微生物学实验技术指导书

实验须知

普通微生物学实验课的目的是，训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基础知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验；培养学生观察、思考、分析问题、解决问题和提出问题的能力；养成实事求是、严谨认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公物的作风。

为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项：

1.每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。

2.认真、及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。

3.实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。

4.实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导老师，及时处理，切勿隐瞒。

5.实验过程中，切勿使乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。

6.使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。

7.每次实验完毕后，必须把所有仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石碳酸液覆盖0.5小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前需浸泡在3%来苏尔液中进行消毒。

8.每次实验需进行培养的材料，应标明姓名、组别及处理方法，放于教师指定的仪器内培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。

9.每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表中，力求简明准确，认真回答思考题，并及时汇交教师批阅。

10.实验结束后，整理桌面，物归原处，留人打扫室内卫生。

11.离实验室前，将手洗净，注意关闭火、煤气、灯、水管等。

微生物学实验室常用器皿

微生物学实验所用的器皿，大多要进行消毒、灭菌后用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。玻璃器皿一般要求硬质玻璃，才不受高温和短暂的烧灼而不至破裂；玻璃器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；玻璃器皿的形状和包装方法要求能防止污染杂菌为准；洗涤玻璃器皿的方法不当，也会影响实验的结果。目前国外微生物学实验室中，有些玻璃器皿（如培养皿、吸管等）已被一次性塑料制品所代替，但玻璃器皿仍是重要的实验室用具。本节将主要对玻璃器皿做详细介绍，同时也对接种或转移微生物工具做相应的说明。

一、器皿的种类、要求与应用

1.试管（test tube）

微生物学实验室所用玻璃试管，其管壁必须比化学实验室用的厚些，这要在塞棉花塞时管口才不会破损。试管的形状要求没有翻口（图Ⅰ-1，A），不然，微生物容易从棉塞与管口的缝隙间进入试管造成污染，也不便于盖试管帽。有的实验要求尽量减低蒸发试管内的水分，则需要使用螺口试管，盖以螺口胶木塞或塑料帽（图Ⅰ-1，B，C）。培养细菌一般用金属（如铝）帽或棉塞（图Ⅰ-1，D，E）。也有的用泡沫塑料塞。

试管的大小可根据用途的不同，准备下列三种型号：（1）大试管（约18mm 3180mm），可盛倒平板用的培养基；亦可作制备琼脂斜面用（需大量菌体时用）和盛液体培养基用于微生物的振荡培养；（2）中试管（约13-15mm3100-150mm），盛液体培养基培养细菌或作琼脂斜面用，亦可用于细菌、病毒等的稀释和血清学试验；（3）小试管（10-12mm3100mm），一般用于糖发酵或血清学试验，和其他需要节省材料的试验。

2.德汉氏小管（Durhamtube）

观察细菌在糖发酵培养基内产气情况时，一般在小试管内再套一倒置的小套管（约6mm336mm），（图Ⅰ-2，A）。此小套管即为德汉氏小管，又称发酵小套管。

3.小塑料离心管，又称Eppendorf管（图Ⅰ-2，B）。有1.5ml和0.5ml两种型号，主要用于微生物分子生物学实验中，小量菌体的离心、DNA（或RNA）分子的检测、提取等。

4.吸管（pipette）

（1）玻璃吸管（glass pipette）和吸气器（aspirator）

①玻璃吸管

微生物学实验室一般要准备1、5、10ml的刻度玻璃吸管。这种吸管一般有两种类型，一种是称之为血清学吸管（serological pipette），这种吸管刻度指示的容量包括管尖的液体体积，使要将所吸液体吹尽（图Ⅰ-3，A）；另一种类型

称之为测量吸管（measuring pipette），这种吸管刻度指示的容量不包括管尖的液体体积，使用时不能将所吸液体吹尽，而是到达所设计的刻度为止（图Ⅰ-3，B）。

除有刻度的吸管外，有时需用不计量的毛细吸管，又称滴管（图Ⅰ-3，C）来吸取动物体液和离心上清液以及滴加少量抗原、抗体等。

②吸气器

在使用刻度玻璃吸管时，一般可采用几种不同的吸气器。图Ⅰ-4中的三种类型目前都有市售。使用时，将吸管插入吸气器下端，通过旋动转盘键（图Ⅰ-4，A中的a），或按图Ⅰ-4，B中的不同部分（b、c、s），或按图Ⅰ-4，C中的d、e 键来吸取或释放液体。如果嘴吸，则一定要在吸管上端塞有棉花。

用刻度吸量管取液体的体积时，以液体的凹面为准（图Ⅰ-3，D）。

（2）微量吸管（micropipette）又称微量加样器，主要用来吸取微量液体，规格型号很多，图Ⅰ-5表示其中的一种型号。每个微量吸管在一定范围内可调节几个体积，并都标有使用范围，例如：0.5～10μl、2～10μl、10～100μl、100～1000μl等。使用时：①将合适大小的塑料嘴（tip）牢固地套在微量吸管的下端；②旋动调节键（图Ⅰ-5，A），使数字显示器上（图Ⅰ-5，B）显示出所需要吸取的体积；③用大拇指按下调节键（图Ⅰ-5，C），并将吸嘴插入液体中；

④缓慢放松调节键，使液体进入吸嘴，并将其移至接收试管中；⑤按下调节键，使液体进入接收管；⑥按下排出键，以去掉用过的空吸嘴或直接用手取下吸嘴。

除了可调的微量吸管外，也有不可调的，即一个吸管只固定一种体积。因应用范围受到限制，所以一般用得较少。

5.培养皿（petri dish）

常用的培养皿（图Ⅰ-6），皿底直径90mm，高15mm，皿底皿盖均为玻璃制成，但有特殊需要时，可使用陶器皿盖，因其能吸收水分，使培养皿表面干燥。例如测定抗生素生物效价时，培养皿不能倒置培养，则用陶器皿盖为好。

在培养皿内倒入适量固体培养基制成平板，可用于分离、纯化、鉴定菌种，活菌计数以及测定抗生素、噬菌体的效价等。

6.三角烧瓶（erlenmeyer flask）与烧杯（beaker）

三角烧瓶有100、250、500和1000ml等不同的大小，常用来盛无菌水、培养基和振荡培养微生物等。常用的烧杯有50、100、250、500和1000ml等，用来配置培养基与各种溶液等。

7.注射器（injector）

一般有1、2、5、10、20、25ml不同容量的注射器。注射抗原于动物体内，可根据需要使用1、2、5ml的；抽取动物心脏血或绵羊静脉血可采用10、20、50ml的。

微量注射器有10、20、50、100μl等不同的型号。一般在免疫学或纸层析、电泳等实验中滴加微量样品时应用。

8.载玻片（slide）与盖玻片（coverslip）

普通载玻片大小为75mm325mm，用于微生物涂片、染色、做形态观察等。盖玻片为15mm318mm。

凹玻片是在一块较厚玻片的当中有一圆形凹窝（图Ⅰ-7），做悬滴观察活细菌以及微室培养用。

9.双层瓶（double bottle）

由内外两个玻璃瓶组成（图Ⅰ-8），内层小锥形瓶放香柏油，供油镜头观察微生物时使用，以瓶盛放二甲苯，用以擦净油镜头。

10.滴瓶（dropper bottle）

用来装各种染料、生理盐水等（图Ⅰ-9）。

11.接种工具

接种工具有接种环（inoculating loop）、接种针（inoculating needle）、接种钩（inoculating hook）、接种铲（inoculating shovel）、玻璃涂布器（glass speader）等（图Ⅰ-10）。制造环、针、钩、铲的金属可用铂或镍，原则是软硬适度，能经受火焰反复灼烧，又易冷却。接种细菌和酵母菌用接种环和接种针，其铂丝或镍死直径以0.5mm为适当，环的内径为约2-4mm，环面应平整。

图Ⅰ-11表示一个简易地制作接种环的方法。接种某些不易与培养基分离的放线菌和真菌有时用接种钩或接种铲，其丝的直径要粗一些约1mm。用涂布法在琼脂平板上分离单个菌落时需用玻璃涂布器，是将玻璃棒弯曲（图Ⅰ-12）或将玻璃棒一端烧红后压扁而成。

二、玻璃器皿的清洗方法

清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，因此，玻璃器皿的清洗是实验前的一项重要准备工作。清洗方法根据实验目的、器皿的种类、所盛的物品、洗涤剂的类别和玷污程度等的不同而有所不同。现分述如下：

1.新玻璃器皿的洗涤方法

新购置的玻璃器皿含游离碱较多，应在酸溶液内先浸泡数小时。酸溶液一般用2%的盐酸或洗涤液（见附录Ⅶ）。浸泡后用自来水冲洗干净。

2.使用过的玻璃器皿的洗涤方法

（1）试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯等可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。热的肥皂水去污能力更强，可有效地洗去器皿上的油污。洗衣粉和去污粉较难冲洗干净而常在器壁上附有一层微小粒子，故要用水多次甚至十次以上充分冲洗，或可用稀盐酸摇洗一次，再用水冲洗，然后倒置于铁丝框内或有空心格子的木架上，在室内晾干。急用时可

盛于框内或搪瓷盘上，放烘箱内烘干。

玻璃器皿经洗涤后，若内壁的水均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，若挂有水珠，则还需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗。

装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。带菌的器皿在洗涤前先浸在2%煤酚皂溶液（来苏水）或0.25%新洁尔灭消毒液内24小时或煮沸0.5小时，再用上法洗涤。带病原菌的培养物应先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。

盛放一般培养基用的器皿经上述方法洗涤后，即可使用，若需精确配置化学药品，或做科研用的精确实验，要求自来水冲洗干净后，再用蒸馏水淋洗三次，晾干或烘干后备用。

（2）玻璃吸管吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液的玻璃吸管（包括毛细吸管），使用后立即投入盛有自来水的量筒或标本瓶内（量筒或标本瓶底应垫有脱脂棉花，否则吸管投入时容易破损），免得干燥后难以冲洗干净，待实验完毕，再集中冲洗。若吸管顶部塞有棉花，则冲洗前先将吸管尖端与装在水龙头上的橡皮管连接，用水将棉花冲出，然后再装入吸管自动洗涤器内冲洗，没有吸管自动洗涤器的实验室，可用冲出棉花的方法多冲洗片刻，必要时再用蒸馏水淋洗。洗净后放搪瓷盘中晾干，若要加速干燥，可放烘箱内烘干。

吸过含有微生物培养物的吸管亦应立即投入盛有2%煤酚皂溶液，或0.25%新洁尔灭消毒液的量筒或标本瓶内，24小时后方可取出冲洗。

吸管的内壁如果有油垢，同样应先在洗涤液内浸泡数小时，然后再行冲洗。

（3）载玻片与盖玻片用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸5-10分钟，用软布或脱脂棉花擦拭，立即用自来水冲洗，然后再稀洗涤液中浸泡0.5-2小时，自来水冲去洗涤液，最后用蒸馏水换洗数次，待干后浸于95%乙醇中保存备用。使用时在火焰上烧去乙醇。用此法洗涤和保存的载玻片与盖玻片清洁透亮，没有水珠。

检查过活菌的载玻片与盖玻片应先在2%煤酚皂溶液或0.25%的新洁尔灭消毒液中浸泡24h，然后按上述洗涤与保存。

三、空玻璃器皿的包装

1.培养皿的包装

培养皿常用旧报纸密密包紧，一般以5-8套培养皿作一包，少于5套工作量太大，多于8套不易操作。包好后行干热或湿热灭菌。如将培养皿放入金属（不锈钢）筒内进行干热灭菌，则不必用纸包，金属筒有一圆筒型的带盖外筒，里面放一装培养皿的框架（图Ⅰ-13），此框架可自圆筒内提出，以便装取培养皿。

2.吸管的包装

准备好干燥的吸管，在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段约1.5cm长的棉花，以免使用时将杂菌吹入其中，或不慎将微生物吸出管外。棉花要塞得松紧恰当（过紧吹吸液体太费力；过松吹气时棉花会下滑），然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的近左端，与报纸约成45°（图Ⅰ-14），并将左端多余的一段纸覆折在吸管上，再将整根吸管卷入报纸，再将右端多余的报纸打一小结。如此包好的很多吸管可再用一张大报纸包好，进行干热灭菌。

如果有装吸管的铜或不锈钢筒（图Ⅰ-15），亦可将分别包好的吸管一起装入筒内，进行灭菌；若预计一筒灭菌的吸管可一次用完，亦可不用报纸包，而直接装入筒内灭菌，但要求吸管尖朝筒底。使用时，将筒卧放在桌上，用手持粗端抽出。

3.试管和三角烧瓶等的包装

试管管口和三角烧瓶瓶口塞以棉花塞（做棉塞的方法见实验十六）或泡沫塑料塞，然后在棉花塞与管口和瓶口的外面用二层报纸以细线包扎好（如果能用铝箔则更好，可省去用线扎且效果好）。进行干热或湿热灭菌，试管塞好塞子后也可一起装在铁丝篓中，用大张报纸或铝箔将一篓试管口做一次包扎，包纸的目的在于保存期避免灰尘侵入。

空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若用湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎，外面最好加一层牛皮纸或铝箔。

实验一、显微镜的构造及使用方法

一、目的要求

（1）了解显微镜的构造、性能及成像原理。

（2）掌握显微镜的正确使用及维护方法。

二、实验器材

（1）显微镜、擦镜纸。

（2）酵母菌示教标本。

三、普通光学显微镜简介

对于微生物，使用肉眼难以直接观察其形态结构，只有借助于显微镜，才能对它们进行研究和利用。因此显微镜是必不可少的工具。为了充分发挥显微镜的工作性能，首先必须了解每一部件的结构和功能，通过反复使用，熟练地掌握其操作技术。

显微镜可分为电子显微镜和光学显微镜两大类。后者包括：明视野显微镜、暗视野显微镜、差相显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜、紫外显微镜及立体显微镜等。其中以明视野显微镜常用，其它显微镜都是在此基础上发展而来的，基本结构相同，只是在某些部分做了一些改变。明视野显微镜简称显微镜。

（一）显微镜的构造

光学显微镜的基本构造可分为机械系统和光学系统两大部分（图1-1）。

1.机械系统

（1）镜座（Base）：在显微镜的底部，呈马蹄形、长方形、三角形等。

（2）镜壁（Arm）：连接镜座和镜筒之间的部分，呈圆弧形，作为移动显微镜时的握持部分。

（3）镜筒（Tube）：位于镜壁上端的空心圆孔，是光线的通道。镜筒的上端可插入接目镜，下面与转换器相连。镜筒的长度一般为160mm。显微镜分为直筒式或斜筒式，有单筒式的也有双筒式的。

（4）转换器（Nosepiece）：位于镜筒下端，是一个可以旋转的圆盘。有3-4个孔，用于安装不同放大倍数的接物镜。

（5）载物台（Stage）：是支持被检标本的平台，呈圆形或方形。中央有孔可透过光线，台上有用来固定标本的夹子和标本移动器。

（6）调焦旋钮：包括粗调焦旋钮（Coarse adjustment knob）和细调焦旋钮（Fine adjustment knob），是调节镜筒或载物台上下移动的装置。

2.光学系统

（1）接物镜（Objective lens），常称为镜头，简称为物镜，是显微镜中最重要的部分，由许多快透镜组成。其作用是将标本上的待检物进行放大，形成一个倒立的实像，一般显微镜有3-4个物镜，根据使用方法的差异可分为干燥系和

油浸系两组。干燥系物镜包括低倍物镜（4-10X）和高倍物镜（40-45X），使用时物镜与标本之间的介质是空气；油浸系物镜（90-100X）在使用时物镜和标本之间加有一种折射率与玻璃折射率几乎相等的油类物质（如香柏油）作为介质，在物镜上经常标有两组数字（图1-2）。

（2）接目镜（Eyepiece lens）：通常称为目镜，一般由2-3块透镜组成。其作用是将由物镜所造成的实像进一步放大，并形成虚像而反映于眼帘。目镜上也刻有表示放大倍数的标志，如8X、10X、16X，一般显微镜的标准目镜是10X，小于10X的目镜用得不多。

（3）聚光镜（Condenser）位于载物台的下方，有两个或几个透镜组成，其作用是将由光源来的光线聚成一个锥形光柱。聚光器可以通过位于载物台下方的聚光器调节旋钮进行上下调节，以求得最适光度。聚光器还附有虹彩光圈（Iris diaphragm），借此调节锥形光柱的角度和大小，以控制进入物镜的光的量。

（4）反光镜：反光镜是一个双面镜，一面是平面，另一面是凹面。起着把外来光线变成平行光线进入聚光镜的作用。使用内光源的显微镜就不需反光镜。

（5）光源：日光和灯光均可，以灯光较好，其光色和光强都比较容易控制，有的显微镜采用装在底座内的内光源。

（二）显微镜的成像原理

显微镜的放大作用是由物镜和目镜共同完成的。标本S经物镜L

O

放大后，

在目镜L

E 的焦平面上形成一个倒立的实像I

1

，再经目镜L

E

的进一步放大形成一

虚像I

2

，被人的眼睛E所观察到（图1-3）。

（三）显微镜的性能

1.分辨力和数值口径

显微镜的分辨力（Resolving power）是指显微镜将样品中相互接近的两点清晰的分辨出来的能力。它主要取决于物镜的分辨率，物镜的分辨率是所用光的波长和物镜的数值口径的函数。分辨力用镜头所能分辨出的两点间最小距离表示，距离越小分辨能力越好，其关系如下：

D=λ/(2 N.A)

其中λ-入射光的波长

N.A -物镜的数值口径

D-显微镜的分辨率

从式中可见，减少入射光的波长可以提高分辨能力，但由于可见光波长范围比较窄（约为0.38-0.77μm），利用紫外光源只适用于显微摄影而不能用于直接观察。因此提高分辨率的最好方法是增加数值口径。

物镜的数值口径（Numberical aperture）简写为（N.A）：表示从聚光器发出的锥形光柱照射在观察的标本上，能被物镜所聚集的量。它由下式决定：

N.A=n2sinθ

式中n-标本和物镜之间介质的折射率

θ-由光源投射到透镜上的光线和光轴之间的最大夹角（图1-4）。

光线投射到物镜的角度越大，数值口径就越大。该角度的大小取决于物镜的直径和焦距。以空气为介质时（n=1.00），数值口径不超过1，如果采用一些高折射率的物质作介质，如使用油镜时采用香柏油作介质，则数值口径增大，从而提高分辨能力。各种物质的折射率见表（1-1）。

表1-1

物镜上标有数值口径。低倍镜（10X）为0.25，高倍镜（40X）为0.65，油浸镜（100X）为1.25。这些数值是在其他条件都适宜的情况下的最高值，实际使用时往往低于所标的值。

聚光镜也有一定的数值口径。常用的阿贝聚光器的N.A值是1.25，有的可达1.40。在聚光器和标本之间加香柏油，也能将数值口径提高。聚光器的N.A 可用虹彩光圈来调节，此值和所用的物镜的N.A值相配合，最好是等于或稍大于物镜的N.A值，以便使进入物镜的光柱的角度达到正好能够均匀照满物镜背面透镜的程度。

2.放大倍数、焦距和工作距离

显微镜的放大倍数是物镜放大倍数和目镜放大倍数的乘积。放大倍数一样时，由于物镜和目镜搭配不同，其分辨力也不同。如数值口径大的40X物镜和5X的目镜相搭配，其分辨率比数值口径小的10X物镜和20X目镜相搭配时要高些。一般说，增加放大倍数应该是尽量用放大倍数高的物镜。物镜的放大倍数越大焦距就越短，物镜和样品之间距离（工作距离）便缩短。在观察时必须注意防止损坏样品或透镜。

（四）显微镜的使用指南

（1）移动显微镜时，要一手握持镜臂，一手托着镜座。

（2）使用时，应通过调整凳子高度，以便能舒适地观察，勿将显微镜倾斜。

（3）在观察标本时，应两眼同时睁开，这样既能同时绘图，又能减少疲劳。

（4）调焦应细心，应采取将物镜调离标本的方法。

（5）用低倍镜时，光圈要适当缩小，以获得较好的对比度。随着放大倍数的增大，所需要光的量也要加大。

（6）镜检时，应首先用低倍镜进行调焦，再换高倍镜，最后用油浸镜进行观察。

（7）保持载物台清洁、无油。除油浸镜外，其他物镜不得接触香柏油。

（8）所有透镜应保持清洁，只能用擦镜纸擦拭镜头，不得用手触摸透镜。

（9）结束后，取下标本片，将油浸镜上的浸油擦拭干净，盖上防尘罩放回箱中。

（10）显微镜发生故障，应及时向指导老师汇报，未经同意，不得随便更换显微镜。

（五）操作步骤

（1）将显微镜平稳地置于实验台上，使其与镜检者间的距离适中，镜检者姿势要端正，一般用左眼观察，右眼用于绘图或记录。

（2）采光：直射的阳光光线过强，会影响物象的清晰，刺激眼睛，反射热会损坏光学装置。一般以间接日光为宜。采用白炽灯为光源时，应在聚光镜下加一蓝色滤光片，除去黄色光。

转动反光镜，使光线集中于聚光器。升降聚光器和调节光圈，以获得合适的光量。用低倍镜观察时，应下降聚光器，缩小光圈；如为染色标本，用高倍镜或油浸镜观察时，应上升聚光器，扩大光圈，以获得最大的光量。

（3）固定标本：将标本固定在载物台上，将预检部位移至物镜正下方。

（4）待检标本须先用低倍镜观察，因低倍镜视野较大，易发现目标和确定观察的位置。转动转换器，将低倍镜转入光路，在转动粗调焦旋钮，使镜筒下降至物镜与标本片之间距离小于工作距离，调节聚光器和光圈，以获得合适的光量，由目镜观察同时用粗调焦旋钮慢慢的升起镜筒，直至物象在视野中出现后，再用细调焦旋钮调节至物象清晰为止，绘图记录，或将合适的目的物移至视野中心，准备用高倍镜观察。

（5）高倍镜观察：显微镜的所有物镜一般是共焦点的，因此用低倍镜对准焦点后将高倍镜转入光路，基本上也是对焦点的，只要稍转动细调焦旋钮即可获得清晰图像。勿忘调节光量。有些简易的显微镜不是共焦点的，或者由于物镜的更换而不能达到共焦点，就要采取上述调焦方法，待获得清晰物象后，观察绘图记录或继续用油浸镜观察。

（6）油浸镜观察：具体操作方法见实验五。

（7）显微镜使用完毕，取下标本片，用绸布擦净显微镜的金属部件，用擦镜纸擦拭镜头。

（8）将各部分复原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成八字形，将镜筒下降至最低位置，同时把聚光器降下。以免与物镜相碰。

（9）罩上显微镜防尘套，将显微镜放回箱中。

四、实验内容

（1）根据讲义内容，对照实物熟悉显微镜的构造。

（2）按显微镜的使用方法，分别用低倍镜和高倍镜对酵母菌示教标本进行

观察。

五、思考题

（1）哪个物镜的工作距离最短？哪个最大？

（2）哪些部件控制着到达物镜的光量？

（3）有哪些方法可以提高显微镜的分辨力？

（4）为什么在高倍镜和油浸镜观察标本之前要先用低倍镜观察？

实验二、酵母菌细胞形态观察、死活细胞的染色鉴别

一、目的要求

1.通过观察了解酵母细胞的形态结构。

2.掌握鉴别酵母细胞死活的染色方法。

二、实验材料

1.菌种：酵母菌菌悬液

2.染料：0.1%的美兰染色液

3.其他：显微镜、载玻片、盖玻片、滴管、擦镜纸、吸水纸等。

三、基本原理

酵母菌细胞较大，不必染色即可用显微镜观察其形态。

用美兰染色液可对酵母细胞进行死活细胞染色鉴别。美兰是一种弱氧化剂，氧化态呈蓝色，还原态呈无色。活的酵母细胞，因新陈代谢的不断进行，具有一定的还原能力，能将进入细胞的美兰还原，而细胞不被染色。因此，用美兰对酵母细胞染色一定时间后，无色的为活细胞，呈蓝色的则为死亡细胞。需要注意的是，一个活酵母菌的还原能力是一定的，必须严格控制染料的浓度和染色时间。

四、方法与步骤

1.酵母菌细胞形态的观察

取洁净的载玻片一块，用滴管取酵母悬浊液滴于载玻片中央，取盖玻片一块，小心的将盖玻片一端与菌液接触，然后缓慢的将盖玻片放下，以避免产生气泡。至此，一片酵母菌水浸标本就制成了。（如图2-1）

先用低倍镜观察，再用高倍镜观察。观察时注意酵母细胞的形状及出芽情况。

2.死活酵母细胞的染色鉴别

取0.1%美兰液一滴，滴在一块洁净的载玻片中央，加一滴酵母菌悬液，混合均匀，染色3-5分钟后加盖玻片制成水浸标本片，镜检。

五、实验内容

1.制片观察所给酵母菌的细胞形态。

2.用美兰液对酵母菌死活细胞进行染色鉴别。

六、实验结果与思考题

1.绘图表示所观察的酵母，注明菌名和放大倍数。

2.用美兰对酵母菌死活细胞进行染色鉴别时，为什么要控制染料的浓度和染色时间？

实验三、酵母菌细胞大小的测定

一、目的要求

了解测量微生物大小的原理，学习并掌握接目测微计的校正方法及微生物大小的测定方法。

二、材料

1.菌种：啤酒酵母菌悬液

2.其他：显微镜、接目测微计、镜台测微计、载玻片、盖玻片。

三、基本原理

微生物细胞个体较小，其大小的测量一般是在显微镜下用专用的测量工具—接目测微计来进行。

接目测微计是一块圆形玻片，其中央刻有精确的等分线。测量时，将其放入目镜的隔板上，也有专用的目镜，里面已安放好接目测微计。由于接目测微计所测量的是微生物经过显微镜放大后所成像的大小，而接目测微计每一小格所代表的实际长度随目镜和物镜的放大倍数而改变，所以，在测量前必须用镜台测微计对接目测微计进行校订，确定此时接目测微计每小格所代表的实际长度，镜台测微计是中央部分刻有精确等分线的载玻片。刻度总长为1mm，被等分成100格，每小格长是1μm，镜台测微计专用于对接目测微计进行标定。

四、方法和步骤

1.接目测微计的标定

（1）取出目镜，旋开其上的透镜，将接目测微计放在目镜的光阑上（有刻度一面向下），然后旋上透镜，插入镜筒。

（2）将镜台测微计固定在显微镜的载物台上，使有刻度的一面向上，不可放反。

（3）将低倍镜转入光路，调准焦距后，转动接目测微计，使两个接目测微计的刻度线相平行，调节镜台测微计，使接目测微计的一条刻度线与镜台测微计的一条刻度线相重合，再寻另一重合线（见图3-1），分别数出其间接目测微计及镜台测微计的格数。计算接目测微计每小格所代表的实际长度。例如：若在两条重合刻度线之间，接目测微计为45格，镜台测微计为10格，那么，此时接目测微计每小格所代表的实际长度=（10格310μm）/45格=2.2μm。

（4）再以高倍镜按上述方法对接目测微计进行标定。

2.酵母菌细胞大小的测定

取下镜台测微计，换上菌体水浸片。用接目测微计测量菌体细胞的长和宽各占几格，然后计算其实际大小。为了尽量减少实验误差，应在同一标本片上进行测量5-10个菌体，取其平均值作为该菌的大小。

五、实验结果

1.接目测微计校正的结果填入下表

2.将酵母菌细胞大小值填入下表

六、思考题

为什么随着显微镜放大倍数的改变，接目测微计每格代表的实际长度也会改变？你能找出这种变化的规律吗？

实验四、酵母菌细胞总数及出芽率的测定

一、目的要求

了解血球计数板的构造，掌握利用血球计数板进行微生物计数的方法。

二、材料

1.菌种：啤酒酵母菌悬液

2.其他：显微镜、血球计数板、滴管、吸水纸、擦镜纸

三、基本原理

利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数法。此法是将经过适当稀释的菌体细胞或孢子悬液，注入血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数的。由于加盖盖玻片之后的血球计数板的计数室的容积是一定的，所以可根据在显微镜下观察到的菌数或孢子数换算成单位体积试样中的菌数。此法所计得数值为死菌与活菌的总和，故又称为总菌计数法。

血球计数板由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成（见图4-1），玻片上有4条凹槽，构成三个平台，中间的平台较宽，其中央又被一短槽分割成两半，每个半边上面各刻有一个方格网。每个方格网被划分为九个大格，其中央大格再划分为若干中格，每个中格的四周刻有双线，作为中格的界限，在显微镜下便于区分。中央大格又称为计数室，微生物计数就在此计数室中进行。

计数室的规格有两种：目前常用的是25316型，其计数室被分成25个中方格，每一中方格又分成16个小方格。另一种是16325型，其计数室被分成16个中方格，每一中方格又分成25个小方格。无论哪种规格，计数室的小方格数都是相同的，即16325=400个小方格。

中央大格的边长为1mm，面积为1mm2，计数室与盖玻片间的深度为0.1mm，所以计数室的体积为0.1mm3。

计数时，如用25316型计数板，通常数对角线上的5个中方格（即左上、右上、左下、右下、中央共80个小方格）的细胞总数。如用16325型的计数板，通常数对角线上的4个中方格（即左上、右上、左下、右下共100个小方格）的细胞总数，然后根据下列公式求得菌液的浓度：

25316型：

细胞总数/ml=（80小方格内的菌数/80）3400310003103稀释倍数

16325型：

细胞总数/ml=（100小方格内的菌数/100）3400310003103稀释倍数

三、方法与步骤

1.取一块洁净的血球计数板，在计数室上面加盖一块专用的厚盖玻片。

2.用滴管吸取菌悬液滴于盖玻片的边缘，让菌液靠毛细作用渗入计数室，注意不能有气泡产生。将计数板置显微镜的载物台上，静止5min，使细胞全部沉

降到计数板的表面。

3.分别统计5个中方格（25316型）或4个中方格（16325型）中酵母菌细胞总数及芽体数。酵母菌的芽在未脱离母细胞前，若已达母细胞的1/2大小，则不作为芽体，而作为成熟的细胞计数。

在计数时，若遇到位于中方格间线上的细胞，一般是只统计位于右线及上线上的细胞。为了尽量减少实验误差，应注意以下两点：

①一般以每个小方格中平均4-6个细胞为宜，过多时应对样品进行稀释。

②对同一样品要重复计数两次，取其平均值；若两次统计数据相差太多，则应重复计数。

4.使用完毕后，应将计数板用清水清洗干净（绝对不能用硬物洗刷），待自行晾干或用电吹风吹干后装入盒中。

五、实验结果

将实验结果填入下表

六、思考题

1.为什么计数室内不能有气泡？试分析产生气泡的原因。

2.试分析影响本实验结果的误差来源及提出改进措施。

3.能不能用血球计数板在油浸镜下对细胞计数？为什么？

实验五、显微镜油浸镜的使用方法

一、目的要求

1.熟练掌握低倍镜和高倍镜的使用技术

2.掌握油浸镜的使用技术及观察细菌形态的基本方法。

二、实验材料

1.菌种：细菌染色标本。

2.其他：显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸等。

三、基本原理

根据显微镜物镜与载玻片之间的介质的不同，可将物镜分为两组，即干燥系物镜和油浸系物镜。进口显微镜的油镜标有一黑圈“○I”或“HI”等字样，国产显微镜的油镜多以一红黑或一白黑表示。在油浸系中，载玻片与镜头之间多用香柏油作介质，因香柏油的折射率（n=1.51）与玻璃的折射率（n=1.52）几乎相等，故透过载玻片的光线通过香柏油后，直接进入物镜，而不发生折射。与干燥系物镜相比，油浸镜的数值口径N.A值较大，分辨力较高。两组物镜光线通路的区别如图5-1所示。

细菌是单细胞原核微生物，形体很小，大多直径或宽度小于1μm，必须借助于油浸镜方能观察清楚。

四、方法与步骤

1.将细菌染色标本放在显微镜的载物台上，先通过低倍镜和高倍镜观察，将待检部位（即细菌较分散的部分）移至视野中央。

2.升高镜筒，将油镜转入光路。

3.将聚光器上升至最高点，并适当开放光圈，以获得较强的光线。

4.在标本片的待检部位，滴加一滴香柏油。

5.从侧面注视，用粗调旋钮将镜筒小心缓慢地降下，使镜头浸润在香柏油内。

6.从目镜观察，用粗调节旋钮上升镜筒，直至视野内出现物象，再用细调节旋钮较准焦距至物象清晰为止。

如果油浸镜已离开油面仍未见物像，则应重复上述操作，至看到物象为止。

为了充分发挥油镜的分辨力，也可在聚光器与载玻片之间滴加香柏油，使由聚光器射出的光不受折射而直接进入物镜。

7.观察完后，将镜筒升起，取下标本片，用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾取少量的二甲苯，擦去镜头上的残余油渍。再用擦镜纸擦去二甲苯。二甲苯能渗入物镜，溶解胶粘透镜的物质而损坏镜头。

8.使用完毕，用洁净的绸布把显微镜各部位擦拭干净，放入箱中。

五、实验内容

用油浸镜观察所给的细菌染色标本，记录各菌特征。

六、实验作业

1.绘出所观察到的细菌形态图，注明菌名，放大倍数。

2.在使用油镜时，应特别注意什么问题？

3.对同一微生物制片，用油镜观察比用低倍镜观察有何优、缺点？

实验六、细菌的涂片及简单染色法

一、目的要求

掌握细菌的涂片和简单染色技术。

二、材料

1.菌种：大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌。

2.染料：吕氏美兰、番红

3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、生理盐水、香柏油、二甲苯

三、基本原理

细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能清楚的观察到其形态和结构。

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合，因细菌蛋白质的等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性溶液中时，常常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美兰、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质相结合，当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料。如伊红美兰、伊红天青等。

简单染色法即只用一种染料使细菌着色。此法虽手续简便，但一般只能显示其形态，不能辨别其构造。

染色前必须先固定细菌。其目的有三：一是杀死细菌，固定其细胞结构。二是保证菌体能牢固地黏附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉。三是改变菌体对染料的通透性。一般死细胞原生质容易着色。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。

四、方法与步骤

1.涂片：在洁净无油渍的载玻片中央滴一小滴生理盐水，用无菌操作（见图6-1）挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜，涂布面积约1cm2。

2.干燥：涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使其干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心的在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿仅靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。

3.固定：涂片面朝上，在酒精灯火焰外层快速地来回通过3-4次，共约3-4秒。要求玻片温度不超过60℃（用手背触涂片反面，以不烫手为宜）。待玻片冷却后再加染料。

4.染色：在已固定的涂片上加适量染色液，以盖满菌膜为度，染色1-3min。

5.水洗：倾去染色液，用细流水冲洗涂片的背面，直至流下的水无染色液

的颜色为止。

6.干燥：自然干燥，也可用吸水纸轻轻吸取水分（注意勿擦去菌体）。或微微加热，以加快干燥速度。

7.镜检：以低倍镜找到着色良好的部位，再用油浸镜观察。

五、实验结果

绘出大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图，注明放大倍数、染色方法及观察到的颜色。

六、注意事项

1.玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。

2.挑菌量宜少，涂片宜薄，厚则不易观察。

七、思考题

涂片为什么要固定？固定时应注意什么问题？