宝生-一步法反转录说明书

Takara Code ：DRR066A

One Step SYBR

? PrimeScript ?

RT-PCR Kit

（Perfect Real Time ）

（100次量）

宝生物工程(大连)有限公司

内容页码

●制品说明 1 ●制品内容 1 ●保存 1 ●适用的Real Time PCR扩增仪 1 ●试剂盒原理 1 ●特长 3 ●RNA样品制备 3 ●操作注意 3 ●操作方法 4 A）应用Thermal Cycler Dice Real Time System的操作方法4 B）应用Smart Cycler II System Real Time PCR扩增仪的操作方法5 C）应用Life Technologies公司的Real Time PCR扩增仪的操作方法6 D）应用LightCycler Real Time PCR扩增仪的操作方法7●实验条件的选择8 ●实验例9 ●引物设计说明10 ●特别提示：本公司提供用于基因表达定量分析的引物设计及合成服务 10

●制品说明

本制品是采用SYBR? Green I嵌合荧光法进行One Step RT-PCR反应的专用试剂。Real Time PCR方法以其卓越的快速性及定量性被广泛应用于科研领域，使用本制品进行Real Time RT-PCR反应可在同一反应管内连续进行，操作简单，并能有效防止污染。本反应体系由于可以对扩增产物进行实时检测，大大提高了检测灵敏度，并省略了PCR反应后的电泳步骤，非常适合于RNA病毒等微量RNA的检测。

本制品中使用了最适合于Real Time RT-PCR的反转录酶PrimeScript RTase和TaKaRa Ex Taq HS，具有高扩增效率和高扩增特异性，能进行稳定的Real Time One Step RT-PCR反应。

本制品适合于Thermal Cycler Dice?Real Time System、Smart Cycler?System、ABI PRISM?7000/7700/7900HT、7300/7500 Real-Time PCR System、7500 Fast Real-Time PCR System、LightCycler?、Mx3000P TM等各种机种的Real Time PCR扩增仪。试剂盒中还附带有ROX Reference Dye，可用于需要Dye的Real Time PCR扩增仪。此外，本制品也适用于使用玻璃毛细管的Real Time PCR扩增仪，并且不需要再添加BSA。本制品还适合于快速Real Time PCR的扩增反应。

本制品可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。

●制品内容（50 μl反应×100次）

1. 2×One Step SYBR? RT-PCR Buffer Ⅲ*1840 μl×3支

2. TaKaRa Ex Taq?HS（5 U/μl）100 μl

3. PrimeScript? RT Enzyme Mix Ⅱ100 μl

4. RNase Free dH2O 1.25 m l×2支

5. ROX Reference Dye*2（50×）100 μl

6. ROX Reference Dye II*2（50×）100 μl

*1 内含dNTP Mixture，Mg2+等。

*2 只使用在Life Technologies、Agilent Technologies等公司的Real Time PCR扩增仪上，用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。ABI PRISM 7000/7700/7900HT和7300 Real-Time PCR

System使用ROX Reference Dye，7500 Real-Time PCR System和7500 Fast Real-Time PCR

System使用ROX Reference Dye II，Agilent Technologies公司的Mx3000P也适用ROX

Reference Dye II。Thermal Cycler Dice Real Time System、Smart Cycler System、LightCycler

等Real Time PCR扩增仪时不必使用。

●保存：-20℃。

2×One Step SYBR? RT-PCR Buffer Ⅲ请于-20℃避光保存。

●适用的Real Time PCR扩增仪

Thermal Cycler Dice? Real Time System（Takara）

Smart Cycler? System（Cepheid）

ABI PRISM?7000/7700/7900HT，7300/7500 Real-Time PCR System，7500 Fast Real-Time PCR System（Life Technologies）

LightCycler?（Roche Diagnostics）

Mx3000P TM（Agilent Technologies）

其他各种Real Time PCR扩增仪

●试剂盒原理

本制品首先利用反转录酶PrimeScript RTase将RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板利用TaKaRa Ex Taq HS在同一反应管内连续进行Real Time PCR扩增反应（使用SYBR? Green I嵌合荧光法）。

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RT-PCR反应采用了如图1显示的One Step RT-PCR方法。反转录反应以Total RNA为模板，以Specific Primer（Reverse）为反转录引物（本制品不能使用Random Primer和Oligo dT Primer进行反转录反应）合成cDNA。然后以合成的cDNA为模板，以Specific Primer（Forward，Reverse）为引物，进行Real Time PCR扩增反应。

Real Time PCR扩增反应采用了如图2显示的SYBR? Green I嵌合荧光法，即在反应体系中加入与双链DNA结合便可发出荧光的荧光染料SYBR?Green I，通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增目的DNA片段的融解温度。

图1. One Step RT-PCR方法原理

Primer

1．热变性

Polymerase

引物退火

延伸反应

图2. 嵌合荧光法原理图

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1.进行Real Time One Step RT-PCR反应，可以快速、准确地对RNA病毒等微量RNA进行分析。

2.PCR用DNA聚合酶使用了改良后的TaKaRa Ex Taq HS，可以进行Hot Start法PCR反应，再与Takara

公司独自开发的Buffer系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度，高扩增特异性之特点。2×One Step SYBR RT-PCR Buffer Ⅲ中预先混有SYBR? Green I等，反应液配制十分简单方便。

●RNA样品制备

本试剂盒是将RNA合成cDNA，然后再对此cDNA进行扩增的试剂盒。RNA的纯度会影响cDNA的合成量，而制备RNA的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。

【使用器具】

尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。

(1) 用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。

(2) 然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。

RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。

【试剂配制】

用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60 min）或用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后进行高温高压灭菌。

RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。

【制备方法】

使用简单的RNA纯化方法即可获得满足于RT-PCR反应的RNA（只需少量的RNA便可进行RT-PCR 反应）。但为了保证实验的成功率，建议使用GTC法（异硫氰酸胍法）制备的高纯度RNA。

从培养细胞、组织中提取时，使用RNAiso Plus（Takara Code: D9108）。

从血液中提取RNA时，建议使用Catrimox?-14 RNA Isolation Kit Ver.2.11（Takara Code: DWA005），在短时间内能调制高纯度的RNA。

●操作注意

以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前请一定认真阅读。

1）当同时需要进行数次Real Time One Step RT-PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液（Master Mix；其中包括RNase Free dH2O、Buffer、各种酶等），然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验样品之间产生的误差。

2）使用TaKaRa Ex Taq HS、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ时，应轻轻混匀，避免起泡；分取之前要小心地离心收集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。3）2×One Step SYBR? RT-PCR Buffer Ⅲ融解后如有不溶物请充分混合。

保存2×One Step SYBR? RT-PCR Buffer Ⅲ或配制Real Time One Step RT-PCR反应液时应避免强光照射。

4）反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染的）枪头、Microtube等，尽量避免污染。

5）制品只能使用特异性反转录引物，不能使用Random Primer和Oligo dT Primer等进行反转录反应。

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A）应用Thermal Cycler Dice? Real Time System扩增仪的操作方法

请按照Thermal Cycler Dice? Real Time System（Takara Code：TP800）的使用说明书要示进行实验操作。

1）按下列组份配制RT-PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

试剂使用量终浓度2×One Step SYBR? RT-PCR Buffer Ⅲ12.5 μl 1×

TaKaRa Ex Taq HS（5 U/μl）0.5 μl

PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ0.5 μl

PCR Forward Primer（10 μM）0.5 μl 0.2 μM*1

PCR Reverse Primer（10 μM）0.5 μl 0.2 μM*1

Total RNA*2 2 μl

RNase Free dH2O 8.5 μl

Total 25 μl

*1 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM 范围内调整引物浓度。

*2 建议在反应液中使用10 pg～100 ng的Total RNA为模板。

2）进行Real Time One Step RT-PCR反应。

PCR反应管请用离心机轻轻离心后放入Thermal Cycler Dice?Real Time System中进行Real Time PCR反应。建议采用下列图表显示的标准PCR反应程序，如果使用该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。

Pattern 1：反转录反应

Hold

42℃ 5 min

95℃ 10 sec

Pattern 2：PCR反应

Cycle：40

95℃ 5 sec

60℃ 30 sec

Pattern 3：Dissociation

◆特别提示：

本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。

PCR反应前的反转录酶的热变性失活通常设定为95℃、10 sec。

3）实验结果分析。

反应结束后确认Real Time One Step RT-PCR的扩增曲线和融解曲线，进行RT-PCR定量时制作标准曲线等。

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B）应用Smart Cycler? II System Real Time PCR扩增仪的操作方法

请按照Smart Cycler?（Cepheid公司）的使用说明书要求进行实验操作。

1）按下列组份配制RT-PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

*1 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM 范围内调整引物浓度。

*2 建议使用10 pg～100 ng的Total RNA为模板。

2）进行Real Time One Step RT-PCR反应。

PCR反应管请用离心机轻轻离心后放入Smart Cycler? System中进行Real Time PCR反应。建议采用下列图表显示的PCR反应程序，如果使用该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。

由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。

Stage 1：反转录反应

Hold

42℃ 5 min

95℃ 10 sec

Stage 2：PCR反应

Repeat : 40 times

95℃ 5 sec

60℃ 20 sec

Stage 3 : Melt Curve

◆特别提示：

PCR反应前的反转录酶的热变性失活通常设定为95℃、10 sec。

3）实验结果分析。

反应结束后确认Real Time One Step RT-PCR的扩增曲线和融解曲线，进行RT-PCR定量时制作标准曲线等。

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C ）应用ABI PRISM ? 7000/7700/7900HT ，7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System 的操作方法

请按照Life Technologies 公司的仪器使用说明书要求进行实验操作。

1）按下列组份配制RT-PCR 反应液（反应液配制请在冰上进行）。

*1 通常引物终浓度为0.2 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM 范围内调整引物浓度。

*2 建议在50 μl 反应液中使用20 pg ～200 ng 的Total RNA 为模板。

*3 R OX Reference Dye II （50×）比ROX Reference Dye （50×）浓度低，使用7500 Real-Time PCR System 和7500 Fast Real-Time PCR System 时，请使用ROX Reference Dye II （50×）。与使用ROX Reference Dye （50×）相比，校正后的荧光信号值高，但解析结果完全相同。使用ABI PRISM7000/7700/7900HT 及7300 Real-Time PCR System 时，请使用ROX Reference Dye （50×）。

*4 96孔板、Single-Tube 、8联Tube 采用50 μl 反应体系，384孔板、96-well Fast Thermal Cycling plate 采用20 μl 反应体系。

2）进行Real Time One Step RT-PCR 反应。

建议采用下列图表显示的PCR 反应程序，如果使用该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR 条件的优化。由于使用Tm 值较低的引物等原因，两步法PCR 反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR 扩增反应。有关PCR 的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。

Stage 1、2：反转录反应

Reps ：1 42℃ 5 min 95℃ 10 sec

Stage 3：PCR 反应 Reps ：40

95℃ 5 sec

60℃ 30～34 sec* Stage 4：Dissociation Protocol

* 使用7700和7900 HT 时请设定为30秒；使用7000和7300时请设定为31秒；使用7500时请设定为34秒。

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< 7500 Fast Real-Time PCR System>

Stage 1、2：反转录反应

Reps：1

42℃ 5 min

95℃ 10 sec

Stage 3：PCR反应

Reps：40

95℃ 3 sec

60℃ 30 sec

Stage 4：Dissociation Protocol

◆特别提示：

PCR反应前的反转录酶的热变性失活通常设定为95℃、10 sec。

3）实验结果分析。

反应结束后确认Real Time One Step RT-PCR的扩增曲线和融解曲线，进行RT-PCR定量时制作标准曲线等。

D）应用LightCycler? Real Time PCR扩增仪的操作方法

请按照LightCycler?（Roche Diagnostics公司）的使用说明书要求进行实验操作。

1）

*1 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM 范围内调整引物浓度。

*2 建议使用10 pg～100 ng的Total RNA为模板。

2）进行Real Time One Step RT-PCR反应。

PCR反应用毛细管请用离心机轻轻离心后放入LightCycler中进行Real Time PCR反应。建议采用下列图表显示的PCR反应程序，如果使用该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR 扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。

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Stage 1：反转录反应

42℃ 5 min 20℃/sec

95℃10 sec 20℃/sec

1 Cycle

Stage 2：PCR反应

95℃ 5 sec 20℃/sec

60℃20 sec 20℃/sec

40 Cycles

Stage 3：融解曲线分析

95℃0 sec 20℃/sec

65℃ 15 sec 20℃/sec

95℃ 0 sec 0.1℃/sec

◆特别提示：

PCR反应前的反转录酶的热变性失活通常设定为95℃、10 sec。

3）实验结果分析。

反应结束后确认Real Time One Step RT-PCR的扩增曲线和融解曲线，进行RT-PCR定量时制作标准曲线等。

●实验条件的选择

如果按照推荐的两步法条件进行反应，反应性能不好时，请按照下面的方法进行引物和PCR反应条件的研讨。实验条件选择时，请从反应特异性与扩增效率两方面进行综合考虑。要求能同时满足这两个条件的反应体系，并可以在较大浓度范围内进行很好的定量。

○反应特异性高的实验体系应具备以下条件：

?No Template Control 时不产生引物二聚体等非特异性扩增。

?不产生目的片段以外的扩增。

○扩增效率高的实验体系应具备以下条件：

?扩增产物起峰更早（Ct值小）。

?PCR扩增效率高（接近理论值100％）。

1. Primer浓度与反应性能间的关系如下：

降低Primer浓度有助于提高特异性；提高Primer浓度有助于提高扩增效率。图示如下：

2. PCR条件与反应性能间的关系如下：

①要提高反应特异性，可以提高退火温度或变为2 Step PCR反应。

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②要提高扩增效率，可以增加延伸时间或变为3 Step PCR反应。

3. 各种Real Time RT-PCR试剂

Takara公司销售各种SYBR Green Assay用one Step Real Time RT-PCR和Two Step Real Time RT-PCR试剂。对于要求检出灵敏度高以及样品数多时可以选择one Step Real Time RT-PCR试剂。

对于检测基因数多时选择Two Step Real Time RT-PCR试剂比较方便。另外，Two Step Real Time RT-PCR可以提高反应的特异性。使用者可以根据实验需要进行选择。

●实验例

Rat Rplp2（ribosomal protein，lange P2）基因的检测（使用Thermal Cycler Dice? Real Time System，Takara Code：TP800）。

1. RT-PCR方法。

以Rat Liver中提取的Total RNA 6.4 pg～100 ng为模板，进行Real Time One Step RT-PCR反应。

2. RT-PCR扩增结果。

Real Time One Step RT-PCR的反应结果如下：

扩增曲线图融解曲线图反应结束后，根据扩增曲线的2nd derivative得到各扩增曲线的Ct值，制作标准曲线。

2nd derivative图标准曲线图

3. 结果分析。

本实验检测到了6.4 pg～100 ng Total RNA中的目的基因。分析融解曲线可知，无论哪一种浓度的模板都能够得到单一的PCR扩增产物。同时定量曲线的线性关系良好，在实验浓度范围内能够进行准确定量。

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●引物设计说明

进行Real Time PCR反应时，设计反应性能良好的PCR引物非常重要。根据以下原则，可以设计出PCR扩增效率高，反应特异性强的良好引物。

◆PCR扩增产物长度：80～150 bp最佳（可以延长至300 bp）。

◆设计引物要求如下：

*1 OLIGO Primer Analysis Software。

*2 Primer3（https://www.360docs.net/doc/346366105.html,/ftp/distribution/software/）

*3 https://www.360docs.net/doc/346366105.html,/BLAST/

●特别提示：本公司提供用于基因表达定量分析的引物设计及合成服务

本公司以美国NCBI Data Base上登录的Human、Mouse、Rat、Cow、Dog、Chicken的RefSeq为对象，已经设计完成了各基因用于定量表达分析的Real Time RT-PCR用高特异性Primer Set，此Primer Set最适于本制品使用，可省略PCR反应条件优化实验。具体情况如下：

可提供1～3对合适的引物，由客户自己选择。

1. 从3’ 端开始的1,500 Base内的引物候补序列。

2. 从5’ 端开始的1,500 Base内的引物候补序列。

3. 针对Target基因全长的引物候补序列。

注）本公司只对在本公司合成的引物/探针提供免费设计服务，恕不受理不在本公司合成的引物/探针的设计委托！

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NOTICE TO PURCHASER : LIMITED LICENSE

[P5] PCR Notice

Use of this product is covered by one or more of the following US patents and corresponding patent claims outside the US: 5,994,056 and 6,171,785. The purchase of this product includes a limited, non-transferable immunity from suit under the foregoing patent claims for using only this amount of product for the purchaser's own internal research. No right under any other patent claim and no right to perform commercial services of any kind, including without limitation reporting the results of pur chaser's activities for a fee or other commercial consideration, is conveyed expressly, by implication, or by estoppel. This product is for research use only. Diagnostic uses under Roche patents require a separate license from Roche. Further information on purchasing licenses may be obtained by contacting the Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA [L1] One Step RNA PCR / One Step RT-PCR

Use of this product is licensed from bioMerieux, is covered by US Patent 5,817,465 and equivalents, and is for Research Use Only.

[L11] SYBR? Green I

This product is covered by the claims of U.S. Patent No. 5,436,134 and 5,658,751 and their foreign counterpart patent claims.

Takara PCR products containing SYBR? Green I are sold under license from Molecular Probes Inc. only for the usage in Real-time PCR for internal research purpose. These products are not to be used for the purpose such as; providing medical, diagnostic, or any other testing, analysis or screening services or providing clinical information or clinical analysis in return for compensations.

[L15] Hot Start PCR

Licensed under U.S. Patent No. 5.338,671 and 5,587,287, and corresponding patents in other countries.

[L46] SYBR/Melting Curve Analysis

The purchase of this product includes a limited, non-transferable license for all fields other than human or veterinary in vitro diagnostics under specific claims of U.S. Patent Nos. 6,174,670, 6,569,627 and 5,871,908, owned by the University of Utah Research Foundation or Evotec Biosystems GmbH and licensed to Idaho Technology, Inc. and Roche Diagnostics GmbH, to use only the enclosed amount of product according to the specified protocols. No right is conveyed, expressly, by implication, or by estoppel, to use any instrument or system under any claim of U.S. Patent Nos. 6,174,670, 6,569,627 and 5,871,908, other than for the amount of product contained herein.

[L52] Rox Reference Dye (Research Field)

Use of this product is covered by one or more of the following US patents and corresponding patent claims outside the US: 5,928,907. The purchase of this product includes a limited, non-transferable immunity from suit under the foregoing patent claims for using only this amount of product for the purchaser’s own internal research. No right under any other patent claim and no right to perform commercial services of any kind, including without limitation reporting the results of purchaser's activities for a fee or other commercial consideration, is conveyed expressly, by implication, or by estoppel. This product is for research use only. Further information on purchasing licenses may be obtained by contacting the Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA.

[M57] LA Technology

This product is covered by the claims 6-16 of U.S. Patent No. 5,436,149 and its foreign counterpart patent claims.

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SYBR? Green I is licensed by Molecular Probes Inc. for TAKARA BIO INC. to manufacture and sale for research reagents. SYBR? is patented by Molecular Probes Inc.

Smart Cycler? System is produce of Cepheid

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MEMO

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宝生物工程（大连）有限公司

Takara Biotechnology (Dalian) Co., Ltd.

辽宁省大连经济技术开发区东北二街19号（116600）

No.19 Dongbei 2nd Street, Development Zone, Dalian, China

电话：0411-******** 87641683

传真：0411-******** 87621675

E.mail：service@https://www.360docs.net/doc/346366105.html,

网址：https://www.360docs.net/doc/346366105.html,

V2012.01