确认方案

批准页

1 概述

1.1 洁净区用消毒剂对地漏、地面、墙面、操作台、设备表面及非灭菌容器具表面等进行消毒，旨在控制微生物污染水平，防止微生物在药品生产环境中污染及交叉污染，保证生产环境符合工艺卫生要求，最终保证药品质量。

1.2 本公司车间洁净区分为D级，化验室洁净区为C级、C级下的局部B级，所使用的消毒

1.3 本公司产品为口服制剂，为防止交叉污染，确认用此消毒剂消毒后洁净区及环境内物体表面不残留控制菌和目的菌，保证我们使用的消毒剂能够对目的菌起到强抑制作用，能达到预期的消毒效果，必须对消毒剂的消毒效果进行验证。

1.4 本方案结合生物指示剂挑战性试验（特定菌挑战试验）和现场考察试验，对消毒剂的杀菌效力进行确认。

2 验证目的

2.1 确认洁净区按照规定的清洁、消毒程序进行清洁消毒后，能够达到防止交叉污染的目的，并在消毒有效期内能确保达到生产工艺所需要的效果。

3 验证范围

3.1 本验证先在实验室对所使用的消毒剂，用六种控制菌做生物指示剂挑战性实验；然后做现场消毒考察实验，即现场消毒后用棉签取样法对消毒后的表面取样，做表面残留微生物限度检查。

3.2 通过对指示菌的杀灭对数值和现场消毒后洁净区表面微生物的残留限度来确认消毒剂的消毒效果。

4 验证小组成员及职责

5 验证内容及步骤

5.1 验证前准备：在进行消毒剂消毒效果验证前，洁净厂房空气净化系统应经验证合格并正常运行，设备动力部应提供洁净厂房空气净化系统的验证报告、空气净化系统操作程序；与验证相关的各种设备、仪器均需通过相应验证，所需仪表、计量器具均需校验合格并具备校验证书。

5.3 器材与试剂

5.3.1 菌株

（1）细菌：金黄色葡萄球菌

乙型副伤寒沙门菌

大肠杆菌

（2）细菌芽孢：枯草杆菌芽孢

（3）真菌：白色念珠菌

5.3.2 培养基：营养肉汤培养基、营养琼脂培养基等。

5.3.3 稀释液：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。

5.3.4 中和剂：0.1%卵磷脂+1%吐温80溶液；营养肉汤。

5.3.5 无菌载片：12mm直径不锈钢片。

5.3.6 无菌试管、无菌平皿（90mm）。

5.3.7 含玻璃珠的无菌三角瓶。

5.3.8 消毒剂：75%酒精，0.2%新洁尔灭。

5.3.9 移液器及配套无菌吸头：0-100ul，100-1000ul 。

5.3.10 计时器。

5.3.11 净化工作台。

5.3.12 恒温培养箱。

5.4 中和剂鉴定试验

5.4.1 细菌和真菌菌液制备：接种金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基（或高盐甘露醇培养基）中，30～35℃培养18-24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖培养基中，23～28℃培养18-24h。将上述培养物用稀释液稀释至所需浓度备用。

5.4.2 枯草杆菌芽孢悬液的制备：

5.4.2.1 取枯草杆菌新鲜培养物（18-24h）适量至营养琼脂培养基斜面，使菌液布满营养琼脂培养基斜面，再将多余的培养物吸出，将斜面置于30～35℃培养5～7天。用接种环取菌样少许涂于玻片上，进行芽孢染色镜检。当芽孢形成率达95％以上时，即可进行以下处理。否则，应继续在室温下放置一定时间，直至达到上述芽孢形成率后再进行以下处理。5.4.2.2 加适量无菌水于每一营养琼脂培养基斜面试管内，以接种环轻轻推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌悬液，再取适量无菌水于营养琼脂培养基斜面，重复洗菌一遍。将第一和第二批洗下的菌悬液集中于一含玻璃珠的无菌三角烧瓶内，振摇5min，打碎菌块，使成均匀的芽孢悬液。

5.4.2.3 用无菌棉花或纱布过滤芽孢悬液，清除其中的琼脂凝快。

5.4.2.4 将过滤后的芽孢悬液放于80℃水浴中10min以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后，保存于4℃冰箱中备用。有效使用期为半年。

5.4.2.5 芽孢悬液在使用时，应先进行活菌计数。

5.4.3 染菌载片制备

5.4.3.1 载片脱脂处理：①将载片放在含肥皂的水中煮沸30min，②以纯化水洗净，③用纯化水煮沸10min，④用蒸馏水漂洗至pH中性晾干备用。

5.4.3.2 菌液滴染：将经灭菌的载体平铺于无菌平皿内，滴加105cfu/ml的菌液10ul，并用接种环涂匀整个载体表面。滴染菌液后，载体置37℃温箱内干燥约20-30min后再使用。

5.4.4 中和剂鉴定操作程序

5.4.4.1 根据试验分组，准备足量试管和平皿，依次进行编号。

第1组：用无菌镊子取一染菌载片移入含有10ml中和剂的试管中。作用10min后，将试管振打80次，混匀，分别吸取1.0ml，接种于两个平皿中，做活菌计数。细菌放30～35℃培养48h，芽孢放30～35℃培养72h，真菌放23～28℃培养72h观察最终结果。

第2组：用无菌镊子取一染菌载片移入含有10ml中和产物（以浸有消毒剂的无菌载片置10ml中和剂内，作用10min）的试管中。作用10min后，用电动混合器混合20s，或将试管振打80次，混匀，分别吸取1.0ml，接种于两个平皿中，做活菌计数。细菌放30～35℃培养48h，芽孢放30～35℃培养72h，真菌放23～28℃培养72h观察最终结果。

第3组：用无菌镊子取一染菌载片移入含有10ml稀释液的试管中。作用10min后，用电动混合器混合20s，或将试管振打80次，混匀，分别吸取1.0ml，接种于两个平皿中，做活菌计数。细菌放30～35℃培养48h，芽孢放30～35℃培养72h，真菌放23～28℃培养

72h观察最终结果。

第4组：分别吸取稀释液和中和剂各1.0ml于同一无菌平皿内，加入上述试验同批次的培养基15-20ml，培养观察。

5.4.4.2 判定标准：实验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格：

⑴第1、2和3组有相似量试验菌生长，其组间菌落数误差率不应超过15%。第1、2和3组菌落数误差率计算公式如下：

（3组间菌落平均数-各组菌落平均数）的绝对值之和

误差率＝—————————————————————————×100％

3×3组间菌落平均数

⑵第4组无菌生长。否则，说明试剂有污染，应重新进行试验。

5.4.4.3 结果记录详见附件1：中和剂鉴定试验结果记录

5.5 载体定量杀灭试验

5.5.1 将菌液用稀释液稀释成 108cfu/ml的菌悬液。

5.5.2 取已灭菌的载体放于无菌平皿内，每种微生物试验用载体分"5分钟组"、"10分钟组"和"15分钟组"共3组。

5.5.3 滴染108cfu/ml的菌悬液10ul于无菌载体上，载体置37℃温箱内干燥约20-30min后再使用。

5.5.4 用无菌镊子将染菌载体加入含有消毒剂的平皿中，作用至规定时间，将染菌载体移入含有10ml中和剂的试管内，用电动混合器混合20s，或将试管振打80次，使菌片上的微生物被洗脱进入中和液内，再放置5 min，使中和作用充分。最终进一步混匀，适当稀释，分别吸取1.0ml接种于两个平皿中，做活菌计数。细菌放30～35℃培养48h，芽孢放30～35℃培养72h，真菌放23～28℃培养72h观察最终结果。

5.5.5 另取一平皿，注入10ml稀释液代替消毒剂，放入染菌载片，作用10min后取出载片，移入含有10ml中和剂的试管内，其随后的试验步骤与上述试验相同，作为阳性对照。

5.5.6 判定标准：消毒剂对挑战菌的杀灭对数值≥3判为合格。

5.5.7 杀灭对数值计算

杀灭对数值（KL）＝对照组平均活菌浓度对数值-试验组活菌浓度对数值

5.5.8 结果记录详见附件2：载体定量杀灭试验结果记录。

5.6 现场考察试验

5.6.1 消毒剂的配制：洁净区操作人员按照《消毒剂、清洁剂的配制、使用SOP》配制75%酒精、0.2%新洁尔灭。

5.6.2 生产结束后操作人员按照生产车间区清洁SOP对洁净区进行清洁消毒。

5.6.3 清洁消毒完毕15分钟后，现场QA使用棉签取样法对清洁消毒后的洁净区进行表面微生物监测取样，共测定3次。

5.6.4 取样点的确定：各洁净区D级抽取三个操作间；C级抽取两个操作间；万级下的局部百级。选择操作间的墙面、地面、设备外壁以及操作台最难清洁的地方作为取样点。详细取样点见附件3：表面微生物监测位点。

5.6.5 取样面积：25cm2。

5.6.6 取样方法：棉签取样法

5.6.7 取样程序：取样人员用经过灭菌处理的生理盐水润湿经过灭菌处理的棉签，并将其靠在溶剂瓶上挤压，以除去多余的溶剂；将棉签按在取样表面上，用力使其稍弯曲，按图A，平稳而缓慢地擦拭取样表面。在向前移动的同时将其从一边移到另一边。擦拭过程应覆盖整个表面。翻转棉签，按图B，让棉签的另一面也进行擦拭。但与前次擦拭移动方向垂直。擦拭完毕后，将棉签放入试管中，并加盖密封。向试管中加入10ml灭菌后的生理盐水，振摇10分钟。空白样品的制备：按以上第二步湿润棉签，将棉签直接放入试管并加盖密封。取样完成后，在试管上注明有关取样信息、编号，并做好取样记录。所有样品送化验室进行检测。

图A 图B

5.6.8 检测方法：将取样后的纱布或脱脂棉放入广口瓶中，加一定量的浸出液（10ml灭菌生理盐水）充分振摇10分钟，按微生物检查法进行检测。同时做空白对照试验。

5.6.9 测定结果记录详见附件4：洁净区表面微生物监测结果记录。

6 再验证周期

6.1 当消毒剂的使用浓度和清洁消毒程序发生变更时应进行再验证。

6.2 当环境中出现新类型的微生物时，应以该微生物为挑战菌进行再验证。

6.3 当有新的消毒剂被使用时应进行验证。

7 附件

7.1 附件1：中和剂鉴定试验结果记录

7.2 附件2：载体定量杀灭试验结果记录

7.3 附件3：表面微生物监测位点

7.4 附件4：洁净区表面微生物监测结果记录