木质纤维素生物降解机理及其降解菌筛选方法研究进展
土样中淀粉降解细菌的筛选综述
土样中淀粉降解细菌的筛选（设计性实验） 一、实验目的 1.掌握土壤样品中微生物菌种分离和筛选技术的实验设计方案。 2.掌握富集、平板稀释涂布法、分离筛选产淀粉酶菌株的基本原理。 3.初步掌握从土壤样品中分离筛选产淀粉酶菌株的基本技术。 二、实验原理 在自然条件下，产淀粉酶的细菌和其它各种细菌混杂生活在土壤中，要想分离出来必须建立相应的“筛子”。淀粉酶能使淀粉分解成葡萄糖，而淀粉与碘液发生反应形成蓝色化合物。葡萄糖不与碘液发生反应形成蓝色化合物，结果可使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。 微生物酶产生菌的筛选具体分为增殖培养、初筛和复筛过程。增殖培养是通过控制培养基的营养成分和/或培养条件使样品中的目的菌得以大量繁殖,而非目的菌的生长受到抑制或繁殖减缓,从而提高样品中目的菌的数量和比例。初筛是对所得的纯种进行检测。由于淀粉酶是胞外酶，在分离培养基中加适量可溶淀粉通过平板透明圈法来检测淀粉酶产生菌。筛选透明圈比值大的菌株接种到培养基中进行培养，再进行复筛。复筛的目的是淘汰底产菌。 三、实验材料 1、培养基：蛋白胨， NaCl，可溶性淀粉，琼脂，蒸馏水。 2、玻璃仪器: 培养皿10副，试管10支，三角瓶 6个，移液管 10支（1mL7支,10mL 3支），100mL量筒2个,玻璃棒，玻璃珠。 3、其它：酒精灯，硅胶塞,包装绳，包装纸,PH试纸，接种环，电子天平，称量纸,高压蒸汽灭菌锅，摇床，角匙，记号笔等。 四、方法与步骤 1、土壤样品: 食品厂、粮食加工厂、饭店等日常接触淀粉较多的肥沃土壤。 2、培养基的制备 (1)液体培养基：称取蛋白胨1.0 g、NaCl 0.5 g、可溶性淀粉0.2 g溶于装有100 mL蒸馏水的三角瓶中，调pH为7.2至7.4，分装为2个三角瓶,50mL/个,包扎，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。 (2)固体淀粉培养基：称取蛋白胨1.5g， NaCl 0.75g，可溶性淀粉0.3g ，溶于
纤维素分解菌的分离和鉴定
纤维素降解菌类的分离与鉴定系列实验 一、实验背景 纤维素就是植物细胞壁主要成分,属于多糖类物质,就是地球上数量最大的可再生资源。如能利用微生物将其转化为生物产品或生物能源,即可缓解能源短缺、解决环境污染,又能形成新的产业。由于在自然界中存在着大量产纤维素酶的细菌与真菌,因而纤维素的生物降解主要依赖于微生物的作用。从20世纪 40-50年代起,针对产纤维素酶的微生物的分离筛选就进行了大量的工作,并逐 步建立起一套较完整的分离筛选方法。迄今为止有关纤维素降解菌分离筛选的研究报导已有很多,如细菌中的生孢噬纤维菌属、噬纤维菌属及纤维单胞菌属等;放线菌由于能形成芽孢,与真菌相比较耐高温与各种酸碱度,故在高温阶段放线菌对分解木质素与纤维素起着重要的作用。主要有诺卡氏菌属、链霉菌属、芽孢杆菌属及小单胞菌属等;真菌中研究较多的就是青霉属、根霉属、曲霉属等,其中以木霉属的菌株纤维素酶活较高。以羧甲基纤维素钠与添加少量葡萄糖作为碳源,培养纤维素酶产生菌株,培养一定时间后,经刚果红染色与稀碱液固定,在菌落周围形成透明水解圈,根据透明圈的大小,快速定性鉴定纤维素酶产生菌酶活大小。与传统纤维素酶活检测方法比较,本方法菌丝生长快,两天后菌落经染色,透明圈边缘清晰,直观性强,与酶活力成一定线性关系。纤维素就是世界上所有植物的组成部分,就是地球上最为丰富且可再生的资源。随着世界能源形势趋于恶化,环境问题日益加剧,利用纤维素生产有高附加值资源的以维持人类可持续发展的研究方向近年来逐步成为科学研究的热点方向。利用微生物将纤维素、半纤维素降解转化为生物产品或生物能源即可缓解能源短缺、解决环境污染,又能形成新的产业。因此分离与筛选高酶活性的菌株就是有效利用纤维素物质的关键。 二、实验目的 从目标试样中分离筛选出具有降解纤维素能力的菌株。 三、实验材料: 1、样品的采集 1)风干土样E4-1、E2-6、 E2-6试样。 2)潮湿土样E4-1、E2-6、 E2-6试样。 3)牛粪样品2份
纤维素分解菌的筛选填空
分解纤维素的微生物的分离 一 基础知识 1. 纤维素是一种由 相连而成的高分子 类化合物，是植物 （细胞结构）的主要成分之一， __________是自然界中纤维素含量最高的天然产物。植物产生的纤维素在 的催化作用下分解。 2.完成下列过程 3．筛选纤维素分解菌的方法是 ，简称（ ）。该方法可以通过 反应直接筛选。 4．原理：刚果红与纤维素形成 ，当纤维素被 分解后，红色复合物无法形成，出现以 ________ 为中心的 ，我们可以通过 来筛选纤维素分解菌。 二 实验设计 1. 实验流程 【思考】本课题实验流程与课题2中的实验流程有哪些异同 ________________________________________________________________________________________________ 2. 实验操作要点 （1） 土壤取样 选择____________________环境，因为_______________________________.还可以将滤纸埋进土壤，这样做是为了___________________________________________. （2）选择培养 步骤：a.制备选择培养基：参照课本旁栏中的比例配制 该培养基从物理性质方面属于_______培养基，如何起到选择作用_______________________,怎么证明培养基 是否起到选择作用________________________________________________________ . b.选择培养的操作方法 c.目的：_________________________________________________________________________. 【思考】为什么选择培养能“浓缩”所需要的微生物 ______________________________________________________________________________________ (3)梯度稀释 （4）将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 a.制备培养基 b.接种菌液 （5）挑选产生透明圈的菌落 刚果红染色，挑选产生透明圈的菌落 常用的刚果红染色方法两种，一中是先_____________,再加入刚果红进行________反应，另一种是在___________就加入刚果红。 三 课题延伸 1．为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行 实验，纤维素酶的发酵方法有 发酵和 发酵。 2．纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的 ___ 含量进行定量测定。
卡拉胶降解菌的筛选
卡拉胶降解菌的筛选 摘要：利用梯度稀释平板涂布的方法将经过富集的卡拉胶降解菌样品在涂布于 平板上，以卡拉胶为唯一碳源，在适宜的环境下培养，得到单个菌落，达到卡 拉胶降解菌的初步筛选的目的。 关键字：卡拉胶降解菌、初筛 前言：卡拉胶(Carrageenan)又名角叉菜胶、鹿角藻胶，是从红藻中提取的一种高分子亲水性多糖。根据其乳糖残基上硫酸酯基团的不同，可分为K一型、c-型、A一型、弘一型等7种最小重复结构单位。A一卡拉胶是一种高硫酸酯化的天然多糖资源，其降解产物A一卡拉胶寡糖的活性研究已得到充分的开展，如抗凝血、抗病毒、抗肿瘤等[1]。国内外的研究者从提取、结构、活性等方面对卡拉胶进 行了研究[2]。而不同的卡拉胶具有不同的凝固性和表面活性，可用于凝固剂黏 合剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂等，广泛用于食品工业。[3] 正文： 一．器材：试管16支，玻璃涂棒一根，1ml移液管3支，酒精灯一个，培养皿24个，试管架，1个锥形瓶，烘箱，高压杀菌锅 二．试剂：K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O,FePO4·4H2O,CaCl2, H2O，NaNO3,NaCl卡拉胶，海水 三．步骤： 1.卡拉胶降解菌的初筛： （1）无机盐母液配制： K2HPO4·3H2O: 2.2g , MgSO4·7H2O: 1.25g ,FePO4·4H2O: 0.025 g , CaCl2: 0.25g 然后溶于水中，共配制250ml; [4] （2）培养基溶液配：NaNO3：0.7g , NaCl：5.25g ，卡拉胶：4.2g ， 溶于海水中，共配制350ml，并添加无机盐母液：35ml[5]
【人教版】生物选修一：2.3分解纤维素的微生物的分离教案设计
专题2 微生物的培养与应用 课题2.3 分解纤维素的微生物的分离 一、【课题目标】 （一）知识与技能 简述纤维素酶的种类及作用，从土壤中分离出分解纤维素的微生物；掌握从土壤中分离某种特定微生物的操作技术 （二）过程与方法 分析分离分解纤维素的微生物的实验流程，弄懂实验操作的原理 （三）情感、态度与价值观 领悟科学探究的方法，发展科学思维和创新能力 二、【课题重点】 从土壤中分离分解纤维素的微生物 三、【课题难点】 从土壤中分离分解纤维素的微生物 四、【教学方法】 启发式教学 五、【教学工具】 多媒体课件 六、【教学过程】 （一）引入新课 上节课我们探讨学习了土壤中尿素分解菌的分离与计数，这节课我们以纤维素分解菌的分离与纯化为例，巩固加深对这方面技术的理解和掌握。 （二）进行新课 1．基础知识 活动1：阅读“纤维素与纤维素酶”，回答下列问题： 1．1纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。 延伸：草食性动物是怎样消化食物中纤维素的？肠胃中的共生物生物。 1．2棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。纤维素的分解需要在纤维素酶的催化作用下完成，请完成下列过程： 〖思考1〗实验分析：P27的小实验是如何构成对照的？ 在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；尽管醋酸－醋酸钠缓冲液用量不同，但都能维持相同的pH。 〖思考2〗1个酶活力单位是指在温度为 25 ℃，其它反应条件最适宜情况下，在 1 min内转化 1mmol 的底物所需要的酶量。 活动2：阅读“纤维素分解菌的筛选”，回答下列问题： 1．3筛选纤维素分解菌的方法是刚果红染色法。该方法可以通过颜色反应直接筛选。 2．4其原理是：刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 2．实验设计 活动3：完成实验方案流程图，讨论回答问题：
纤维素降解菌株的筛选
分解纤维素的微生物的分离 栾旭东，张兴敏，周雪霞，闫超，何溢涛 （山东大学生命科学学院2005级生科基地班，济南250100） 摘要：纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，它能被土壤中某些微生物分解利用，是因为它们能够产生纤维素酶。本实验通过从土壤中分离分解纤维素的微生物，初步鉴定了其形态特征和生理生化特性，为日后更进一步的研究打下基础。 关键词：纤维素土壤微生物纯培养刚果红染色法 Abstract: cellulose is the most abundant polysaccharide on the earth, which can be digested by some microorganisms in the earth because they produce cellulase. In our experiment, we isolated these microorganisms from the earth and checked up the cells’ and colonies’ morphology and the bioreactions they can act. Key words:cellulose, microorganisms in the earth, pure culture, Congo red staining 资源和环境问题是人类在21世纪面临最主要的挑战。生物质资源是可再生资源，地球上每年光合作用的产物高达 1.5×1011—2.0×1011，是人类社会赖以生存的基本物质资源，其中90%以上为木质纤维素类物质[1]。目前这部分资源尚未得到充分的开发利用。随着世界人口迅速增长，矿产资源日渐枯竭，开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，即化工原料的“绿色化”，具有极其重要的意义和光明的发展前景。 地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%~60%能被土壤中的某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。而要研究这些微生物，首先要将它们从土壤中种类乏多的微生物中分离出来。 1.土壤中纤维素分解菌的分离[2] 土壤有“微生物的天然培养基”之称，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。 实验的具体操作步骤如下。 1.1土样的采集 土壤中的微生物，大约70%~90%是细菌。细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表约3~8cm的土壤层。因此，土壤取样时，一般要铲去表层土。另外，土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。综合各种因素，本小组从图书馆后院的落叶堆积丛取土样。
纤维素分解细菌的分离和鉴定
纤维素分解细菌的分离和鉴定 一．实验目的： 1.研究低温环境下纤维素降解细菌的分离与鉴定． 2.采用低温培养的方法从秸秆堆肥中筛选出3株分解纤维素的细茵。 3.通过PCR克隆这3株茵的16s rDNA并与相似菌株做比对．进一步构建分子进 化树．来研究其分类情况。 4.综合其个体形态、茵落形态、生理生化特征、16S rDNA发育树构建结果等分 类依据。 二．实验原理： 细菌进行化能异养、短杆状、无出芽分裂、好氧、革兰氏染色阴性．无芽孢、无丝状菌体、有细胞壁且能独立生存。应为其第二部分滑动细菌或第七部分的假单胞菌类。由于滑动细菌能在“固体表面和汽一水交界面缓慢滑动”，故其固体菌落边缘应不整齐，且其一般形成亮色肉眼可见的子实体。将灭菌的滤纸蘸取无菌生理盐水后贴在已凝固的平板上，用接种环蘸取土样，点样在平板滤纸上，15℃下培养10 d。用接种环从有滤纸水解透明圈的单菌落处刮取细菌，在贴有滤纸的初筛平板上划线，计数并且观察。 三、实验仪器： 1、材料试验材料为背阴处长时间堆放的秸秆堆肥表层； 2、培养基：初筛培养基。浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基”。：啦嘞1．00 g，MgS04·7H20 0．30 g，NaCl 0．10 g，F'eCl3O．0l g，NaN03 2．50 g，CaCi2 0．10 g，琼脂18．00 g，蒸馏水l000lnl，pH值7．0～7．2．121℃灭菌20min。无淀粉滤纸(浙江富阳纸厂)用浓度l％的醋酸浸泡一夜后用浓度2％的Na-2C03水溶液洗至中性，晾干备用。把上述处理过的滤纸剪成直径约为8 ca的圆形滤纸片．放在干净的平皿中，用报纸包好．采用湿热的方法灭菌； 3、复筛培养基。浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基：啦P04 1．009，m．庐04‘7H200．309。NaO 0．109．FeCl30．01g，NaN03 2．50 g．CaCl20．10g，羧甲基纤维素钠lO．00 g，琼脂18．00g，蒸馏水10130ml，pH值7．0—7．2，121℃灭菌20 min。 4、牛肉膏蛋白胨固体培养基； 5、生理生化特征鉴定培养基。 四、实验步骤： 1、菌种分离 菌种初筛。将灭菌的滤纸蘸取无菌生理盐水后贴在已凝固的平板上，用接种环蘸取土样，点样在平板滤纸上，15℃下培养10 d。用接种环从有滤纸水解透明圈的单菌落处刮取细菌，在 贴有滤纸的初筛平板上划线，15℃下培养10 d。重复此操作至菌种初步纯化。 2、菌种复筛。 用接种环从已初步纯化的初筛平板上滤纸水解透明圈的菌落处，刮取菌种在复筛平板上划线，15℃下培养7 d，得到单菌落。将分离纯化的单菌落回接到初筛培养基上，观察其对滤纸的分解。将分离到的单菌落接种到牛肉膏蛋白胨培养基上。15℃下培养7 d,4℃保留菌种或用作各种鉴定。
纤维素降解细菌的筛选及其培养基的优化
纤维素降解细菌的筛选及其培养基的优化自然界中能够降解和利用纤维素的微生物种类繁多，真菌、细菌、放线菌以及部分酵母菌等很多主要的微生物类群中都有，但长久以来人们一直以产酸性胞外纤维索酶的木霉、曲霉等真菌作为主要的研究对象。近年来，随着纤维素酶在洗涤剂、棉织品水洗抛光整理和制浆造纸等行业上的应用和发展，使得由细菌产生的中性以及碱性纤维素酶得到广泛重视，尤其是细菌产生的胞外纤维素酶拥有简化发酵工艺，节约资源的优势，正逐步显示出它良好的使用性能和巨大的工业价值。 1 材料与方法 1．1 材料 1．1．1 土壤样品 采集造纸厂排水处附近中性偏碱性土壤。 1．1．2 培养基 (1)筛选培养基A：蛋白胨10 g，羧甲基纤维素钠10 g，NaC1 5 g，磷酸二氢钾1 g，琼脂18 g，水1 000 ml，pH值调至8。 筛选培养基B：磷酸二氢钾2 g，硫酸铵 1．4 g，硫酸镁 0．3 g，氯化钙 0．3 g，CMC 20 g，琼脂18 g，水1 000 ml，pH值调至8。 (2)斜面培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaC1 5 g，琼脂15～20 g，水1 000 ml，pH值7。 (3)种子培养基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaC1 10 g，水1 000 ml，pH值7。 (4)基础培养基：羧甲基纤维素钠10 g，蛋白胨10 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁 0．2 g，NaC1 10 g水1 000 ml，pH值7。 1．2 方法 1．2．1 刚果红染色鉴定法 1．2．2 粗酶液制备方法 将发酵液于4 500 r／rain离心15 rain，取其上清液收集保存。 1．2．3 酶活测定方法 0．5 的粗酶液加入1．5 用柠檬酸缓冲液配制的0．51％的CMC．Na溶液，50℃作用15 min，加入DNS 1．5 沸水浴5 rain，540 nm测光吸收，酶活力定义为每1 h 产生1 g还原糖所需的酶量为一个纤维素酶活力单位用1 U／ml表示。 2．3 培养基的优化 2．3．1 最佳碳源的确定 改变基础培养基中碳源的种类和浓度，培养后测定酶活力。 2．3．2 最佳氮源的确定 改变基础培养基中氮源的种类和浓度，培养后测定酶活力。 2．3．3 最优培养基的确定 考虑到细菌的产酶除了碳源、氮源外，钾、镁、钠等无机离子对其也有影响，综合上述单项试 验结果，选用麸皮作为碳源(A)，蛋白胨作为氮源(B)，磷酸二氢钾（C)，硫酸镁 (D)，NaC1(E)作为无机盐进行L (45 )正交试验。 16 因素水平表
纤维素分解菌的筛选填空
2.3 分解纤维素的微生物的分离 一 基础知识 1. 纤维素是一种由 相连而成的高分子 类化合物，是植物 （细胞结构）的主要成分之一， __________是自然界中纤维素含量最高的天然产物。植物产生的纤维素在 的催化作用下分解。 2.完成下列过程 3．筛选纤维素分解菌的方法是 ，简称（ ）。该方法可以通过 反应直接筛选。 4．原理：刚果红与纤维素形成 ，当纤维素被 分解后，红色复合物无法形成，出现以________ 为中心的 ，我们可以通过 来筛选纤维素分解菌。 二 实验设计 1. 实验流程 【思考】本课题实验流程与课题2中的实验流程有哪些异同？ ________________________________________________________________________________________________ 2. 实验操作要点 （1） 土壤取样 选择____________________环境，因为_______________________________.还可以将滤纸埋进土壤，这样做是为了___________________________________________. （2）选择培养 步骤：a.制备选择培养基：参照课本旁栏中的比例配制 该培养基从物理性质方面属于_______培养基，如何起到选择作用_______________________,怎么证明培养基 是否起到选择作用________________________________________________________ . b.选择培养的操作方法 c.目的：_________________________________________________________________________. 【思考】为什么选择培养能“浓缩”所需要的微生物？ ______________________________________________________________________________________ (3)梯度稀释 （4）将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 a.制备培养基 b.接种菌液 （5）挑选产生透明圈的菌落 刚果红染色，挑选产生透明圈的菌落 常用的刚果红染色方法两种，一中是先_____________,再加入刚果红进行________反应，另一种是在___________就加入刚果红。 三 课题延伸 1．为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行 实验，纤维素酶的发酵方法有 发酵和 发酵。 2．纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的 ___ 含量进行定量测定。 【练习题】某同学在做微生物实验时，不小心把圆褐固氮菌和酵母菌混在一起。该同学设计下面的实验，分离得纯度较高的圆褐固氮菌和酵母菌。 (1)实验原理：圆褐固氮菌是自生固氮菌，能在无氮培养条件下生长繁殖而酵母菌则不能；青霉素不影响酵母菌的生长繁殖，而会抑制圆褐固氮菌的生长繁殖。 (2)材料用具：（略） (3)主要步骤：①制备两种培养基，一种是 培养基，另一种是 培养基，将两种培养基各自分成两份，依次标上A 、a 和B 、b 。 ②分别向A 、B 培养基中接种混合菌，适宜条件培养了3—4天。 ③分别从A 、B 培养基的菌落中挑取生长良好的菌并分别接种到a 、b 培养基中，适宜条件下培养3—4天。 (4)请同答：①将题中的空处填充完整： 培养基和 培养基。 ②本实验中，根据上述原理配制的培养基的类型属于 培养基。 ③根据所需目的配制上述培养基时除营养要协调外还应注意 。 ④实验步骤中第③步的目的是 。 ⑤圆褐固氮菌与酵母菌在结构上的主要差异为 。 ⑥青霉素抑制圆褐固氮菌的生长繁殖，其作用机理是破坏或抑制其细胞壁的形成。请据此推测不影响酵母菌 等真菌生长繁殖的原因是______________________________________________________________.
实验三高效苯酚降解菌的筛选及其性能测定课件.doc
实验三高效苯酚降解菌的筛选及其性能测定 一、实验目的 1、掌握微生物分离纯化的基本操作； 2、掌握用选择性培养基从环境中分离苯酚降解菌的原理和方法； 3、掌握微生物对酚降解能力的测定方法； 4、掌握4-氨基安替比林法测定苯酚含量的方法。 二、实验原理 在工业废水的生物处理中，对污染成分单一的有毒废水，可以选育特定的高效菌株进行处理。这些高效菌株以有机污染物作为其生长所需的能源、碳源或氮源，从而使有机污染物得以降解，具有处理效率高、耐受毒性强等优点。 苯酚是一种在自然条件下难降解的有机物，其长期残留于空气、水体、土壤中，会造成严重的环境污染，对人体、动物有较高毒性。本实验通过筛选苯酚降 解菌来处理含酚废水，将苯酚降解为为二氧化碳和水，消除对环境的污染。 + COOHCH2CH2COOH CH3COOH C O2+H2O 从环境中采样后，在以苯酚为唯一碳源的培养基中，经富集培养、分离纯化、降解实验和性能测定，可筛选出高效酚降解菌。 三、实验器材与试剂 1、样品 实验土样采自校园污水处理厂。 2、器材 恒温培养箱、恒温摇床、分光光度计、比色皿、试管、250mL三角瓶、100mL 容量瓶、培养皿、涂布玻棒、量筒、天平、灭菌锅、酒精灯、接种环、棉花、棉 线、牛皮纸、pH 试纸。 3、试剂 葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、苯酚、四硼酸钠（Na2B4O7）、4-氨基安替比林、过硫酸铵（（NH4）2S2O8）、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、琼脂。
苯酚标准溶液：称取分析纯苯酚 1.0g，溶于蒸馏水中，稀释至1000mL，摇 匀。此溶液溶度为1000mg/L。测定标准曲线时将苯酚浓度稀释至100mg/L。 Na2B4O7 饱和溶液：称取N a2B4O7 40g，溶于1L 蒸馏水中，冷却后使用，此 溶液的pH值为10.1。 3% 4-氨基安替比林溶液：称取分析纯4-氨基安替比林3g，溶于蒸馏水中， 并稀释至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。 2% （NH4）2S2O8 溶液：称取分析出（NH4）2S2O8 2g，溶于蒸馏水中，并稀 释至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。 4、培养基 富集培养基：蛋白胨0.5g，K2HPO4 0.1g，MgSO4 0.05g，水1000mL，调节pH 7.2-7.4，高压蒸汽灭菌，冷却后视需要添加适量的苯酚。 基础培养基：K2HPO4 0.6g，KH2PO4 0.4g，NH4NO3 0.5g，MgSO4 0.2g，CaC2l 0.025g，水1000mL，调节pH 7.0-7.5，高压蒸汽灭菌，冷却后视需要添加适量的苯酚。 四、实验步骤 （一）富集培养和驯化 采集活性污泥或土样，接种于装有100mL 富集培养基和玻璃珠并加有适量 苯酚（50mg/L）的三角瓶中，30℃振荡培养。待菌生长后，用无菌移液管吸取 1mL 转至另一个装有100mL 富集培养基和玻璃珠并加有适量苯酚的三角瓶中， 如此连续转接2-3 次，每次所加的苯酚量适当增加，最后可得酚降解菌占绝对优 势的混合培养物。 （二）平板分离和纯化 1、用无菌移液管吸取经富集培养的混合液10mL，注入90mL无菌水中，充 分混匀，并继续稀释到适当浓度。 2、取适当浓度的稀释菌液，加一滴于固体平板（由富集培养基加入2%的琼 脂组成，倒平板时添加适量的苯酚，浓度达到200 mg/L。）中央，用无菌玻璃涂 棒把滴加在平板上的菌液涂平，盖好皿盖，每个稀释度做2-3 个重复。 3、室温放置一段时间，待接种菌液被培养基吸收后，倒置于30℃恒温箱中 培养2-3d。 4、挑选不同菌落形态，在含适量苯酚的固体平板上划线纯化。平板倒置于
纤维素分解菌的分离和鉴定教学提纲
纤维素分解菌的分离 和鉴定
纤维素降解菌类的分离与鉴定系列实验 一、实验背景 纤维素是植物细胞壁主要成分，属于多糖类物质，是地球上数量最大的可再生资源。如能利用微生物将其转化为生物产品或生物能源，即可缓解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。由于在自然界中存在着大量产纤维素酶的细菌和真菌，因而纤维素的生物降解主要依赖于微生物的作用。从20世纪40-50年代起，针对产纤维素酶的微生物的分离筛选就进行了大量的工作，并逐步建立起一套较完整的分离筛选方法。迄今为止有关纤维素降解菌分离筛选的研究报导已有很多，如细菌中的生抱噬纤维菌属、噬纤维菌属及纤维单胞菌属等；放线菌由于能形成芽抱，与真菌相比较耐高温和各种酸碱度，故在高温阶段放线菌对分解木质素和纤维素起着重要的作用。主要有诺卡氏菌属、链霉菌属、芽抱杆菌属及小单胞菌属等；真菌中研究较多的是青霉属、根霉属、曲霉属等，其中以木霉属的菌株纤维素酶活较高。以羧甲基纤维素钠和添加少量葡萄糖作为碳源，培养纤维素酶产生菌株，培养一定时间后，经刚果红染色和稀碱液固定，在菌落周围形成透明水解圈，根据透明圈的大小，快速定性鉴定纤维素酶产生菌酶活大小。与传统纤维素酶活检测方法比较，本方法菌丝生长快，两天后菌落经染色，透明圈边缘清晰，直观性强，与酶活力成一定线性关系。纤维素是世界上所有植物的组成部分，是地球上最为丰富且可再生的资源。随着世界能源形势趋于恶化，环境问题日益加剧，利用纤维素生产有高附加值资源的以维持人类可持续发展的研究方向近年来逐步成为科学研究的热点方向。利用微生物将纤维素、半纤维素降解转化为生物产品或生物能源即可缓 解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。因此分离和筛选高酶活性的 菌株是有效利用纤维素物质的关键。
纤维素降解菌系的筛选及降解稻草条件研究
纤维素降解菌系的筛选及降解稻草条件研究 摘要:以已分离的11株纤维素降解菌为材料,采用滤纸崩解法和透明圈法,初步筛选出4株纤维素降解能力较强的菌株?将这4株单菌进行两两组合,研究混合菌系在9d内的CMC酶活和FPA酶活与单菌发酵之间的异同?结果表明,混合菌发酵CMC酶活和FPA酶活均优于单一菌株;同时筛选出一组具有高降解能力的混合菌体系;并对该混合菌系降解稻草的最适反应温度?最适初始pH值?产生还原糖的时间进行了研究,结果表明,在30℃?pH值4.5?发酵96 h时混合菌降解稻草的效果最好? 关键词:纤维素降解菌;筛选;CMC酶活;FPA酶活;还原糖含量;降解条件Screening of Cellulose Degrading Microorganism and the Degrading Condition of Rice Straw Abstract: Four strains with strong degradation ability to cellulose materials were screened out of 11 bacteria using filter paper degradation method and clear halo method. Then a mixed germ with higher degradation ability was obtained as the CMC and FPA enzyme activity of mixed bacteria and pure bacterium was compared. The optimum degrading condition of the mixed germ to rice straw was 30℃, pH 4.5, and fermentation for 96 h. Key words: cellulose degrading microorganism; screening; CMC enzyme activity; FPA enzyme activity; degrading condition 纤维素是地球上最廉价?最丰富的可再生资源?全世界每年纤维素及半纤维素的生成量为850亿t?利用微生物产生的纤维素酶来分解和转化纤维素是纤维素利用的有效途径?纤维素的生物降解对开辟新能源和防止其污染环境有重要意义,一直是生物技术领域的研究重点[1,2]?在长期生产实践中发现该生物过程是微生物单独作用不能完成或只能微弱进行的,必须依靠两种或两种以上的微生物共同作用才能完成,微生物混合培养或混合发酵已越来越受重视[3]?而且国内对产纤维素酶能力较强的单一菌种研究较多,菌种混合发酵的研究较少[4,5]?本试验在纤维素降解单一菌株研究的基础上,着力于筛选降解纤维素的混合菌系,旨在为纤维素的高效转化提供依据? 1材料与方法 1.1菌种 纤维素降解菌分别来自枯树根?烂菜叶?牛粪和牛胃中?
分解纤维素菌种的筛选
分解纤维素菌种的筛选 张 功 峥 嵘 (内蒙古师范大学生物系) 摘 要:本文通过平皿分离、摇瓶培养 、固态发酵等步骤,从8种微生物中筛选出分解纤维素能力和蛋白质合成能力强的菌种——毛壳菌。 关键词:分解纤维素;菌种;筛选 我国每年的农作物秸杆如麦秸、稻草、玉米秸、高梁秸、豆秸等约8亿吨之多〔1〕。这些秸杆饲料中粗纤维的主要成份是木质素、纤维素、半纤维素和果胶物质,它们都属于家禽、家畜难以直接消化或消化率低的粗纤维物质〔2〕。 本研究的目的是筛选出不仅能分解纤维素,且可提高蛋白含量的菌种,利用简单、经济、可操作性强的微生物发酵技术,将纤维素物质转化成糖和蛋白质,提高秸杆的营养价值,开辟秸杆利用的新途径。 1 材料和方法111 材料 11112 供试秸杆:新鲜、无霉变晒干后的玉米秸杆 和小麦秸杆。 11112 供试菌种:部分由中科院微生物所菌种保藏 中心购得,另一部分由本实验室提供,包括:绿色木霉〔T richoderm a viride Pers .ex F r .〕、白地霉〔Geo trichum candidum L ink 〕、藤仓赤霉〔Gibberel 2la fu jiku ro i (Ss w .)W o llenw 〕、球毛壳菌 〔Chaetom ium globo sum kunze ex Fx .〕 、紫孢侧耳〔P leu ro tu s sap idu s (Schu l 2.)Sacc 〕 、纤维单胞菌〔Cellu lom ono s 〕、黑曲霉〔A sp ergillu s n iger 〕、匍匐青霉〔Pen icillium decum ben s 〕 。11113 培养基:a 1平皿中培养基以羧甲基纤维素 钠(C M C —N a )代替查氏培养基中碳源蔗糖,其余配方不变;b 1摇瓶培养基:(N H 4)2SO 4215g ,KH 2PO 4015g ;K 2H PO 4014g ,M gSO 40105g ,玉米秸杆粉3g , 麸皮2g ,水150m l ,pH 自然;C 1固态培养基:50g 干料中90%的粉碎的秸杆粉,10%麸皮,(N H 4)2SO 45g ,KH 2PO 41g ,K 2H PO 40.8g ,M gSO 40.1g ,水150m l 。其中供试秸杆有两种,即玉米和小麦 秸杆。2 方法211 平皿筛选 将平皿培养基倒入24个已灭菌的平皿,待凝固后,分别接入供试菌,每种菌接3个平皿,置于恒温培养箱30℃培养3～5天后,用刚果红染色,再用N aC l 稀溶液冲洗平板,能产生纤维素酶的菌落周围 会变成清晰的白色半透明圈。分别观察平皿菌落周围水解C M C —N a 半透明圈直径的大小,结果见表1。 212 摇瓶培养 将供试菌种从平皿培养基上挑取,分别接入8个摇瓶培养基内,在32℃,摇床振幅8c m ,转速190r m in ,连续发酵培养72小时。 表1 半透明圈直径比较 单位:c m 绿色木霉藤仓赤霉白地霉球毛壳菌紫孢侧耳纤维单胞菌黑曲霉青霉 直径 211 114 115 210 214 112 113 214 213 固态浅层培养 接种量按固体培养料干重的10%,将每种供试菌摇瓶培养液接入2种已灭菌的固体培养料中,分别混匀后在浅盘中堆成4c m 厚,在31℃相对湿度90%条件下发酵5天。 214 发酵前后固体培养料的组分测定 6 7内蒙古科技与经济 2000年文献版
分解纤维素的微生物的分离教案
专题2课题3：分解纤维素的微生物的分离 【课程标准】 1．简述纤维素酶的种类及作用 2．从土壤中分离出分解纤维素的微生物 3．讨论分解纤维素的微生物的应用价值。 【课题重点】 从土壤中分离分解纤维素的微生物。 【课题难点】 从土壤中分离分解纤维素的微生物。 【基础知识】 1．是纤维素含量最高的天然产物。 2．纤维素酶是一种酶，它至少包括三种组分，即，，。前两种酶使纤维素分解为，第三种酶将纤维素分解为。 3。纤维素分解菌的筛选方法是利用。 4。刚果红染色法的原理是。 5．分解纤维素的微生物的分离的试验流程是、、、、6．鉴别培养基用于菌种的鉴别，其中加入可以鉴别出 出现的现象是。 7．选择培养的操作方法是 。 8．常用的刚果红染色法有两种即 。 9．分解纤维素的微生物的分离实验完成后为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行实验，纤维素酶的发酵方法有两种即、。 10．分解纤维素的微生物的分离实验中要选择样品进行分离纤维素分解菌，该样品的特点是、。作出这种选择的理由是。 11．选择培养能够浓缩所需微生物，原因是。 12．分解纤维素的微生物的分离与土壤中分解尿素的细菌的分离流程有何区别？ 13．刚果红染色法有两种，这两种的主要优缺点是什么？
【跟踪练习】 1．下列生物能分解纤维素的是（） （1）人（2）兔（3）牛（4）蘑菇（5）纤维杆菌 A（1）（2）（3）（4）（5）B（2）（3）（5） C （2）（3）（4）（5）D（3）（5） 2．纤维素分解菌的培养基中胶木膏能提供的主要营养物质是（） （1）碳源（2）氮源（3）生长因子（4）无机盐 A（3）B（1）（2）C（1）（2）（3）D（1）（2）（3）（4） 3．从土壤中筛选蛋白酶产生菌时，所用培养基为（） A加富培养基 B 选择培养基 C 基础培养基D鉴别培养基 4．分离土壤中纤维素分解菌用到的方法是（） （1）稀释倒平板法（2）涂布平板法（3）单细胞挑取法（4）选择培养分离A（1）（2）B（2）（3）（4）C（2）（3）D（1）（3）（4） 5．鉴别纤维素分解菌的培养基中碳源为（） A CMC-Na B 木聚糖 C 纤维素 D 裂解酶 6．在酸性贫瘠的土壤中分解纤维素占优势的菌为（） A真菌 B 细菌 C 兼性厌氧细菌和真菌 D 放线菌 7．CX 酶能水解（） A纤维素和CMC-Na B纤维素和果胶 C纤维二糖和微晶纤维D麦芽糖和蔗糖 8．在加入刚果红的培养基中出现透明圈的菌落是（） A分解尿素的细菌 B 消化细菌 C 分解纤维素的细菌 D 乳酸菌 9．在对纤维素分解菌进行培养时，培养基中酵母膏的主要作用是（） A提供碳源 B 提供氮源 C 提供微生素 D 凝固剂 10．要将能分解纤维素的细菌从土壤中分离出来，应将它们接种在( ) A 加入指示剂的鉴别培养基上 B 含有蛋白胨的固体培养基上 C 只含纤维素粉无其他碳源的选择培养基上 D 含四大营养素的培养基上 11．纤维素分解菌选择培养基的选择作用原因在于（） A 硝酸钠 B 氯化钾 C 酵母膏 D 纤维素粉 12．选择培养的结果，培养液变（） A 清澈 B 浑浊 C 红色 D 产生透明圈 13．在对纤维素分解菌进行选择培养时用液体培养基的目的是（） A 可获得大量菌体 B 纤维素分解菌适宜在液体培养基上生长 C 可以充分利用培养基中的营养物质 D 可获得高纯度的纤维素分解菌
多环芳烃高效降解菌的筛选.
多环芳烃高效降解菌的筛选 2011-01-18 摘要：以多环芳烃芘和苯并(a)芘为供试物,对多株土著菌和引进菌同时进行筛选试验.结果表明,引进菌经过驯化后对芘和苯并(a)芘都具有一定的降解能力,降解率在30%～80%,通过SPSS数理统计分析软件对数据进行处理后得出,引进细菌B61、B67、M-B和引进真菌Y219、Y220、M-Y作为固定化包埋的`菌种;土著菌对芘和苯并(a)芘的降解率可达40%～95%,经过筛选后确定,土著细菌B02、B07、B09和土著真菌F02、F05、F06作为固定化包埋的菌种.通过试验对上述各菌进行了生长曲线的测定,细菌和酵母菌的对数生长期是5～20 h,真菌的对数生长期是10～55 h,这为固定化微生物提供了一定的前提条件.作者：王 新李培军巩宗强张辉 V.A.Ver khozina WANG Xin LI Pei-jun GONG Zong-qiang ZHANG Hui V.A.Ver khozina 作者单位：王新,WANG Xin(中国科学院沈阳应用生态研究所,辽宁,沈阳,110016;沈阳工业大学理学院,辽宁,沈阳,110023) 李培军,巩宗强,张辉,LI Pei-jun,GONG Zong-qiang,ZHANG Hui(中国科学院沈阳应用生态研究所,辽宁,沈阳,110016) V.A.Ver khozina,V.A.Ver khozina(俄罗斯科学院西伯利亚分院闽诺格拉多夫地质研究所,伊尔库茨克,664033) 期刊：农业环境科学学报 ISTICPKU Journal：JOURNAL OF AGRO-ENVIRONMENT SCIENCE 年，卷(期)：2007, 26(z1) 分类号：X172 关键词：土著菌引进菌筛选对数生长期
一株纤维素降解菌的筛选与鉴定
农业基础科学现代农业科技2012年第2期 纤维素是自然界中储存量最大、分布最广泛的可再生天然碳水化合物[1]，其主要存在于秸秆、木材等高等植物的细胞壁中，每年通过光合作用可生产纤维素逾10亿t[2]。然而纤维素难以降解，导致其利用具有一定的局限性。目前，降解纤维素最有效、最经济的方法是生物降解法，即通过细菌、放线菌以及真菌等生物产生的纤维素酶来催化降解纤维素。因此，寻找和驯化产生高效纤维素酶的微生物是有效降解纤维素的前提条件。该研究从土壤中筛选降解纤维素的菌株，并对其产酶条件进行研究，以为纤维素的降解和合理利用提供一定的资源。 1材料与方法 1.1试验材料 1.1.1样品来源。样品取自重庆市缙云山落叶覆盖的腐殖层土壤。 1.1.2培养基。LB培养基、刚果红培养基[3]、羧甲基纤维素培养基[4]。 1.2试验方法 1.2.1纤维素降解菌的初筛和纯化。纤维素降解菌的初筛和纯化按照卢月霞等[5]的方法进行。 1.2.2纤维素降解菌的复筛。分别将纯化后的单菌落点样于刚果红培养基中，每个平板点1个菌种，且只点3个样，降解圈直径（D）与菌落直径（d）比值的大小可以直接反应纤维素酶活的相对大小[6]。因此，筛选降解圈直径与菌落直径比值最大的菌落，即为纤维素高效降解菌，用CMC培养基作斜面培养，4℃保存。 1.2.316s rRNA测序。使用小量细菌基因组DNA抽提试剂盒对纤维素降解菌进行基因DNA提取，以此为模板，以通用引物8F和1495R进行PCR扩增16s rRNA。PCR体系为：D.W14.5μL，Buffer（Mg2+free）2.5μL，Mg2+1.5μL，dNTP2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板2μL，Taq酶2U。反应条件：95℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环，扩增结束后72℃延伸10 min。扩增后的PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳（100V，30 min）进行分析，将在1000～2000bp出现较亮条带的样品送去宝生物公司进行测序。 1.2.4纤维素酶酶活的测定。按照李慧君等[7]的方法进行粗酶的提取，同时通过DNS显色检测酶活，葡萄糖标准曲线的绘制以及酶活的检测具体操作参照GB20287-2006[8]。酶活力单位（U）：1mL原样酶液，1min产生1μg葡萄糖定义为1个酶活力单位。 1.2.5降解菌培养条件的优化。研究不用培养温度、pH值、碳源、氮源对其产酶的影响，并在各因子最适条件下培养该菌，检测其产酶酶活。 2结果与分析 2.1纤维素降解菌的筛选与纯化 经过初筛，得到12株具有降解能力的菌株，再经过复筛得到5株较强降解能力的菌株，其中以菌株X10的降解能力最强，初步判断该菌为纤维素降解菌。菌株X10点样培养后透明降解圈如图1所示（经过1mol/L HCl处理呈蓝紫色），测定其D∶d=2∶21。 图1X10 菌透明降解圈 一株纤维素降解菌的筛选与鉴定 李艳红 （西南大学生命科学学院，重庆400715） 摘要从落叶覆盖的腐殖层土壤中富集、分离得到12株纤维素降解菌，从中筛选出一株高效降解菌（X10），研究其最适宜的培养条件为：配制以葡萄糖+微晶纤维素（1∶1）为碳源、以蛋白胨+牛肉膏（1∶1）为氮源的培养基，pH值7.5，30℃下培养40h，测得纤维素降解酶酶活可达到67.44U。通过对其16s rRNA测序鉴定，该菌与氧化微杆菌（Microbacterium oxydans）有99%的同源性。纤维素降解菌的选育可为高效生产纤维素酶提供新的菌种来源。 关键词纤维素降解菌；筛选；鉴定；酶活 中图分类号Q93-331文献标识码A文章编号1007-5739（2012）02-0034-02 Screening and Identification of Cellulose Degradation Bacteria LI Yan-hong （College of Life Science，Southwest University，Chongqing400715） Abstract12cellulose-degrading bacterias were enriched and isolated from the leaves of the humus layer covering the soil and a high-degrading bacteria（X10）was selected from these.The optimal culture conditions of the bacteria were as follows：took the culture medium containing glucose+micrite cellulose（1∶1）as carbon sources，peptone+beef（1∶1）as nitrogen sources，pH7.5，under30℃，with the culture time was40h，the cellulose-degrading enzyme activity was up to67.44U.Through its16s rRNA sequencing，the homology of bacteria and Microbacterium oxydans were 99%.The selection of cellulose-degrading bacteria provided a new source of bacteria for the efficient production of cellulase. Key words cellulose degradation bacteria；screening；identification；enzyme activity 收稿日期2011-11-28 34