色的原理和方法。 2、初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤。 二、实验原理 细菌的菌体很小，活细胞的含水量在80％～90％，因此对光的吸收和反射与水溶液相差不大，所有观察其细胞结构必须染色。根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等。本实验只学习前两种。 简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的，是细菌学上最常用的 鉴别染色法。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 三、实验器材 菌种：培养24小时的大肠杆菌 染色剂和试剂：石炭酸复红染色液，革兰氏染色液(草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等)，香柏油、二甲苯 器材和器皿：显微镜，酒精灯，载玻片，盖玻片，接种环，擦镜纸，吸水纸，火柴，小烧杯，玻片架、试管、小滴管等 四、操作方法 1、简单染色： （1）涂片：取干净的载玻片一块，滴一小滴生理盐水于载玻片中央，严格按无菌操作程序，挑取大肠杆菌于载玻片的水滴中，调匀并涂成薄膜。注意滴生理盐水时不宜过多；涂片必须均匀；涂布面积直径约1.5cm为宜；挑取菌种时切勿将培养基挑破。 （2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。 （3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）（4）染色：将固定过的涂片放在搁架上，加复红染色1-2min。 （5）水洗：染色时间到后，用自来水冲洗，直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流不宜过急，过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。 （6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。 （7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。 2、革兰氏染色： （1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。
细菌革兰氏染色实验报告
细菌革兰氏染色实验报告 细菌革兰氏染色实验报告一、实验目的 1.掌握革兰氏染色的方法 2.熟悉细菌涂片的制备 3.革兰氏染色法进行细菌鉴定 二、实验材料 1.实验仪器 显微镜、酒精灯、载玻片、擦镜纸、接种环,接种针,、试管架、镊子、载玻片夹子、滤纸、滴管 2.实验试剂 草酸铵结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、番红复染液、无菌水,蒸馏水,、香柏油、二甲苯 三、方法与步骤 1.操作方法示意图 ,干燥, ,水, ,水, ,水, ,晾干, 制片——初染———媒染———脱色———复染——镜检 2.操作步骤 ,步骤一, 涂片的制作 (1) 涂片载玻片一张,加一滴生理盐水,取菌研磨均匀 (2) 干燥温室干燥,或置酒精灯高处慢慢烘烤 (3) 固定干燥后的涂片,在酒精灯火焰中通过3次 步骤,二,
初染,滴加草氨酸结晶紫染液覆盖涂菌部位,染色1—2min,后倾去染液,水洗至流出水无色 步骤,三, 媒染,先用碘液冲去残留水迹,在用碘液覆盖1min,倾去碘液,水洗至流出水无色步骤,四, 脱色,将玻片上残留水用吸水纸吸去,在白色背景下用滴管流加95%乙醇脱色,一般20——30s,,当流出液无色时立即用水洗去乙醇。步骤,五, 复染,将玻片上残留水用吸水纸吸去,用番红复染液染色2min ,水洗,吸去残水晾干。 步骤,六, 镜检,像涂片涂菌部位滴加适量香柏油,进行油镜观察【小结】 1. 选用活跃生长期长的菌种染色,老龄的革兰氏阳性菌会被染成红 色,造成假阴性。 2. 涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性 3. 脱色是革兰氏染色是否成功的关键,脱色不够,造成假阳性,脱 色过度造成假阴性。 4. 染色原理 C+菌,胞壁厚,肽聚糖网状分子形成一种透性障,当乙醇脱色时,肽聚糖脱水而孔障缩小,故保留结晶紫—碘复合物在细胞膜上呈紫色 C-菌,肽聚糖层薄,交联松散,乙醇脱色不能使其结构收缩,其脂含量高,乙醇将脂溶解,缝隙加大,结晶紫—碘复合物溶出细胞壁,沙皇复染后呈红色。 【注意事项】 1. 加热时使用载玻片及试管夹,以免烫伤。 2. 使用染液时应避免沾在衣物上
微生物室微镜检查法 sop文件
细菌室SOP文件—显微镜检查法 显微镜检查是细菌鉴定工作中的一重要手段，有助于细菌的初步鉴别，同时对下一步鉴定工作起着重要的指导作用。有时通过形态学检查可得到初步诊断，如痰中的抗酸杆菌和泌尿生殖道分泌物中的淋病奈瑟菌等。显微镜检查有不染色标本检查法和染色标本检查法两种。 1. 不染色标本的检查：不染色标本主要用于检查细菌的动力及运动状况。 1.1压滴法：用接种环取细菌悬液2环，置于清洁载玻片中央，覆上盖玻片，于高倍镜下观察。制片时菌液要适量，不可有气泡，不可外溢。 1.2 悬滴法：取洁净的凹窝载玻片及盖玻片各1块，将凹孔四周的平面上涂上一层凡士林，取一环菌液置盖玻片中央，将凹窝载玻片的凹面向下，对准于盖玻片的液滴上，然后迅速翻转玻片，用小镊子轻压盖玻片使之与凹孔边缘粘紧。镜下观察时先低倍后高倍，不可压碎盖玻片。有动力的细菌可见细菌从一处移到另一处，无动力的细菌呈布朗运动而无位置的改变。螺旋体由于菌体纤细、透明，需用暗视野显微镜观察其形态、活动。 2. 染色标本检查法：通过对标本的制片及染色，能观察细菌的形态、大小、排列、染色特性以及荚膜、芽胞、异染颗粒等结构，有助于细菌的初步鉴定。 2.1快速革兰染色法 2.1.1操作见试剂说明书 2.1.2结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 2.1.3 注意事项：染色关健在于涂片和脱色，涂片不宜过厚，固定不宜过热，脱色不宜过度，菌龄为18～24小时为佳。 2.2抗酸染色法
2.2.1操作见试剂说明书 2.2.2结果：抗酸杆菌呈红色。 2.2.3注意事项：每一张玻片只能涂一份标本且不能在染色缸中染色，以免造成不同标本间的交互污染从而导致阴阳性结果混淆，脱色时间宁长勿短，至无红色液体流下为止。 2.3阿尔培异染颗粒染色法： 2.3.1初染：涂片上滴加第一液染剂（甲苯胺蓝和孔雀绿的乙醇溶液），染3-5分钟，水洗。 2.3.2复染：第二液染剂（碘化钾溶液）染1分钟，水洗。自然干燥后镜检。 2.3.3结果：菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色。 2.3.4注意事项：玻片要清洁，染料需新鲜配制，无沉淀物。注意与标本中的其他杂质相区别。 3.压片镜检，主要观察细菌在组织中的分布。 4.墨汁负染镜检：背景着色而菌体不着色的染色法，用以观察新型隐球菌的宽厚荚膜等。 5.鞭毛染色镜检，观察细菌有否鞭毛、鞭毛的位置、鞭毛的数量，在非发酵菌的鉴定中是一项重要的指标。 6.暗视野镜检：观察一些较微小且有一定结构的微生物，如钩端螺旋体的钩状及螺旋的形态等。 7.制动试验的直接镜检，在标本加入抗血清，观察动力是否被抑制，如霍乱弧菌的制动试验等。 8.荧光镜检，用标有荧光素的物质与检材中的微生物特异结合产生荧光的特点而对微生物作出鉴定。