化学基因组学研究进展及其应用

?评　述?

【收稿日期】　2003210227

【基金项目】　国家自然科学基金重大项目(N o.202993030);国家重点基础研究发展规划“973”项目(N o.2001C B510306)资助【3通讯作者】　罗国安:教授,清华大学生命科学与工程研究院院长助理;T el :010*********,E 2mail :luoga @https://www.360docs.net/doc/3312328428.html, 化学基因组学研究进展及其应用

叶能胜,梁琼麟,罗国安3,冯　雪,王义明

清华大学生命科学与工程研究院,北京100084

【摘　要】　化学基因组学作为药物发现的新模式,组合了基因组学、蛋白质组学、组合化学及细胞筛选等领域的新技术,加快了新药研发的过程。本文介绍了化学基因组学研究的方法学及典型的技术平台,评述了化学基因组学在基因、蛋白质功能分析研究的概况及其应用于新药发现中的进展。

【关键词】　化学基因组学;药物发现;功能分析;小分子配体

【中图分类号】　Q812 【文献标识码】　A 【文章编号】　167223651(2004)022*******

被誉为生命科学领域“登月计划”的人类基因计划(Human G enome Project ,HG P )完成了对人类基因组30亿对核苷酸的序列测定工作,是人类第一次在分子水平上全面认识自我[1]。同时,HG P 研究成果将对医学、药学、生物学等领域产生深远的影响,但是如何将HG P 研究成果服务于人类的健康事业是科学家们关心的问题。2003年4月Na 2ture 杂志发表了美国国家人类基因组研究所(Na 2tional Human G enome Research Institute ,NHG RI )从生物学、健康、社会等角度描绘的基因组学研究蓝图[2],基因组学研究的重心也开始从结构基因组学开始向功能基因组学过渡,从而逐步实现基因组学研究的实际应用价值,如疾病的基因诊断、基因治疗以及基因工程药物等,基因组学研究开始进入“后基因组学时代”,化学基因组学作为后基因组学时代又一新兴的研究领域倍受关注。

本文结合国际上各生物医药企业、科研机构在化学基因组学方面的研究情况,对化学基因组学及其在基因、蛋白质功能分析和新药开发中的应用进展进行评述。1　化学基因组学

化学基因组学(Chemical G enomics 或Chem o 2

genomics )作为后基因组学时代的新技术,是基因

组学与药物发现之间的桥梁和纽带,将成为功能

基因组学研究的有力工具。化学基因组学技术整合了组合化学、基因组学、蛋白质组学、分子生物学、药物学等领域的相关技术,采用具有生物活性的化学小分子配体作为探针,研究与人类疾病密切相关的基因、蛋白质的生物功能,同时为新药开发提供具有高亲和性的药物先导化合物,是后基因组学时代药物发现新模式,将极大加快制药工业的发展[3,4]。化学基因组学药物发现模式的一般程序包括靶点发现、高通量筛选、组合化学合成、生物学功能测试等。1.1　靶点发现

人类基因组计划为揭示人类疾病机理提供了大量的基因信息,如与人类疾病相关的疾病基因及基因编码的相关蛋白信息,这些与疾病密切相关基因和蛋白都可以作为潜在的药物靶点,用于新药开发[5]。寻找与人类疾病相关的药物靶点是新药研发的第一个环节。目前人们共发现具有药理学意义的药物作用靶点大约500个,而根据人类基因组学计划研究成果估计,人体内可能的药物作用靶点大约有5000个,更多的药物作用靶点有待于进一步挖掘。目前应用于新药靶点发现的技术有基因组学技术[6]、蛋白质组学技术[7]以及生物信息学技术[8]。基因组学技术包含差异基因表达(Differential G ene Expression ,DGE )、表达序列标签(Expressed Sequence T ags ,EST )等技术[9]。蛋白质组学技术在蛋白质水平上研究疾病状态以及正常状态下的细胞或组织的蛋白质差异变化,可

以发现潜在的药物靶蛋白,也有人称化学基因组学是蛋白质组学和疾病治疗间的桥梁[10]。无论是靶基因还是靶蛋白,其与疾病间的关系尚不清楚,但是作为潜在的药物靶点并不影响其对小分子配体的亲和选择作用,在疾病细胞或动物模型的活性检测及临床研究中可以进一步了解靶点与疾病间的关系,实现对靶基因或蛋白的功能分析,从分子水平上揭示疾病机理及其治疗机制。

1.2　高通量筛选

高通量筛选(High2Throughput Screening,HTS)是20世纪后期发展起来的一项新技术[11]。随着功能基因组研究的发展和分子生物学、分子病理学以及细胞生物学对新发现基因的功能研究的不断深入,可作为药物靶点的生物分子数目日益递增;另—方面,组合化学的发展使化学合成药物分子的不断增加。如何从多样化的小分子库中筛选出与各种药物靶点作用的有效先导化合物?高通量筛选技术正是顺应靶基因、靶蛋白及生物活性小分子多样性的特点而发展起来的,其核心部分由体外分子或细胞水平的筛选模型、计算机控制的操作系统和灵敏的生物反应检测系统组成。高通量筛选是化学基因组学技术平台的关键技术,可以为药物发现提供全新的筛选方法和手段,极大地提高药物筛选速度。

1.3　组合化学

经过高通量筛选技术遴选出来的新型先导化合物是否具有最佳药效?药物开发过程中需要对先导化合物进行结构优化,传统化学合成方法不能适应高通量快速筛选及众多药物靶标需筛选的要求。组合化学采用适当的化学方法,借助组合合成仪,在特定的分子母核上引入不同的基团,产生大量的新化合物,构建不同的化合物库[12]。在药物筛选研究中,不同分子结构的化合物库可以用于不同疾病、不同模型的筛选。多组分反应(Multi2C om ponent Reaction,MCR)则通过多反应原料同时反应,产生高复杂性的多样性反应产物,是一种快速有效的小分子合成方法[13]。组合化学合成方法可以为高通量筛选提供物质基础,扩大了药物发现的范围,适应了化学基因组学快速筛选的需求。组合化学与高通量筛选技术并驾齐驱,促进了新药开发领域的一次大的突破,已经成为新药发现和优化过程中不可缺少的核心技术[14]。

1.4　生物信息学

生物信息学是一门综合运用数学、信息科学、计算机技术等对生物学、医学的信息进行科学的组织、整理和归纳的科学。在新药研究中,药物作用靶点的发现,新药的筛选和发现,药物的临床前研究以及临床研究等各个环节,都与生物信息学有着密切的关系。基因组学、高通量筛选、组合化学等技术在化学基因组学中的应用,积累大量不同类型的生物和化学信息数据,有效地存储、管理、分析及整合这些数据是保障药物研发顺利快速的关键。生物信息学就是要实现从数据到知识的转化,从单一信息到可利用资源的转化[15]。其不仅要从复杂无序的信息海洋中搜索有用的数据,还要实现不同学科间的信息广泛交流,避免重复研究。同时,在对先导化合物分子进行优化过程中,生物信息学可以为组合化学的分子设计和化合物库的设计提供必要的生物信息,如功能蛋白质的结构信息、药物靶点的活性部位、立体结构信息等,使组合化学具有更强的目的性,从而提高了药物发现的成功率。

2　化学基因组学技术平台

生物活性小分子与靶蛋白间相互作用的是生命活动中基本的相互作用之一,用于分析生物活性小分子和靶蛋白间相互作用的新技术、新手段不断向快速、灵敏、智能化的特点发展,促进了对大量小分子化合物的高通量筛选技术不断发展。世界各国的制药企业根据企业自身技术特点分别发展了不同的高通量筛选技术和超高通量筛选技术,从而发展了各具特色的化学基因组学技术平台[16]。

2.1　差示扫描量热法[1]

当小分子配体与靶蛋白结合,导致表观熔点温度发生变化。表观熔点温度的变化与小分子配体与靶蛋白间的亲和力以及蛋白质的稳定程度有关,小分子配体与靶蛋白间的亲和常数可以根据熔点温度的变化计算。3DP公司利用这一特点发展了化学基因组学技术平台,技术平台中应用的高通量筛选技术主要是利用差示扫描量热法(Dif2 ferential Scanning Calorimetry,DSC)测定熔点温度来检测小分子配体与蛋白结合的情况。筛选技术采用384孔板模式进行筛选,每周完成对5000个小分子化合物的筛选工作,而靶蛋白的消耗量仅为1 mg。该技术平台可以用于基因靶点解码、先导化

合物产生、优化及生产高质量的药物。

2.2　生物质谱法

电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电离(M A LDI)两种软离子化技术的发展开辟了质谱技术分析生物大分子的新领域。作为蛋白质组学中鉴定蛋白的关键技术,质谱技术在疾病蛋白质组学、差异蛋白质组学或比较蛋白质组学中对潜在蛋白靶点的鉴定起着十分重要的作用,为新药研发提供了可靠的药物靶点。亲和生物质谱技术可以应用于生物大分子与小分子配体间的相互作用的研究。研究方法是将蛋白靶点与小分子化合物混合,然后直接进样进行质谱分析,在一级质谱中,根据小分子2靶蛋白复合物的分子离子一般出现在高质量数区域,对高质量数区域进行扫描,确定小分子2靶蛋白复合物,并作为二级质谱分析对象。选定目标复合物分子离子作为母离子,进行二次电离,控制条件有序地释放小分子配体,通过对不同质量数区域进行扫描,实现对小分子配体和靶点蛋白的同时识别并加以鉴定。在二级质谱分析过程中,释放小分子配体的实验条件参数可以作为考察小分子配体与靶点蛋白间亲和作用的参数之一。

NeoG enesis公司利用高效液相色谱与质谱连用(LC/MS)技术成功开发A LIS(Automated Ligand I2 dentification System)化学基因组学药物研发技术平台。通过QSC(Quantized Surface C om plementarity)计算方法设计能够与疾病靶蛋白结合的小分子,并根据分子量分组,对于每组中小分子都可以通过分子量准确鉴别,故也称为质量编码库;通过将靶蛋白与各分子组作用,采用体积排阻色谱法将配体2蛋白复合物与未结合的小分子分离,配体—蛋白复合物组可以通过LC/MS方法鉴别,确定与靶蛋白能够特异性紧密结合的小分子,A LIS全自动化操作平台每天可以完成对30万个小分子的筛选工作;最后,对与靶蛋白结合紧密的小分子进行结构优化并再次筛选获得最佳候选药物先导化合物;对小分子的结构信息及小分子与靶蛋白间的相互作用等信息进行处理,建立信息库[18]。

2.3　核磁共振

随着核磁共振技术(NMR)的发展,NMR技术已应用于药物的筛选[19,20]和设计领域[21]。在明确与疾病相关的靶蛋白的基础上,发展了生物大分子高亲和性配体的方法S AR2by2NMR(structure2activity relationship by NMR)。其基本方法是:采用基因工程方法制备15N标记的靶蛋白,通过NMR 技术从小分子化合物库中筛选出与靶蛋白有亲和特性的先导小分子;再次采用相同的方法筛选出与前一结合位点相邻的位点结合的另—个先导分子,对两个先导小分子化合物进行S AR筛选优化,确定两个先导分子。在选定两个先导分子片段之后,用多维NMR等技术测定蛋白质和两个配体的复合物的完整三维空间结构,确定两个配体在靶蛋白上确切的结合位置及其空间取向;基于上述三维结构设计恰当的连接桥将两个先导分子连接起来,使得到的分子和靶蛋白结合时保持各自独立时的结合位置及其空间取向,最终筛选得到一个高亲和性的配体。由于采用NMR技术可以综合多种药物设计的优势,能够在短时间内得到先导化合物,加快了药物发现的速度[22]。

2.4　亲和毛细管电泳

亲和毛细管电泳是研究小分子配体与药物靶点间相互作用的有效方法,由于小分子配体与靶点作用形成复合物改变了原来的电泳迁移速度,从而与小分子配体在不同时间流出,根据其迁移速度可以定量评价其亲和活性。Lorenzi[23]等利用亲和毛细管电泳前沿分析(Frontal Analysis)技术考察了一组小分子与蛋白transthyretin(TTR)之间的相互作用,发现flu fenamicacid和flurbiprofen与TTR 蛋白结合程度较其它分子高,具有潜在药学研究价值,并进一步测定了二者与TTR的结合常数及结合位点数。

2.5　生物相关技术

AC ADI A公司基于基因选择特点设计了R2 S AT化学基因组学技术平台,该技术平台可以实现多药物靶点的同时筛选。利用R2S AT技术平台进行超高通量筛选,成功鉴定出靶标选择性52羟色胺受体调控剂。该公司利用R2S AT技术平台从1997年开始进行化学基因组学相关研究,启动了16个药物发现工程,其中的3个新药已在开发之中[24]。

3　化学基因组学的应用

小分子配体由于分子体积小可以自由进入细胞内部,并与靶蛋白具有特异性的亲和作用,这些特点使得小分子配体广泛应用于与药物靶点相关的基因表达谱、蛋白表达谱和基因相互作用的全

功能分析等研究[25]。

孤儿核受体(Orphan nuclear receptors)作为转录因子,其功能可以通过疏水小分子来调节,化学基因组学方法则可以应用于孤儿核受体在胆酸代谢过程中的功能分析,同时提供具有潜在药用价值的小分子化合物[26]。如Wills on等以G W4064作为分子探针,用化学基因组学方法确认了肝组织中山核胆酸受体FXR调控的基因,同时还发现了另一种石胆酸受体PXR,这种受体也参与控制胆酸的生物合成和代谢过程,这表明FXR和PXR 共同作用来控制胆汁和尿胆酸的分泌过程。通过对FXR和PXR的功能分析为淤胆性肝炎提供新的治疗方法。

Watters on等[27]应用化学基因组学方法从合成化合物中寻找抑制神经炎症反应的小分子药物。研究发现在合成化合物的作用下,白介素21β、一氧化氮酶和Abetal242的作用被抑制,而有益的载脂蛋白E(ApoE)不被抑制,C OX22和p38M APK的活化作用也没有改变,表明新合成的化合物比现有的药物有更好的潜在药用价值。通过分析发现新合成化合物的结构框架是32氨基哒嗪(32AP),其已经应用于中枢神经系统类疾病的治疗,而且此类结构具有潜在的多样化衍生物,具有更进一步优化的必要以便发现更为有效的药物。

雷帕霉素(rapamycin)是一种具有抗真菌作用的大环内酯类抗生素,其靶蛋白(T arget of ra2 pamycin protein,T OR)信号传导涉及不同的细胞过程,极其复杂。Chan等[28]首次将酵母基因组缺失突变体应用于T OR的基因相互作用研究,通过测定酵母缺失突变体对雷帕霉素的相对敏感度来研究T OR与其它酵母基因间相互作用,结果表明106个突变体表现雷帕霉素敏感性表型,实现了T OR 的雷帕霉素敏感性功能全分析。

渥曼青霉素(w ortmannin)是来源自Penicillium wortmanni的小分子天然产物,在临床上用作免疫抑制和抗炎类药物,同时也是磷脂酰肌醇(PI)激酶的抑制剂。Z ewail等[29]人运用化学基因组学方法考察了渥曼青霉素与PI间的相互作用,通过对6025例酵母缺失株的筛选来确认导致对渥曼青霉素敏感的基因,渥曼青霉素在酵母缺失株中的反应通过它们对小分子化合物环己酰亚胺的反应来测定。研究结果表明当基因被删除时导致渥曼青霉素抗药性的基因有591个,另外476个基因分别被删除时导致渥曼青霉素超敏性。同时还报道了PI代谢途径与DNA复制等其他生物过程间的联系。从结果来看约1/6的基因在384孔板实验中实现了高通量快速筛选,表明化学基因组学在小分子的生物功能分析及药物基因组学研究中都有很重要的应用价值。

抗癌药物的发现是人类攻克癌症的重要环节,化学基因组学在抗癌药物的研发中发挥着越来越重要的作用,不但缩短了临床前的研究周期,而且降低了药物研究的风险[30,31],在癌症化疗中对抗肿瘤药物的抵制作用是影响癌症治疗的关键因素,通过化学基因组学技术则可以找出那些导致抗药性的基因或蛋白,为开发抗癌药物提供药物作用靶点[32]。

热休克蛋白HSP90是多种信号蛋白的结合蛋白,也被称为分子伴侣,当HSP90与突变或过量表达的信号蛋白结合则可能促进癌细胞的生长或存活,于是科学家致力于寻求有效的HSP90抑制剂来治疗癌症。Neckers[33]认为小分子化合物可以与信号蛋白相结合,改变信号蛋白的稳定性甚至使其降解,从而阻止了HSP90与信号蛋白间的结合, 172AAG就是HSP90抑制剂中的一种,已经进入临床Ⅰ期试验。在化学基因组学筛选中苯醌袢霉素(benzoquinone ansamycin)可以与HSP90结合,发现了新的HSP90抑制剂———根赤壳菌素(radicicol);筛选中发现新生霉素(nov obiocin)可以作为第三类结构小分子HSP90抑制剂,应用新生霉素还鉴定了分子伴侣中C端ATP结合位点。通过对HSP90抑制剂研究表明化学基因组学在HSP90的生物学功能及其作为抗癌药物作用靶点的确认等方面都有十分重要的意义。

4　结　语

化学基因组学作为后基因组学时代的新技术,为基因组学、蛋白质全功能分析提供一种新的技术支持,有助于完成人类基因组学的功能图谱;更为突出的是化学基因组学作为一种新的药物研发模式,在小分子药物研究中有独特的优势,促进了小分子药物的开发进程。结合中药现代化研究,化学基因组学可应用于天然药物中大量未知小分子药物的开发,有利于阐明天然药物治疗疾病的作用机理,在天然药物开发研究中有着广阔的应用前景。

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R ecent Advances on Chemical G enomics

YE Neng2Sheng,LI ANG Qiong2Lin,LUO G uo2Αn3,FE NG Xue,W ANG Y i2Ming

School o f Life Science and Engineering,Tsinghua Univer sity,Beijing100084

【ABSTRACT】　Chemical genomics is a new paradigm in which chemistry is utilized early in the development process along with other tools such as genomics,proteomics,combinatorial chemistry and cell2based screening to accelerate the drug development process.The recent use of chemical genomics to identify bioactive small m olecules that interact with specific proteins has had a tremendous impact on both the functional analysis of genes and drug development.The recent review highlights the applicatioin of chemical genomics in drug discovery and development.

【KE Y WOR DS】　Chemical genomics;Drug discovery;Function analysis;Small m olecular ligand

【Found ation Item】　This porject was supported by the K ey Research Program of Natioinal Natural Science F oundation of China

(N o.202993030)and National973Program F oundaiton of China(N o.2001C B510306)