志贺氏菌的检测
志贺菌检测技术
摘要：志贺氏菌是引起人类肠道疾病常见的病原菌，在我国感染性腹泻病原菌中高居首位。为了能够有效地预防、治疗和控制水或食源性传染病，对水或食品中志贺氏菌的快速检测与鉴定显得十分重要。本文主要介绍了志贺氏菌的各项检测技术及其优缺点，并对志贺氏菌的检验技术进行了展望。
关键词 : 志贺氏菌；检测技术；展望
前言：志贺菌是引起食源性疾病的常见病原。人体在感染后都可能出现恶心、呕吐、腹痛等症状,对于症状不典型者,极容易被误诊为沙门菌、致泻性大肠埃希氏菌或霍乱弧菌感染,影响治疗而导致慢性感染或带菌者,这一方面延误了患者的早期治疗,另一方面扩大了病原体的传播。因此,迫切需要对病因进行准确而快速的诊断。目前,包括我国在内的许多国家对这类致病菌的检验,大多仍沿用传统的细菌培养及鉴定方法,步骤繁琐,检验周期长,远不能满足应对突发公共卫生事件上,及时诊断、结果准确、敏感性和特异性高的要求。
正文
志贺氏菌是一类兼性厌氧、不产生芽孢的革兰氏阴性杆菌。长约2～3μm、宽0.5～0.7μm、杆状或短杆状，不形成荚膜，无鞭毛，多数有菌毛；营养要求不高，能在普通培养基上生长；最适生长温度为37℃，最适 pH 值为 6.4～7.8。志贺氏菌可分解葡萄糖，产酸不产气。VP 实验阴性，不分解尿素，不形成硫化氢，不能利用柠檬酸盐或丙二酸盐作为唯一碳源。
志贺氏菌属细菌的抗原由菌体抗原(O)及表面抗原(K)组成。O 抗原可分为群特异性抗原和型特异性抗原，型特异性抗原可用于区别菌型。K 抗原可以阻止O 抗原与相应抗血清的凝集反应[3]。根据生化反应和O抗原结构的不同，志贺氏菌可以分为痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌。在发展中国家，由福氏志贺氏菌引起的感染性腹泻疾病高居首位。
随着生物实验技术的发展，志贺氏菌的检测和鉴定技术也在不断的完善，大致可分为三大类：常规生化鉴定方法、免疫学方法以及分子生物学方法。其中最为常用的是分子生物学上的常规PCR检测。
常规生化鉴定方法
常规生化检测须经过增殖培养、分离纯化、生化试验、血清学实验等，检验步骤繁琐、耗时长、准确性低，且一次检测完成样品项数较少[5]，不能应对市场需求的快速准确检验方法的要求。但这种方法具有直观、准确、稳定性好且假阳性率低等特点，因此一直被沿用至今。国家标准方法[6]中采用常规生化鉴定方法对志贺氏菌进行检测，整个过程需要4～5d。通过对SS 培养基、Mac 培养基、HE 培养基和MT 培养基进行比较，发现SS 培养基对志贺氏菌的检出率最高。为防止漏检其他菌型，可同时采用Mac 培养基来提高检出率。免疫学方法
免疫学的发展为致病菌的快速检测提供了新方法，同时大大提高了致病菌检测的灵敏性和特异性。除了凝集实验、沉淀实验和补体实验等经典的免疫学检测方法，以免疫学方法为基础建立起来的检测技术也已被应用于志贺氏菌的检测。
酶联免疫技术
酶联免疫技术 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术。建立间接 ELISA 方法以检测检测志贺菌纯培养液，其检出限为105～106CFU/ml；建立双抗夹心 ELISA 方法检测含0.1～1CFU/ml 志贺氏菌的样品在增菌13h 后可检出阳性反应，含1～10CFU/ml志贺氏菌的样品在增菌11h 后可检出阳性；用间接 Dot-ELISA 方法检测志贺氏菌的检出限可达106CFU/ml。E L ISA 法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点，适用于志贺氏菌的快速检测，但ELISA 方法影响因素多，假阳性率高且不易确定，还需要其他方法辅助检测。
SPA协同凝集法
金黄色葡萄球菌A 蛋白(Staphylococcal protein A，SPA)是某些金黄色葡萄球菌细胞壁的一种表面蛋白，具有同人和多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc片段结合的能力。SPA 协同凝集法是用已知标准血清吸附到含A 蛋白的金黄色葡萄球菌表面，使之成为吸附抗体的载体，再以此去诊断相应未知抗原产生的肉眼可见的凝集颗粒。用含A 蛋白丰富的金黄色葡萄球菌菌体与志贺氏菌抗血清在一定条件下混合致敏，让抗体结合到金黄色葡萄球菌细胞壁的A 蛋白上制成SPA 诊断试剂，样品经增菌后即可用SPA 诊断试剂来检验。SPA 协同凝集法在 24～48h 内即可得到检测结果，且检出率高，可作为一种快速灵敏的检验方法。由于SPA 能结合大量抗体，大大提高了灵敏性，缩短了检验周期。
分子生物学方法
以分子生物学为基础建立的众多检测技术以其敏感、快速、高特异等特点成为生物技术革命的新产物,已经应用于食源性致病菌的检测。检测志贺氏菌的分子生物学技术主要
包括：聚合酶链反应、脉冲场凝胶电泳、基因芯片和探针技术等。
聚合酶链式反应
志贺氏菌的传统检测方法耗时长，操作繁琐，已不能满足食品安全控制的需要。分子生物学尤其是 PCR技术的发展给志贺氏菌的快速检测提供了广阔的空间。在此主要介绍用于志贺氏菌检测的常规 PCR 检测方法，实时荧光 PCR 检测方法和多重 PCR 检测方法。常规PCR检测
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是依据DNA 模板模仿体内的复制过程，在体外适合的条件下，以单链DNA 为模板，以人工设计与合成的寡核苷酸为引物，利用热稳定的DNA 聚合酶沿5′→ 3′方向掺入单核苷酸来特异性地扩增 DNA 片段的技术。通过对已知序列DNA 进行扩增，以侵袭性质粒抗原(invasive plasmid)作为检测志贺氏菌的目的基因来设计引物，建立 PCR 检测方法。PCR 检测志贺氏菌的目的基因有ipaB.ipa C、ipa D 和ipa H，还包括set1A.set1B、ial和virA等片段。现将有关文献中报道的用于检测志贺氏菌的引物序列总结于表2－1。
表2－1检测志贺氏菌的引物序列
基于PCR 方法的复合技术
PCR-ELISA 只需要6.5h 即可检测出，当测试大量标本时 PCR-ELISA 所需时间比PCR-琼脂糖凝胶电泳更短。环介导等温扩增法能有效地在2h内检测最低限细菌量中的ipaH基因以检测志贺氏菌。基于PCR 结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术，利用志贺氏菌特异基因序列分别设计特异性引物，复合PCR 扩增产物经DHPLC 技术进行快速检测，从样品制备、增菌到结果报告可在2d 内(26～28h)全部完成。该方法是一种具有高灵敏度、低检测成本、高通量检测新技术。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)又称脉冲式交变电场电泳，是一种用于分离大分子量线状DNA 的电泳技术。通过限制性内切酶消化菌株DNA 来进行细菌分型鉴定，经PFGE 分离，比较染色体限制性内切图谱，经过不同图型间比对来分析同一菌种亚型的不同菌株来源及其变异特点。PFGE 方法是一种非常有效的分子分型技术，是目前进行志贺氏菌流行病学分析最常用的方法之一。采用多重荧光定量PCR技术做基因诊断，并通过PFGE 的分型方法，达到理想的志贺氏菌分型效果。PFGE方法具有分型
能力强，重复性好等特点，能及时查明暴发流行的传染源从而有效控制疫情的蔓延，在志贺氏菌的分子流行病学研究中具有重要作用。虽然这一技术检测成本低，但却存在着反应产物后处理极易受到污染造成假阳性的缺点。
RAPD技术
随机扩增多态性 DNA 技术(random amplified polymorphicDNA，RAPD)是建立在 PCR 基础上的一种可对未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。利用 RAPD 技术建立一套可对水或食品中志贺氏菌进行鉴定的方法，其结果显示，志贺氏菌ipaH引物扩增阳性的细菌经 RAPD 技术进行基因水平的分型，发现同种志贺氏菌株产生基本相同的条带模式，不同种的菌株，甚至同一种菌的不同型间的条带模式存在一定差异。RAPD 技术利用随机引物扩增未知序列DNA，它具有特异性强、操作简便、快速等特点，并且弥补了标准PCR 方法只能应用于已知DNA 序列的不足，可用于水或食品中志贺氏菌的鉴定。
基因芯片
是利用细菌16S rRNA(或16S rDNA)基因作为检测的靶基因，设计针对不同菌属的寡核苷酸探针制备基因芯片，通过杂交检测细菌的种类。基因芯片可以通过以下三种途径应用于肠道致病菌的检测：直接检测致病菌的DNA或RNA；结合多重PCR 对致病菌的毒力因子或者特异性基因进行鉴定；以致病菌核糖体RNA作为检测的靶基因同时检测多种肠道致病菌。设计的基因芯片能够区分沙门菌属、志贺菌属、葡萄菌属和耶尔森菌，对于未知菌落，利用基因芯片能在4h内完成细菌菌属的鉴定。李君文等利用基因芯片技术检测水中常见致病菌获得较高的敏感性，可实现高通量、并行检测，一次实验即可得到全部结果。用一个包括有8 种肠道致病菌中34 种毒力基因的肠道致病菌基因芯片，可以成功地应用于腹泻患者粪便样品中病原菌的鉴定。由于基因芯片技术具有特异性强、敏感性高，操作简便且高效快速等优点，该技术要优于其他分子生物学检测方法。基因芯片技术在肠道致病菌检测中有着巨大的应用价值，具有广阔的应用前景。
基因探针技术
基因探针是从微生物中提取或扩增特异性的DNA片段，纯化后标记上可被检测的指示剂如放射性同位素、荧光物质等，使之成为特异性DN 探针。用决定该微生物特有生理、生化特性并与rRNA互补的rDNA序列来构建特异性的DNA 探针，检测细菌rRNA中的靶序列可大大提高其敏感性。
结论
随着食品安全检测标准的提高，寻找更加快速、准确、便捷的检测技术显得至关重要。志贺氏菌的检测方法很多，各具利弊。随着生物实验技术、免疫学技术以及分子生物学技
术的发展，志贺氏菌的检测和鉴定方法将得到不断地改进和完善，并朝着快速简便、灵敏
性高、特异性强且经济的方向发展。同时，还需建立、健全食品法规，加强食品安全监控，
提高检测技术，使我国相应的法规、标准与国际接轨，特别是使食品快速检测技术达到国
际先进水平。
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食品中乳酸菌地检测
1 围 本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lactic acid bacteria）的检验方法。 本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。 2 规性引用文件 本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 3 术语和定义 3.1 乳酸菌 lactic acid bacteria 一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属（Lactob acillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和链球菌属（Streptococcus）。 4 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 4.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 4.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。 4.3 均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。 4.4 天平：感量0.1 g。 4.5 无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。 4.6 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。 4.7 无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。 5 培养基和试剂 5.1 MRS（Man Rogosa Sharpe）培养基及莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）改良MRS培养基：见附录A中A.1。 5.2 MC培养基（Modified Chalmers 培养基）：见附录A中A.2。 5.3 0.5%蔗糖发酵管:见附录A中A.3。 5.4 0.5%纤维二糖发酵管:见附录A中A.3。 5.5 0.5%麦芽糖发酵管:见附录A中A.3。 5.6 0.5%甘露醇发酵管:见附录A中A.3。 5.7 0.5%水苷发酵管:见附录A中A.3。 5.8 0.5%山梨醇发酵管:见附录A中A.3。
从业人员健康体检沙门氏菌、志贺氏菌检测操作程序
从业人员健康体检沙门氏菌、志贺氏菌检测操作程序 一、目的 本程序用于对从业人员健康体检进行沙门氏菌、志贺氏菌检测等致病菌检测的方法，以规范操作程序，保证检测数据的有效性。 二、适用范围： 本方法适用于从人体粪便中沙沙门氏菌、志贺氏菌的分离、鉴定及保存的梯相关操作。 三、生物安全要求 标本及相应的致病菌操作必须在BSL-2生物安全实验室的生物安全柜中进行。 四、试剂及仪器设备 试剂 采便盒、Cary-Blair运送培养基、亚硒酸增菌液（SF）、改良亚硒酸盐磺绿增菌肉汤（SBG）、沙门志贺培养液、木糖-赖氨酸-脱氧胆酸琼脂（XLD）、麦康凯琼脂、沙门显色培养基、结晶紫沙门培养基（YS）、三糖铁（TSI）、动力-吲哚-尿素培养基（MIU）、沙门氏菌属诊断血清、志贺氏菌属诊断血清、API20E生化试剂条、磁珠菌种保存管 仪器设备 恒温培养箱、微生物鉴定仪 五、采样方法 标本应为新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子，最优标本是转移到Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。肛拭子不是
最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。 粪便标本：应采集自然排出的新鲜粪便，取稀水样、粘血样、脓血样，黏液样部分。盛于清洁、干燥、无吸水性的无菌容器，避免混入尿液、水和其他物质。 肛拭标本：若无法获得粪便（如排便困难或婴幼儿），也可以采用肛拭子，即无菌棉拭子用生理盐水湿润后，插入肛门内4-5cm处〈儿童约2-3cm），同一方向轻轻旋转2-3周。以目测能见到粪便为准。插入Cary-Blair运送培养基。 标本采集后立即送至实验室进行检测，若室温保存，不能超过1h；如不能立即送检，应放入Cary-Blair运送培养基中冷藏条件下24小时内送检。 六、检验程序 七、操作步骤
食品中乳酸菌的检测
1 范围 本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lactic acid bacteria）得检验方法。 本标准适用于含活性乳酸菌得食品中乳酸菌得检验。 2 规范性引用文件 本标准中引用得文件对于本标准得应用就是必不可少得。凡就是注日期得引用文件，仅所注日期得版本适用于本标准。凡就是不注日期得引用文件，其最新版本（包括所有得修改单）适用于本标准。 3 术语与定义 3、1 乳酸菌lactic acid bacteria 一类可发酵糖主要产生大量乳酸得细菌得通称。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）与链球菌属（Streptococcus）。 4 设备与材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其她设备与材料如下： 4、1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 4、2 冰箱：2 ℃～5 ℃。 4、3 均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。 4、4 天平：感量0、1 g。 4、5 无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。 4、6 无菌吸管：1 mL（具0、01 mL刻度）、10 mL（具0、1 mL刻度）或微量移液器及吸头。 4、7 无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。 5 培养基与试剂 5、1 MRS（Man Rogosa Sharpe）培养基及莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）改良MRS培养基：见附录A中A、1。 5、2 MC培养基（Modified Chalmers 培养基）：见附录A中A、2。 5、3 0、5%蔗糖发酵管:见附录A中A、3。 5、4 0、5%纤维二糖发酵管:见附录A中A、3。 5、5 0、5%麦芽糖发酵管:见附录A中A、3。 5、6 0、5%甘露醇发酵管:见附录A中A、3。 5、7 0、5%水杨苷发酵管:见附录A中A、3。 。3、A中A见附录:山梨醇发酵管5%、08 、5． 5、9 0、5%乳糖发酵管:见附录A中A、3。 5、10 七叶苷发酵管:见附录A中A、4 5、11 革兰氏染色液：见附录A中A、5。 5、12莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）：化学纯。 5、13 半胱氨酸盐酸盐（Cysteine Hydrochloride）：纯度＞99%。 6 检验程序 乳酸菌检验程序见图1。
20041126_志贺氏菌属
志贺氏菌属 志贺氏菌属（Shigella）的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌。临床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。 一、生物学性状 志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2-3μm ,宽 m 。不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，有菌毛。DNA的G+C为49-53克分子%（Tm法）。 需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37℃，最适pH为。37℃培养18-24小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2nm，宋内氏菌菌落一般较大，较不透明，并常出现扁平的粗糙型菌落。在液体培养基中呈均匀浑浊生长，无菌膜形成。 本菌属都能分解葡萄糖，产酸不产气。大多不发酵乳糖，仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖。靛基质产生不定，甲基红阳性，VP试验阴性，不分解尿素，不产生H S。根据生化反应可进行初步分类。 2 志贺氏菌属的细菌对甘露醇分解能力不同，可分为二大组。 A、不分解甘露醇组：主要为志贺氏菌。又根据能否产生靛基质，进一步分靛基质阳性（1、3、4、5、6、9、10型）和靛基质阴性（2、7、8型）的志贺氏痢疾菌。 B、分解甘露醇组：包括福氏、鲍氏、宋内氏菌。再按乳糖分解情况，分为迟缓分解乳糖的宋内氏和不分解乳糖的福氏和鲍氏菌。后者进一步再根据靛基质产生与否，分靛基质阳性（福氏菌1、2、3、4、5型和鲍氏菌5、7、9、11、13、15型）和靛基质阴性（福氏菌6型和鲍氏菌1、2、3、4、6、8、10、12、14）二类（见表一） 表一志贺氏菌属生化反应的分类 葡萄糖（+） 甘露醇（-）甘露醇（+） 志贺氏菌志贺氏菌乳糖（-）乳糖（+）（1、3、4、（2、7、8型） 5、6、9、10型）靛基质（-）靛基质（+）靛基质（-） 福氏菌6型福氏菌（1、2、宋内氏菌 鲍氏菌（1、2、 3、4、5型）， 3、4、6、8 鲍氏菌（5、7、9、 10、12、14型） 11、13、15型） 抗原构造与分型：志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原（O）及表面抗原（K）组成。主要抗原有三种。 型特异性抗原：型多糖抗原为菌体抗原的一种，是光滑型菌株所含有的重要
志贺氏菌检测
志贺氏菌检测
3.12 西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录中12。 3.13 粘液酸盐培养基：见附录中13。 3.14 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录中14。 3.15 志贺氏菌属诊断血清。 3.16 生化鉴定试剂盒。 4 操作步骤 4.1 增菌 以无菌操作取检样25g（ml），加入装有灭菌225ml志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均质器以8000r/min～10000r/min均质；或加入装有225ml 志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式均质器连续均质1min～2min，液体样品振荡混匀即可。于41.5℃±１℃，厌氧培养16h～20h。 4.2 分离 取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36℃±1℃培养20h～24h，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48h再进行观察。志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表1。 表1 志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼 脂平板 志贺氏菌的菌落特征 MAC琼脂无色至浅粉红色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐 XLD琼脂粉红色至无色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐 4.3 初步生化试验 4.3.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种TSI、半固体和营养琼脂斜面各一管，置36℃±1℃培养20h～24h，分别观察结果。
4.3.2 凡是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸（发酵葡萄糖，不发酵乳糖，蔗糖）、不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体）、不产硫化氢、半固体管中无动力的菌株，挑取其4.3.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验和血清学分型。 4.4 生化试验及附加生化试验 4.4.1 生化试验 用4.3.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验，即β-半乳糖苷酶、尿素、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分解试验。除宋内氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌13型的鸟氨酸阳性；宋内氏菌和痢疾志贺氏菌1型，鲍氏志贺氏菌13型的β-半乳糖苷酶为阳性以外，其余生化试验志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。另外由于福氏志贺氏菌6型的生化特性和痢疾志贺氏菌或鲍氏志贺氏菌相似，必要时还需加做靛基质、甘露醇、棉子糖、甘油试验，也可做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属。志贺氏菌属生化特性见表2。 表2 志贺氏菌属四个群的生化特征 生化反应A群：痢疾 志贺氏菌 B群：福氏 志贺氏菌 C群：鲍氏 志贺氏菌 D群：宋内 氏志贺氏 菌 β-半乳 糖苷酶 －a－－a+ 尿素－－－－赖氨酸 脱羧酶 －－－－鸟氨酸 脱羧酶 －－－b+
志贺氏菌检测
志贺氏菌的检验（国标法） 一、增菌 称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃培养6~8h。 培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。 二、分离和初步生化试验 取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板各1个，于36℃培养18~24h。 志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。 挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培养18~24h，分别观察结果。 下述培养物可以弃去： a. 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物； b. 在18~24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物； c. 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物； d. 产气的培养物； e. 有动力的培养物； f. 产生硫化氢的培养物。 凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。 三、血清学分型 挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。 先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查； 如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。 如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。 4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1~15各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3~12型多价血清及各型因子血清检查。 四、进一步的生化试验 在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即： 葡萄糖铵 西蒙氏柠檬酸盐 赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶 pH7.2尿素 KCN生长 水杨苷和七叶苷的分解 除宋内氏菌和鲍氏13型为乌氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。。必要时还应做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。
乳酸菌检测国标方法
乳酸菌检测方法 1 适用范围 本方法适用于清谷田园食品有限公司系列产品及原料中的乳酸菌的检测。 2 设备和仪器 2.1 恒温培养箱：36±1℃ 2.2 天平：感量为0.01g 2.3 无菌吸管：1 ml、2ml、10ml 2.4 无菌锥形瓶：500ml 2.5 无菌培养皿：直径为90mm 2.6 无菌试管：18×180mm 2.9 酒精灯 2.10 立式蒸汽压力灭菌器 2.11 超净工作台 2.12 厌氧缸 3试剂 3.1 无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。 3.2 MRS（Man Rogosa Sharpe）培养基 3.2.1 成分蛋白胨 10.0g 牛肉粉 5.0g 酵母粉 4.0g 葡萄糖 20.0g 吐温80 1.0mL K2HPO4.7H2O 2.0g 醋酸钠.3H2O 5.0g 柠檬酸三铵 2.0g
MnSO4.7H2O 0.2g MnSO4.4H2O 0.05g 琼脂粉 15g 3.2.2制法：将上述成分加于1000mL蒸馏水中，调节PH至6.2±0.2，加热煮沸溶解，分装于锥形瓶中，在121℃高压灭菌15-20min。 3.3莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）和半胱氨酸盐酸盐改良 MRS 培养基： 3.3.1 莫匹罗星锂盐储备液制备：称取50mg莫匹罗星锂盐加入到50 mL蒸馏水中，用0.22 mm微孔滤膜过滤除菌。 3.3.2 半胱氨酸盐酸盐储备液制备：称取250mg莫匹罗星锂盐加入到50 mL 蒸馏水中，用0.22 mm微孔滤膜过滤除菌。 3.3.3 制法 将A.1.1 成分加入到950 mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH，分装后121 ℃高压灭菌15 min～20 min。临用时加热熔化琼脂，在水浴中冷至48 ℃，用带有0.22 mm微孔滤膜的注射器将莫匹罗星锂盐储备液及半胱氨酸盐酸盐储备液制备加入到熔化琼脂中，使培养基中莫匹罗星锂盐的浓度为50 mg/mL，半胱氨酸盐酸盐的浓度为500 mg/mL。 3.4 MC培养基 3.4.1 成分
从业人员健康体检沙门氏菌、志贺氏菌检测操作程序(讨论稿)教学文案
从业人员健康体检沙门氏菌、志贺氏菌检测操作程序(讨论稿)
从业人员健康体检沙门氏菌、志贺氏菌检测操作程序一、目的 本程序用于对从业人员健康体检进行沙门氏菌、志贺氏菌检测等致病菌检测的方法，以规范操作程序，保证检测数据的有效性。 二、适用范围： 本方法适用于从人体粪便中沙沙门氏菌、志贺氏菌的分离、鉴定及保存的梯相关操作。 三、生物安全要求 标本及相应的致病菌操作必须在BSL-2生物安全实验室的生物安全柜中进行。 四、试剂及仪器设备 4.1试剂 采便盒、Cary-Blair运送培养基、亚硒酸增菌液（SF）、改良亚硒酸盐磺绿增菌肉汤（SBG）、沙门志贺培养液、木糖-赖氨酸-脱氧胆酸琼脂（XLD）、麦康凯琼脂、沙门显色培养基、结晶紫沙门培养基（YS）、三糖铁（TSI）、动力-吲哚-尿素培养基（MIU）、沙门氏菌属诊断血清、志贺氏菌属诊断血清、API20E生化试剂条、磁珠菌种保存管 4.2 仪器设备 恒温培养箱、微生物鉴定仪 五、采样方法
5.1 标本应为新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子，最优标本是转移到Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。 5.2 粪便标本：应采集自然排出的新鲜粪便，取稀水样、粘血样、脓血样，黏液样部分。盛于清洁、干燥、无吸水性的无菌容器，避免混入尿液、水和其他物质。 5.3肛拭标本：若无法获得粪便（如排便困难或婴幼儿），也可以采用肛拭子，即无菌棉拭子用生理盐水湿润后，插入肛门内4-5cm 处〈儿童约2-3cm），同一方向轻轻旋转2-3周。以目测能见到粪便为准。插入Cary-Blair运送培养基。 5.4 标本采集后立即送至实验室进行检测，若室温保存，不能超过 1h；如不能立即送检，应放入Cary-Blair运送培养基中冷藏条件下24小时内送检。 六、检验程序
食品微生物学检验 志贺氏菌检验作业指导书
食品微生物学检验志贺氏菌检验 1、范围 适用于食品中志贺氏菌的检验 2、设备和材料 2.1恒温培养箱：36℃±1℃ 2.2冰箱：2℃—5℃ 2.3厌氧培养装置：41.5℃±1℃ 2.4电子天平； 2.5显微镜 2.6均质器； 2.7无菌吸管； 2.8无菌均质杯； 2.9无菌培养皿，直径90mm； 2.10生化鉴定试剂盒； 2.11比浊管及比浊管架； 3、培养基和试剂 3.1志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素 3.2麦康凯琼脂（MAC） 3.3木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂（XLD） 3.4志贺氏菌显色培养基 3.5三糖铁琼脂 3.6营养琼脂平面 4、操作步骤 4.1增菌 以无菌操作取检样25g（mL），加入装有灭菌225mL志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片均质器以8000r/min~10000r/min均质，于41.5℃±1℃厌氧培养16h~20h。 4.2分离 取增菌后的志贺氏菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36℃±1℃培养20h~24h，观察各个平板上生长的菌落形态，若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48h进行观察。志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表1. 表1 志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征
4.3 初步生化试验 (1)自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种TSI.半固体和营养琼脂斜面各一管。置36℃±1℃培养20h～24h，分别观察结果。 (2)凡是三糖铁琼脂中斜面产碱，底层产酸（发酵葡萄糖，不发酵乳糖，蔗糖）.不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体），不产硫化氢，半固体管中无动力的菌株，挑取其5.3.1中已培养的琼脂斜面上长的菌落，进行生化试验和血清学分型。 5、生化试验 (1)生化试验（生化鉴定试剂盒） a.菌悬液的制备 取一支盛有2ml无菌水的试管；用接种针挑取可疑菌落至无菌水中；仔细研磨，与标准浊度管比较，制成0.5个麦氏浊度的均匀菌悬液。 b.接种与培养 用产品中提供的一次性吸管吸取菌悬液依次滴入瓶中（三糖铁需穿刺划线接种，半固体和葡萄糖铵需穿刺接种），每瓶3滴；如特殊说明，培养温度均为36℃±1℃（无需加盖）。 C.结果判定如下：
实验六 食品中志贺氏菌的检验
实验六食品中志贺氏菌的检验 一、实验目的要求 1、了解食品的质量与志贺氏菌检验的意义。 2、掌握志贺氏菌的生物学特性。 3、掌握志贺氏菌检验的生化试验的操作方法和结果的判断。 4、掌握志贺氏菌属血清学试方法。 5、掌握食品中志贺氏菌检验的方法和技术。 二、原理 志贺氏菌属（Shigella）的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌。临床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。所以在食物和饮用水的卫生检验时，常以是否含有志贺氏作为指标。 志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2-3μ m ,宽0.5-0.7μ m 。不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，不运动，有菌毛。志贺氏菌属的主要鉴别特征为：无鞭毛，不运动，对各种糖的利用能力较差，并且在含糖的培养基内一般不产生气体。志贺氏菌的进一步分群分型有赖于血清学试验。 三、试剂和仪器 （一）最先准备的器材 规格名称数量用途 1、500ml广口瓶1个稀释样品 2、500ml三角瓶1个制增菌液 3、250ml三角瓶6个制培养基 4、18×180mm试管8支制三糖铁培养基 5、13×100mm试管40支制蛋白胨水等 6、1ml移液管2支 7、10ml移液管 2 支 8、直径为90 mm平皿12套制SS、EMB平板 9、250ml量筒1支 （二）应灭菌的其它器材 剪刀1把不锈钢汤匙1把称量纸适量 （三）应准备的培养基和试剂 培养基总量所用容器 1.GN 增菌液225ml/瓶1瓶500ml三角瓶 2.EMB培养基100ml/瓶1瓶250ml三角瓶 3.SS琼脂100ml/瓶1瓶250ml三角瓶
志贺氏菌属诊断血清说明书
志贺氏菌属诊断血清学试验操作程序 1.目的 制定标准化的志贺氏菌属诊断血清操作程序，指导对志贺氏菌属的检测2.原理 用志贺氏菌属的代表菌株制成灭活菌抗原分别或混合免疫家兔所得的血清，经吸收出去非特异性凝集素后制成，通过凝集试验原理诊断各型志贺氏菌。3.试剂及实验设备 3.1志贺氏菌属诊断血清：宁波天润生物药业有限公司生产的规格为22种的志 贺氏菌属诊断血清 3.2试剂保存：2~8°C避光保存，防止冻结，在有效期内使用。 3.3实验设备：玻片、吸样枪、接种环、水浴箱、玻璃管、血平板、营养琼脂、 电热高温接种灭菌器。 4.程序步骤 4.1将诊断血清于冰箱取出后平衡至室温。 4.2选择符合志贺氏菌属培养特性，并经初步生化检测符合志贺菌属生物特性的 疑似菌落。 4.3菌群分析 将经18~24h血平板上纯培养的待检菌，分别用志贺氏菌属4种多价血清做玻片凝集试验，凝集阳性时，再分别用群多价血清做玻片凝集试验，群多价血清凝集阳性时，再分别与相应的单价血清做玻片凝集试验，最终确定其血清分型。如果志贺氏菌属4种多价血清做玻片凝集试验均为阴性，可能有以下3种可能性：①K抗原的存在，处理方法：取待检菌的纯菌落于生理盐水中制成浓度约2麦氏单位的菌悬液，置于100°C水浴中煮沸30min，泠却至室温后再用诊断血清进行玻片凝集试验；②非典型菌落，处理方法：通过在营养琼脂平板上的传代让其恢复抗原性，再用诊断血清进行玻片凝集试验；③诊断血清型以外的可送市或省CDC检测。 4.4玻片凝集试验法取18~24h血平板上纯培养的待检菌，用生理盐水制成2麦 氏单位的菌悬液，取诊断血清20μL于洁净玻片上，然后取20μL待检菌悬
食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验(编制说明)
《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》 (征求意见稿)编制说明 一、标准起草的基本情况（包括简要的起草过程、主要起草单位、起草人等） 1、任务来源 受国家卫生和计划生育委员会食品安全标准与监测评估司委托，根据《中华人民共和国食品安全法》和国务院部署，按照《食品安全国家标准整合工作方案（2014年- 2015年）》的原则要求，按照国家卫生和计划生育委员会食品安全标准与监测评估司的工作安排，对该标准进行整合。标准整合项目编号为ZHENGHE-2014-408和ZHENGHE-2015-408。 2、标准起草单位、协作单位、主要起草人 本标准起草单位为：国家食品安全风险评估中心； 主要起草人为：徐进、董银苹、李志刚、杜春明、王伟。 3、简要起草过程 （1）2014年7月标准整合人员进行了实地学习、交流，对整合原则、技术要求和实施细则进行了讨论，2014年12月底完成数据的汇总。 （2）2014月10月31日武汉第一届食品安全国家标准评审委员会检验方法与规程分委会第十五次会议上审评委员会专家对乳酸菌标准进行了讨论，并提出了完善建议。 （3）根据初审意见继续完善标准文本。2015月5月11日起草组在南宁标准研讨会上对形成的标准文本再次进行了讨论。 （4）提交《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》（征求意见稿）、《编制说明》供公开征求意见。 二、标准的重要内容及主要修改情况 1、标准的制（修）订与起草原则 （1）与国际接轨的原则，该标准的起草内容主要参考了以下ISO方法： ISO 8261：Milk and milk products — General guidancefor the preparation of test samples, initial suspensions and decimal dilutions formicrobiological examination ISO 7889：Yghurt-Eumeration of characteristic microorganisms-Clony-count technique at 37℃ISO 20128: Milk products- Eumeration of presumptive lactobacillus acidophilus on a selective medium- Clony-count technique at 37℃
志贺氏菌检测
志贺氏菌检测 1 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱：36℃±1℃； 冰箱：2℃～5℃； 膜过滤系统； 厌氧培养装置：℃±1℃； 电子天平：感量0.1g； 显微镜：10×～100×； 均质器； 振荡器； 无菌吸管：1ml（具刻度）、10ml（具刻度）或微量移液器及吸头；无菌均质杯或无菌均质袋：容量500ml； 无菌培养皿：直径90mm； pH计或pH比色管或精密pH试纸； 全自动微生物生化鉴定系统。 2 培养基和试剂 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：见附录中1。 麦康凯（MAC）琼脂：见附录中2。 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）琼脂：见附录中3。 三糖铁（TSI）琼脂：见附录中4。 营养琼脂斜面：见附录中5。 半固体琼脂：见附录中6。 葡萄糖铵培养基：见附录中7。 尿素琼脂：见附录中8。 β-半乳糖苷酶培养基：见附录中9。 氨基酸脱羧酶试验培养基：见附录中10。 糖发酵管：见附录中11。 西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录中12。
粘液酸盐培养基：见附录中13。 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录中14。 志贺氏菌属诊断血清。 生化鉴定试剂盒。 4 操作步骤 增菌 以无菌操作取检样25g（ml），加入装有灭菌225ml志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均质器以8000r/min～10000r/min均质；或加入装有225ml志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式均质器连续均质1min～2min，液体样品振荡混匀即可。于℃±１℃，厌氧培养16h～20h。 分离 取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36℃±1℃培养20h～24h，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48h再进行观察。志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表1。 表1 志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 初步生化试验 4.3.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种TSI、半固体和营养琼脂斜面各一管，置36℃±1℃培养20h～24h，分别观察结果。 4.3.2 凡是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸（发酵葡萄糖，不发酵乳糖，蔗糖）、不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体）、不产硫化氢、半固体管中无动力的菌株，挑取其中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验和血清学分型。 生化试验及附加生化试验 4.4.1 生化试验
乳酸菌测试方法
食品微生物学检测乳酸菌检测方法 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 1.1恒温培养箱：36℃±1℃ 1.2冰箱：2℃~5℃ 1.3均质器及无菌均值袋、均质杯或灭菌乳钵 1.4天平：感量0.1g 1.5无菌试管：18mm?180mm、15mm?100mm 1.6菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.01mL刻度）或微量移无 液器及吸头 1.7无菌锥形瓶：500mL、250mL 1.样品制备 2.1样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。 2.2冷冻样品可先使其在2℃~5℃条件下解冻，时间不超过8h，也可在温 度不超过45℃的条件下解冻，时间不超过15min。 2.3固体和半固体食品：以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL生理 盐水的无菌均质杯内，于8000r/min~10000r/min均质1min~2min，制成1:10样品匀液；或置于225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min制成1:10样品匀液。 2.4液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放
入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1:10的样品匀液。 操作步骤 3.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于 装有9mL生理盐水的无菌试管中（注意吸头尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌试管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。 3.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增 样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。 2.乳酸菌总数： 根据待检样品活菌总数的估计，选择2个~3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL样品匀液分别置于2个MRS琼脂平板，使用L形棒进行表面涂布。36℃±1℃，厌氧培养48h±2h后计数平板上所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在15min内完成。 3.菌落计数： 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。 5.1选取菌落数在30CFU~300CFU之间、无蔓延菌落成长的平板计数菌落 总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平板均数。 5.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌
127食品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌检验记录
食品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌检验记录 样品编号： 第 页/共 页 样 品 名 称 样 品 批 号 样 品 数 量 样 品 性 状 包 装 情 形 收 样 日 期 年 月 日 检 测 环 境 温度： ℃ ； 湿度（RH ）： % 检 验 日 期 年 月 日 检 测 地 点 □净化室 □BSL-2 完 成 日 期 年 月 日 检 验 项 目 □沙门氏菌 □志贺氏菌 □金黄色葡萄球菌 检 测 依 据 □GB 4789.4-2010 □G B 4789.5-2012 □GB 4789.10-2010 检 测 仪 器 □电子天平（型号：BSA2202S ） □隔水式恒温培养箱（型号：GHP-9270）36℃ □隔水式恒温培养箱（型号：GHP-9050）42℃ □厌氧罐 □无菌均质器（型号：Scientz-04）中速 时间 □1分钟 □2分钟 培 养 基 □BPW □TTB □SC □沙门显色琼脂 □BS 琼脂 □HE 琼脂 □XLD 琼脂 □TSI 琼脂 □志贺氏菌肉汤 □MAC 琼脂 □API20E 生化鉴定试剂盒（法国梅里埃公司） □7.5%NaCl 肉汤 □金葡显色琼脂 □B-P 琼脂 □血平板 □血浆凝固酶试剂 （其余为北京路桥公司产品） 样 品 制 备 □固体和半固体样品： 无菌称取25g 样品放入盛有225ml 灭菌（BPW 、志贺氏菌肉汤、7.5%NaCl 肉汤） 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1mi n ～2min 。 □液体样品：无菌吸取25ml 样品于225ml 灭菌（ BPW 、志贺氏菌肉汤、7.5%NaCl 肉汤）中，充分混匀。 □根据样品性质，用无菌4%或40%NaOH 调节样品匀液的pH 值在6.5~7.5之间 步骤及结果： 1、沙门氏菌 前增菌/增菌 （温度和时间） 分离培养 菌落形态 生化试验 选择性平板 ℃ h TSI API20E 结果 %BPW ℃，h ： 日 时 分至 日 时 分 二增菌 ℃ h ： 日 时 分至 日 时 分 显色平板 结果报告： □XLD □HE 标准菌株 2、志贺氏菌 增菌 （温度和时间） 分离培养 菌落形态 生化试验 选择性平板 ℃ h TSI API20E 结果 % 志贺菌肉汤 （厌氧培养） ℃ h ： 日 时 分 至 日 时 分 显色平板 结果报告： □MA C □XLD 标准菌株 3、金黄色葡萄球菌 增菌和分离培养 菌落形态 鉴定 7.5%NaCl 肉汤 ℃， h ： 日 时 分 至 日 时 分 选择性平板 ℃ h 镜检 凝固酶试验 B-P 平板 血平板 标准菌株 结果报告： 其它： 检验者： 审核者： 年 月 日
实验一、乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物检验文档
实验一、乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物检验 一、实验目的 1.了解酸乳中乳酸菌分离原理 2. 学习并掌握乳酸菌饮料中乳酸菌菌数的检测方法。 二、实验原理 活性酸奶需要控制各种乳酸菌的比例，有些国家将乳酸菌的活菌数含量作为区分产品品种和质量的依据。 由于乳酸菌对营养有复杂的要求，生长需要碳水化合物、氨基酸、肽类、脂肪酸、酯类、核酸衍生物、维生素和矿物质等，一般的肉汤培养基难以满足其要求。测定乳酸菌时必须尽量将试样中所有活的乳酸菌检测出来。要提高检出率，关键是选用特定良好的培养基。采用稀释平板菌落计数法，检测酸奶中的各种乳酸菌可获得满意的结果。 三、实验材料 1.培养基 改良MC培养基(Modified Chalmers培养基) 2.仪器和器具 无菌移液管（25ml,1ml），无菌水（225ml带玻璃珠三角瓶，9ml试管），无菌培养皿，旋涡均匀器。 恒温培养箱。 四、实验方法 流程：酸奶→稀释→制平板→培养→检查计数 1.样品稀释 先将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品25ml加入盛有225ml无菌水的三角瓶中，在旋涡均匀器上充分振摇，务必使样品均匀分散，即为10-1的样品稀释液，然后根据对样品含菌量的估计，将样品稀释至适当的稀释度。 2.制平板 选用2~3个适合的稀释度，培养皿贴上相应的标签，分别吸取不同稀释度的稀释液1ml置于平皿内，每个稀释度作2个重复。然后用溶化冷却至46℃左右的改良MC 培养基倒平皿，迅速转动平皿使之混合均匀，冷却成平板。
3.培养和计数 将平皿倒置于40℃恒温箱内培养24~48h，观察长出的细小菌落，计菌落数目，按常规方法选择30~300个菌落平皿进行计算。 五、结果 1.指示剂显色反应 乳酸菌的菌落很小，1~3mm，园形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色。由于产酸菌落周围能使CaCO3产生溶解圈，酸碱指示剂呈酸性显色反应。2.镜检形态 必要时，可挑取不同形态菌落制片镜检确定是乳杆菌或乳链球菌。保加利亚乳杆菌呈杆状，成单杆、或双杆菌或长丝状。嗜热链球菌，呈球状，成对、或短链、或长链状。 3.计数结果 公式：平均菌落数×稀释倍数 八、思考 1.为什么乳酸菌的检测关键是选用特定良好的培养基？ 2.培养基中为什么要加CaCO3？ 实验二、发酵制品中大肠菌群的测定 一、实验目的 1、学习食品中大肠菌群检测程序、方法； 2、掌握食品中大肠菌群检测结果的报告方式。
志贺氏菌检测新国标要求厌氧条件增菌的解决方案.
志贺氏菌新国标要求厌氧条件增菌的解决方案 最新发布的志贺氏菌国标GB_4789.5-2012(食品安全国家标准_食品微生物学 检验_志贺氏菌检验方法即将于2012年7月17日实施,新国标中关于增菌部分有重大改变,要求在厌氧条件下增菌过夜,由于增菌通常在500mL三角瓶或均质袋中进行,这就对所有检测志贺氏菌的政府检测机构和企业提出更高的硬件要求。 由于志贺氏菌是兼性厌氧菌,此次国标变更增菌方法为厌氧条件下增菌,目的是想在增菌时抑制部分好氧菌的生长,提高志贺氏菌的检出率,提出灵敏度。 很多微生物工作者在讨论用什么方法来实现厌氧增菌,由于增菌时可采用三角瓶、试剂瓶或均质袋,放在何种容器中进行增菌,要根据样品容量、增置设备的承受能力等各种因素进行综合考虑。 现本人给广大有检测志贺氏菌需求的客户推荐几种解决方案: 1 大培养空间的方案—各种大型厌氧工作站,如英国DWS公司的A35新型厌氧工作站(带触摸屏:适合每日检测量大于50个样品/以上的检测机构和企业。可以方便转入三角瓶(瓶子高度要求小于185mm和均质袋,内部培养空间至少可以放置60个500mL三角瓶,提供精确的温度、湿度和气体控制,触摸屏控制系统。 2中等培养空间的方案—各种紧凑型厌氧培养箱,如DG250厌氧工作站:适合每日检测量20-30个左右的检测机构和企业。提供精确的温度、湿度和气体控制。 3最小培养空间的方案—各类厌氧罐系统,如Jar Gassing system(厌氧罐气体控制系统:适合每日检测量小于10个的检测机构。样品放入厌氧罐中(可选放一个瓶 子或4个瓶子的厌氧罐,通过抽真空和充混合气体,将内部的氧气降至1%左右,然后通过混合气体中的氢气,在钯催化条件下将微量的氧气反应生成水,达到厌氧条件。此方案只提供抽真空和充气系统及厌氧罐,客户需要将厌氧罐放入其它培养箱中培养。
食品乳酸菌检验原始记录
食品乳酸菌检验原始记录 样品编号：检验开始时间：年月日 样品名称：检验完成时间：年月日 检测项目：乳酸菌数检测依据：GB 4789.35-2016 以无菌操作称取25g样品,置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内,均质1min~2min,制成1∶10样品匀液；液体样品:液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分振摇,制成1∶10的样品匀液。用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头,按上述操作顺序,做10倍递增样品匀液,每递增稀释一次,即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。 1 双歧杆菌计数 选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后,将冷却至48℃的莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良的 MRS培养基倾注入平皿约15mL,转动平皿使混合均匀。36 ℃±1 ℃厌氧培养72h±2h，培养后计数。 计算及结果：双歧杆菌数（CFU/g,ml）： 2 嗜热链球菌计数 选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取 1mL 样品匀液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后,将冷却至48℃的 MC培养基倾注入平皿约15mL,转动平皿使混合均匀。36℃±1℃需氧培养72h±2h,培养后计数。 计算及结果：嗜热链球菌数（CFU/g,ml）： 3 乳杆菌计数 选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后,将冷却至48℃的 MRS琼脂培养基倾注入平皿约15mL,转动平皿使混合均匀。 电子天平编号：使用状况试验前：试验后： 培养箱编号：使用状况试验前：试验后： 检测人：校核人：审核人： 样品编号： 36℃±1℃厌氧培养72h±2h，培养后计数。
志贺氏菌属及检验
志贺氏菌属及检验 志贺氏菌属（Shigella）的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌。临床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。 一、生物学性状 志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2-3μ m ,宽0.5-0.7μ m 。不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，有菌毛。DNA的G+C为49-53克分子%（Tm法）。 需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37℃，最适pH为6.4-7.8。37℃培养18-24小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2nm，宋内氏菌菌落一般较大，较不透明，并常出现扁平的粗糙型菌落。在液体培养基中呈均匀浑浊生长，无菌膜形成。 本菌属都能分解葡萄糖，产酸不产气。大多不发酵乳糖，仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖。靛基质产生不定， S。根据生化反应可进行初步分类。 甲基红阳性，VP试验阴性，不分解尿素，不产生H 2 志贺氏菌属的细菌对甘露醇分解能力不同，可分为二大组。 A、不分解甘露醇组：主要为志贺氏菌。又根据能否产生靛基质，进一步分靛基质阳性（1、3、4、5、 6、9、10型）和靛基质阴性（2、 7、8型）的志贺氏痢疾菌。 B、分解甘露醇组：包括福氏、鲍氏、宋内氏菌。再按乳糖分解情况，分为迟缓分解乳糖的宋内氏和不分解乳糖的福氏和鲍氏菌。后者进一步再根据靛基质产生与否，分靛基质阳性（福氏菌1、2、3、4、5型和鲍氏菌5、7、9、11、13、15型）和靛基质阴性（福氏菌6型和鲍氏菌1、2、3、4、6、8、10、12、14）二类（见表一） 抗原构造与分型：志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原（O）及表面抗原（K）组成。主要抗原有三种。 型特异性抗原：型多糖抗原为菌体抗原的一种，是光滑型菌株所含有的重要抗原。当菌株变为粗糙型时，此抗原也常随之消失，各菌型所含的型抗原不同，可用于区别菌种的型别。 群特异性抗原：为光滑型菌株的次要抗原，也是菌体抗原的一种。特异性较低，常在数种近似的菌内出现。在福氏菌株中，由于所含群抗原不同，可将某些菌型分为多种亚型，如福氏菌2型，根据群抗原不同，
志贺氏菌的检测
图书分类号： 密级： 毕业设计(论文) 志贺氏菌的检测方法SHIGELLA DETECTION METHOD 学生姓名冯圣军 学院名称食品生物工程学院 专业名称生物技术及应用 指导教师李文 2010年4月18日
徐州工程学院学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用或参考的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标注。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名：日期：年月日 徐州工程学院学位论文版权协议书 本人完全了解徐州工程学院关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：本校学生在学习期间所完成的学位论文的知识产权归徐州工程学院所拥有。徐州工程学院有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的纸本复印件和电子文档拷贝，允许论文被查阅和借阅。徐州工程学院可以公布学位论文的全部或部分内容，可以将本学位论文的全部或部分内容提交至各类数据库进行发布和检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 论文作者签名：导师签名： 日期：年月日日期：年月日
摘要 志贺氏菌是引起人类肠道疾病常见的病原菌，在我国感染性腹泻病原菌中高居首位。为了能够有效地预防、治疗和控制水或食源性传染病，对水或食品中志贺氏菌的快速检测与鉴定显得十分重要。本文主要介绍了志贺氏菌的各项检测技术及其优缺点，并对志贺氏菌的检验技术进行了展望。 关键词志贺氏菌；检测技术；展望
Abstract Shigella is a common disease caused by human intestinal bacteria, pathogens of infectious diarrhea in China topped the rankings. In order to effectively prevent, treat and control water or food-borne diseases, water or food in Shigella rapid detection and identification is very important. This paper describes the Shigella detection technology and its strengths and weaknesses, and Shigella inspection techniques were reviewed. Keywords Shigella detection methods food safety