赖氨酸高产菌株的选育
赖氨酸高产菌株的选育
摘要：赖氨酸作为一种重要的饲料用氨基酸，需求量一直在不断增长。传统的赖氨酸生产菌株都是多年来是经过多轮随机突变和筛选得到，而近年来随着基因重组技术的发展及对生物代谢过程的了解，人们已经能够通过基因重组技术，改变代谢途径，提高赖氨酸产量。目前有不少成功将野生菌株改造为高产菌株的案例，他们都可以作为合理设计代谢途径并结合各种组学进行微生物代谢途径改造的基础。本文主要描述通过代谢途径改造并结合高通量筛选技术，快速得到赖氨酸高产菌株的方法。
关键词：赖氨酸，菌种选育，基因改造，高通量筛选
Breeding of high-yielding lysine producers
Abstract:L-lysine as an important amino acid for livestock has been increasing in demand, all traditional lysine producers have been created over many years by multiple rounds of random mutagenesis and selection. In recent decades, the development of recombinant DNA techniques and increased understanding of the biochemistry of metabolic reactions has enabled the identification of genetic targets for improved lysine production,and the successful optimization of a wild-type strain into a high-producing cell factory may serve as foundation to combine rational design of metabolic blueprints with targeted genetic engineering and integrated omics analysis for engineering microbial metabolism. Here, we describe the development of a genetically defined process of L-lysine hyperproducing by systems metabolic engineering of the wildtype and the method combining with high throughput screening (HTS) permits the efficient and rapid cloning of rarely transcribed differentially expressed genes. The experimental strategy virtually excludes the possibility of isolating false positive clones.
Keywords: Lysine, Strain optimization, Genetic modification, High throughput screening
L-赖氨酸作为人体和动物所必需的氨基酸之一，被广泛用于饲料、添加剂、食品强化剂和医药产品等方面。随着L-赖氨酸的需求量急剧增加，L-赖氨酸的生产开发需要进一步的研究，而选育出优良菌种是其技术的关键。
一个合适的赖氨酸高产菌株应该具备以下几点：能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，生成的目的产物产量高、易于回收；生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；培养条件易于控制；抗噬菌体及杂菌污染的能力强；菌种不易变异退化；对放大设备的适应性强；菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。
在菌种选育中，若采用传统的诱变育种或杂交育种[1,2]，由于基因突变为随机突变，必将消耗大量的人力物力进行筛选；原生质体融合技术可以使一些未发现有转化、转导和结合等现象的原核生物之间，以及微生物不同种、属、科甚至更远缘的微生物细胞进行融合，得到新物种。但是原生质体融合难度较大，并非每次都能够成功[3]。
目前菌种选择的总趋势是由自然选育向代谢控制育种，诱发基因突变向基因重组的定向育种转变。基因工程育种包括所有的利用DNA重组技术将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得某些优良性状或利用后者作为表达场所来生产目的产物。由于大肠杆菌是单细胞，结构简单，生长速度快，培养简单，遗传背景清楚等优点，所以比较容易进行基因工程改造。
1、菌种改造
由于细胞内的代谢不是一个孤立的过程，而是一个相互联系的网络，网络之间会相互制约，因此目前在对菌株进行基因改造时，往往不是仅仅对某个基因进行单独的改造，而是对目的产物形成过程中一系列相关基因进行改造。如基因的过量表达、提高基因表达产物的活性、降低基因拷贝数、降低基因表达产物的活性等等措施。增加细胞膜的通透性、增强目的产物向胞外的运输、降低支路代谢的代谢流、弱化关键酶对终产物反馈抑制的敏感度等都有助于目的产物的积累。因此为了提高赖氨酸产量，增加工程菌菌株的稳定性，一般要做到以下几点中的一点或几点。
1.1过量表达赖氨酸合成相关基因
菌株细胞内过量表达赖氨酸合成相关酶基因，可以增加赖氨酸合成代谢流，直接增加赖氨酸的积累。菌株过量表达的基因：dapA基因（二氢吡啶二羧酸合酶基因）、dapB基因（二氢吡啶二羧酸还原酶基因）、dapE基因（琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰化酶基因）、lysC基因（天冬氨酸激酶基因）、lysE基因（赖氨酸输送蛋白基因）、pyc基因（丙酮酸羧化酶基因）、gap基因（甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因）基因中的一个或多个。通过增加pyc基因和lysE基因的拷贝数和改变dapA基因的启动子来实现基因的超量表达[4-7]。同时资料还显示：对于给定的pyc基因，dapA、dapB及lysC基因同时也过量表达对赖氨酸生产格外有利[4]。
1.2降低支路代谢流
过量表达赖氨酸合成途径中的关键基因会增加赖氨酸的表达量。同时资料还显示：降低
支路代谢相关酶的表达量或活性或敲除支路代谢相关基因构建营养缺陷性同样会增加赖氨酸的表达量[7,8]。降低糖异生代谢途径流量，利用一个弱的启动子或编码相应的具有低活性的酶的基因或等位基因来实现pck基因（磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶）、pgi基因（葡萄糖-6-磷酸异构酶）的弱化[7]。降低由天冬氨酸半醛生成高丝氨酸的量，继而蛋氨酸、苏氨酸的合成量也会降低，生成的Thr的量不足以与Lys共同对天冬氨酸激酶(AK)起协同反馈抑制作用[8]（在分支代谢途径中，几种末端产物同时都过量，才对途径中的第一个酶具有抑制作用，若某一末端产物单独过量则对途径中的第一个酶无抑制作用。Ｌ-赖氨酸和Ｌ-苏氨酸对天冬氨酸激酶有协同反馈抑制作用）都有助于赖氨酸的积累。
图1.大肠杆菌赖氨酸合成途径
1.3解除抑制作用
为了解除赖氨酸和/或苏氨酸对dapA基因和lysC基因的反馈抑制作用，在将dapA基因和lysC基因导入菌株之前，常常将二者进行人工的修改，改变基因的编码序列，使两者编码的蛋白对赖氨酸的反馈抑制作用脱敏[6,9-11]。
在生产中用到的基因突变体及其编码的蛋白质突变位点如下：棒状杆菌lysC基因编码反馈抗性形式的天冬氨酸激酶[10]，蛋白突变位点为A279T，A279V，S301F，T308I，S301Y，G345D，R320G，T311I，S381F中的一个或多个。大肠杆菌lysC基因Ⅲ(天冬氨酸激酶基因Ⅲ)
为对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变体[6]，其突变位点为:D323G，D323G/D408G，C34R/D323G，F325L，I318M，I318M/M349V，L345S，M347V，I352T，I352T/F369S，K164E，I417M/Y419C。来自大肠杆菌的dapA基因(二氢吡啶二羧酸合酶基因)突变体[6,11]，使二氢吡啶二羧酸合酶对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏：V81A，Y118H，V81A/Y118H。
1.4改善细胞膜的通透性
改善细胞膜的透过机能，如在细胞内过量表达lysE基因(赖氨酸输送蛋白基因)有助于微生物胞内合成的赖氨酸向胞外运输，降低胞内赖氨酸含量[6]，进一步减弱Ｌ-赖氨酸和Ｌ-苏氨酸对赖氨酸合成的协同反馈抑制作用，增加赖氨酸的产量，同时有利于产品的后续加工。
1.5整合基因
通过附加型质粒扩增特定微生物中某些生物合成基因，其缺点为发酵期间所述质粒可能会丧失，同时需要添加外源的抗生素来维持选择压力。若将赖氨酸合成相关基因整合到大肠杆菌基因组中，使大肠杆菌中除天然位点含有编码L-赖氨酸合成相关蛋白的基因至少一个拷贝外，还在其他任选位点含有整合进染色体的这种开放阅读框、基因或等位基因的第二个、第三个或第四个拷贝。这样外源基因就不会在大肠杆菌的复制过程中丢失，同时也不需要添加外源的抗生素来维持选择压力[12]。
由上述多个菌种的改造和筛选过程可以看出，随着时间的推移，在对微生物进行基因改造时，越来越多的是从微生物的整体代谢来考虑，而不是仅仅去增强或减弱某一个基因，这主要是因为细胞的生化反应是一个网络整体，不是独立的，不应孤立地来考虑。目前主要是利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰和改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，用以实现构建新的代谢途径，生产特定目的产物。
2、菌种筛选
在上述的不管是对菌株进行基因工程的改造，还是通过紫外线、化学诱变剂进行诱变育种，还是对新菌株进行培养基优化都无法绕开大量繁琐的筛选工作，他们都需要进行大量的摇瓶实验。但是摇瓶实验筛选工作量大，周期长和成本高，难以达到工业化生产的要求，因此应寻找一种能够开展多参数的、与发酵工艺过程相结合的高通量菌种筛选技术和方法。
目前高通量筛选能够实现多参数在线检测功能，可同时测量pH值、DO、Pco2、OD等重要参数；在一台微反应器上集成的微发酵罐数可达6、1224、4896个不等，能够实现高通量分析功能；同时整个筛选的体积小，其体积一般小于100 mL，有的甚至小至5 μL。此外，还有造价低、减少昂贵原材料消耗、降低劳动强度等优势[13]。
目前高通量筛选技术依然在改进，同时也越来越多的应用于高产菌株的筛选过程中，多
篇报道也验证了高通量筛选在高产菌株筛选中的可行性[14-17]，建立了各种高产菌株高通量筛选方法，取得了一定的成果，为高产菌株的筛选节省了大量的人力物力财力，一步一步向工业化生产的要求靠近。
3、结语
虽然采用合适的筛选方法，诱变育种可以获得高产菌株，但是微生物的自发突变和诱发突变都是随机的，因此不能达到定向育种的目的。随着现代生物技术尤其是的DNA重组技术的发展，使人们能够在分子水平上，根据需要，用人工方法取得供体DNA上的基因，在体外重组于载体DNA上，再转移入受体细胞，使其复制、转录和翻译，表达出供体基因原有的遗传性状，达到定向改良菌种的目的。目前日本味之素、德国德古萨等公司已经将分子育种运用到生产中，并表现出明显的优势。定向的菌种改良结合高通量的菌种筛选方法，极大的改变了传统的菌种选育方式，节约了人力物力，缩短了筛选周期，使菌种选育变得更加高效便捷。
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高产蛋白酶菌株的选育.总结
课堂报告名称：高产蛋白酶菌株的选育方法 武汉轻工大学食品学院王宏勋 一、课堂报告依据的知识背景 1、遗传变异的物质基础 遗传变异有无物质基础以及何种物质可承担遗传变异功能的问题，是生物学中的一个重大理论问题。利用微生物这一实验对象进行了三个著名的实验，才以确凿的事实证实了核酸尤其是 DNA 才是遗传变异的真正物质基础。三个经典实验是: 一是1928年进行的转化实验。二是美国人1952年开展的噬菌体感染实验。三是1956年创立的植物病毒的重建实验。 朊病毒的发现和思考。无论是 DNA 还是 RNA 作为遗传物质的基础已是无可辨驳的事实。但朊病毒的发现对“蛋白质不是遗传物质的定论也带来一些疑云。 PrP 是具有传染性的蛋白质致病因子，迄今未发现蛋白内有核酸，但已知的传染性疾病的传播必须有核酸组成的遗传物质，才能感染宿主并在宿主体内自然繁殖。那么这是生命界的又一特例呢？还是因为目前人们的认识和技术所限而尚未揭示的生命之谜呢？还有待于生命科学家去认识和探索。 2、遗传物质在细胞内的存在形式 除部分病毒的遗传物质是 RNA 外，其余病毒及全部具有典型细胞结构的生物体的遗传物质都是 DNA 。按其在细胞中存在形式可分成染色体 DNA 和染色体外 DNA 。原核细胞和真核细胞中的 DNA 存在形式不完全相同。
1）DNA 在原核细胞中的存在方式 原核细胞最大的细胞学特点就是无核膜与核仁的分化，只有一个核区称拟核。其染色体 DNA 处于拟核区，无组蛋白，近年来发现与非组蛋白结合。结构上为双链环状 DNA 。几种微生物染色体的物理特性见表。原核细胞的染色体外DNA 主要指质粒（如 F 因子、 R 因子、 Col 因子）。 2）DNA 在真核细胞中的存在方式 真核细胞 DNA分为核 DNA和核外 DNA。核 DNA即染色体 DNA ，它与组蛋白结合构成具有复杂结构的染色体。核外DNA是指线粒体和叶绿体等DNA ，其结构与原核细胞的 DNA相似，亦能编码结构蛋白。 3、基因和性状 1）基因的概念 基因是由丹麦生物学家 W ． Johansen 于 1909 年提出来的，他用“基因”这个述语来代替孟德尔的“遗传因子”。直到本纪世 50 年代以后，“基因”才有一个较明确的概念。概括地说：“基因”是一个具有遗传因子效应的 DNA 片段，它是遗传物质的最小功能单位。2）性状的决定——基因表达 性状是构成一个生物个体的有关结构、形态、物质和功能等各方面特征的总称。基因表达是遗传信息表现为生物性状的过程，这一过程是通过基因产物的生物学功能来完成的。基因决定性状，而性状则是基因表达的最终结果。基因依其功能的差别可分成调节基因、操纵基因和结构基因 3 大类。
赖氨酸高产菌株的选育
赖氨酸高产菌株的选育 摘要：赖氨酸作为一种重要的饲料用氨基酸，需求量一直在不断增长。传统的赖氨酸生产菌株都是多年来是经过多轮随机突变和筛选得到，而近年来随着基因重组技术的发展及对生物代谢过程的了解，人们已经能够通过基因重组技术，改变代谢途径，提高赖氨酸产量。目前有不少成功将野生菌株改造为高产菌株的案例，他们都可以作为合理设计代谢途径并结合各种组学进行微生物代谢途径改造的基础。本文主要描述通过代谢途径改造并结合高通量筛选技术，快速得到赖氨酸高产菌株的方法。 关键词：赖氨酸，菌种选育，基因改造，高通量筛选 Breeding of high-yielding lysine producers Abstract:L-lysine as an important amino acid for livestock has been increasing in demand, all traditional lysine producers have been created over many years by multiple rounds of random mutagenesis and selection. In recent decades, the development of recombinant DNA techniques and increased understanding of the biochemistry of metabolic reactions has enabled the identification of genetic targets for improved lysine production,and the successful optimization of a wild-type strain into a high-producing cell factory may serve as foundation to combine rational design of metabolic blueprints with targeted genetic engineering and integrated omics analysis for engineering microbial metabolism. Here, we describe the development of a genetically defined process of L-lysine hyperproducing by systems metabolic engineering of the wildtype and the method combining with high throughput screening (HTS) permits the efficient and rapid cloning of rarely transcribed differentially expressed genes. The experimental strategy virtually excludes the possibility of isolating false positive clones. Keywords: Lysine, Strain optimization, Genetic modification, High throughput screening L-赖氨酸作为人体和动物所必需的氨基酸之一，被广泛用于饲料、添加剂、食品强化剂和医药产品等方面。随着L-赖氨酸的需求量急剧增加，L-赖氨酸的生产开发需要进一步的研究，而选育出优良菌种是其技术的关键。
产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离
实验一产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离 一、教学目标及基本要求 1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术 2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法 3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术 4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法 二、实验原理 枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。 1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。 由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。 2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。 利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。 3. 枯草芽胞杆菌的形态特征 枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。 4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性 枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。葡萄糖发酵产酸不产气，需氧，适温25～31℃生长。 三、实验材料 1. 样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样， 并记录取样的地理位置、pH、植被情况等。（学生自取） 2. 培养基 ①肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1）：100 mL/组，其中20 mL液体培养基/250 mL△中（内装玻璃
高产胞外蛋白酶正文
高产胞外蛋白酶菌株的选育生命科学学院生物科学0901班王亚云 2009044020119 摘要：采用养牛场中的土壤，设置培养基来筛选出具有产胞外蛋白酶的菌株。以酪素培养基平板产生的透明圈的大小作为选择标记，经初筛选择出透明圈的直径/菌落直径大的菌株为出发菌株。经紫外线诱变处理，培养获得两种未知高产胞外蛋白酶菌株。通过形态观察、生理生化试验进行鉴定：突变菌株w1的形态、生理生化特性符合芽孢杆菌属的特征，而突变菌株w2为革兰氏阴性杆菌。 关键字：细菌；胞外蛋白酶；筛选；诱变；鉴定 蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，是酶学研究中较早也是最深入的一种酶。作为一种生物催化剂，该酶催化反应速度较快，无工业污染，且反应条件适宜性宽，被广泛应用于食品、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业。目前微生物菌种选育所采用的诱变手段主要有激光诱变、DES诱变结合热处理、空间诱变、紫外线照射和亚硝基胍复合诱变等。常见的能产生蛋白酶的蛋白微生物有细菌中的酸性蛋白酶生产菌如黑曲霉、根霉；碱性蛋白酶生产菌如地衣芽孢杆菌；中性蛋白酶生产菌如枯草芽孢杆菌。本实验是研究从养牛场土壤中筛选得到的蛋白酶产生菌株为出发菌株，采用紫外线照射育种，以得到高产胞外蛋白酶菌株。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 土样：河北农业大学西校区养牛场中的土壤 1.1.2 培养基： 1.1. 2.1 筛选培养基： 酪素培养基 1.1. 2.2营养培养基： 肉汤培养基 1.1. 2.3鉴别性培养基 （1）淀粉培养基 （2）明胶培养基
（3）葡萄糖发酵培养基 （4）葡萄糖蛋白胨培养基 乳糖发酵培养基、柠檬酸盐培养基、半固体培养基、三糖铁培养基均为商品试剂，直接按比例加蒸馏水即可。 1.2 方法 1.2.1 菌种的筛选 1.2.1.1 培养基的配置及灭菌 按上述配置方法分别配置肉汤培养基和酵素培养基，配置完成后放入高压灭菌锅于120℃下灭菌20min。取6只试管，分别加入9mL蒸馏水，向试管中加入10个玻璃珠，盖好胶塞，进行灭菌。 1.2.1.2 涂布分离 称取9g土样，放入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分震荡5~8min，静置10min。 取1mL上清液进行逐步稀释，分别稀释到浓度为10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7。在酒精灯附近进行无菌操作，分别取10-5,10-6,10-7三个浓度梯度的稀释液各100μL于无菌的酪素培养基平板上，用涂布器进行涂布，每个浓度梯度下设置两个平板。待培养基凝固后贴好标签，在30℃的培养箱中倒置培养6d。 1.2.1.3 菌种的纯化 观察平板上菌落的形态特征，挑选出具有透明圈的菌落，用直尺测量其菌落直径C和透明圈直径H，从中选出两个H/C较大的菌落进行接种。采用分区划线法在酪素平板上进行分离纯化，每次都从上一次划线的末端开始划起，保证菌落被逐步稀释，最后得到单个菌株。 将纯化的菌株接种盛有肉汤培养基中的锥形瓶中，在37℃条件下振荡培养。 1.2.2 紫外线诱变育种 1.2.2.1 悬浮液的制备 在摇瓶培养营养肉汤中取出1mL放入离心管12000r离心2min,去上清，加入无菌水1mL，再离心，在重复3-4次至可得到以后步骤可用的足够的菌，在加入无菌水1mL,将12个Ep 管中的悬浮液加入平皿中混匀。 1.2.2.2 紫外诱变
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柠檬酸高产菌株的选育 222011********* 刘亚超 2011级生物技术 关键词：黑曲霉、T21紫外诱变、发酵 摘要：黑曲霉作为柠檬酸的产生菌，来进行相关的实验内容。为了进一步提高柠檬酸生严菌种对糖的转化效率和产酸速率，有很多方法，比如改善黑曲霉生长的温度、pH、溶氧量、限制金属离子等培养条件，同时也可以对黑曲霉进行诱变处理。目前国内柠檬酸菌种选育，物理诱变常选用紫外、60Co-γ射线等，化学诱变多选用DES及亚硝基胍等[3]。本次实验设计除了优化黑曲霉产柠檬酸的培养条件之外，还要将黑曲霉菌种进行紫外诱变处理。 引言：柠檬酸的用途很多，比如用于香料或作为饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，也是化学中间体。柠檬酸与钙离子结合则成可溶性络合物，能缓解钙离子促使血液凝固的作用，可预防和治疗高血压和心肌梗死。所以可以起抗凝血作用。柠檬酸也有保健的作用，比如柠檬酸能够帮助机体彻底排出血液中毒素。所以筛选出优质的高产柠檬酸菌株，有很重要的意义。 1.材料与方法 1.1 材料 1.1.1菌种 以实验室平板上已有的黑曲霉(Aspergiltus niger)为出发菌株（经多次平板划线分离纯化所得），制备种子液，将发酵好的种子液按液体发酵培养基体积的10％接入已灭菌的发酵培养基中，于30℃左右在200~250rpm培养4~5d。 1.1.2培养基 分离菌种培养基为PDA培养基，初筛培养基为2％淀粉查氏培养基，发酵培养基为废弃苹果榨汁培养基。 1.1.3 试剂及仪器 3-5二硝基水杨酸、结晶酚、酒石酸钾钠、722型紫外分光光度计，组织捣粹机等。 1.2 方法 1.2.1 菌株的分离纯化 用黑曲霉出发菌株，通过平板划线分离的方法进行分离纯化，培养三批，得到纯化的黑曲霉单菌落。 1.2.2 初筛 用接种环刮取纯化的黑曲霉孢子于装有100 mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡，4层纱布过滤并稀释计数成不同的梯度，制成孢子悬液。取各个不
碱性蛋白酶菌株的分离鉴定
产碱性蛋白酶菌株的分离鉴定 摘要：碱性蛋白酶是一类重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、洗涤剂、皮革、酿酒等行业。本文综述了产碱性蛋白酶菌株的研究现状，包括生产菌株的来源、菌株的分离方法以及菌株的鉴定方法，并对其前景进行展望。 关键词：碱性蛋白酶、菌株、分离、鉴定 Isolation and Identification of Alkaline Protease-producing Strains Wensi Hou (Yanshan university , Liren college , Hebei 066004) Abstract：Alkaline protease is a group of important industrial enzyme and has been widely applied in food industry, medical treatment, detergent industry, leather producing, brewing and other fields. This paper reviews the research status of alkaline protease producing strains, including the methods of isolated strains, strain sources and methods of identified strains. This paper also discusses its prospect. Key words:Alkaline protease ; strains ; isolation ; identification 1．碱性蛋白酶 1.1简介 碱性蛋白酶(alkaline protease) 是一类适宜于在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类, 是一类非常重要的工业用酶,广泛存在于动、植物及微生物生物体中, 在猪的胰脏中最早被发现。碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。微生物蛋白酶均为胞外酶，它的处理技术相对简单、价格低、来源广、菌体易培养、产量高、高产菌株选育简单快速、具有动植物蛋白酶的所有特性，以与工业化生产。近几年，碱性蛋白酶的研究有很大的进展，取得了许多可喜的成果，及时的转化成生产力，有很大的社会和生产效益。 1.2碱性蛋白酶的理化性质 微生物的碱性蛋白酶的活性作用范围在PH值7-11之间，在酪氨酸中最适范围为9-11之间，它可以水解肽键、酰胺键、醚键以及转酯、转肽等。多数微生物产生的碱性蛋白酶耐热性差，我国生产的几种碱性蛋白酶耐热温度均在60℃以下。 碱性蛋白酶的分子量一般在2.0-3.4万之间，等电点多为8.0-9.0，能作用于多数肽链，水解肽键生成二肽类物质。其除酶本身的氨基酸残基外,不具有特定的活性基团,因此,一些金属离子(Fe2+,Mn2+,Mg2+,Zn2+等)
高产蛋白酶的芽孢杆菌菌株选育
高产蛋白酶的芽孢杆菌菌株选育 学校河北农业大学 专业生命科学学院 姓名xxx 学号x 指导老师x 同组人员x 二〇一三年十二月二十五日 （河北农业大学生命科学学院，河北保定，071000） 摘要：目的：通过筛选诱变选育高产蛋白酶，为食品、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业提供材料基础。方法: 通过在富含蛋白质的场所的针对性采集土样，菌落平板筛选结合紫外线诱变育种，选育高产蛋白酶的芽孢杆菌，通过一系列鉴别性培养基鉴
定其生理生化特性，查找其种属。结果：通过筛选得到一诱变菌种，通过伯杰氏手册鉴定其为枯草芽孢杆菌属。诱变90s后，其蛋白酶活性提高最大。 关键词：高产蛋白酶芽孢杆菌诱变鉴定 引言：蛋白酶（Protease）是催化蛋白质水解的一类酶，微生物蛋白酶主要由霉菌、细菌生产。蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。该酶催化反应速度较快，无工业污染，且反应条件适应性宽，被广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。目前微生物菌种选育所采用的诱变手段主要有激光诱变、DES诱变结合热处理、空间诱变、紫外线照射和亚硝基胍复合诱变等。蛋白酶分布广，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富。由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备。常见的能产生蛋白酶的蛋白微生物有细菌中的酸性蛋白酶生产菌（如黑曲霉、根霉）；碱性蛋白酶生产菌（如地衣芽孢杆菌）；中性蛋白酶生产菌（如枯草芽孢杆菌）。本实验以树林土壤中筛选得到的蛋白酶生产菌株为出发菌株，采用紫外线照射诱变方法育种，筛选得到高产蛋白酶菌株。 High protease of Bacillus Strain Breeding Abstract:Objective: by screening the mutation breeding of high yield protease, food, pharmaceutical, cosmetics, detergent, spinning, fur softening provides basic material industry. Methods: the protein rich places for collecting soil samples, colony plate screening combined with ultraviolet mutagenesis breeding, breeding of high yield protease of Bacillus, cultivate their physiological and biochemical characteristics based identification through a series of differential, find the species. Results: by screening a mutagenic strain, through Berger's manual was identified as Bacillus subtilis. Mutation in 90s, the protease activity increased. Keywords: high yield protease from Bacillus mutagenesis and identification 目录
饲用酸性蛋白酶高产菌株选育及应用研究
酸性蛋白酶高产菌株选育及应用研究 一、概述 本项目2004年获得河南省科技攻关项目的立项支持，项目编号：0424240040。 酶是生物细胞原生质合成且具有高度催化活性的蛋白质。人类早在认识酶之前就知道利用酶为生产和生活服务，例如酿造、鞣革及制造奶酪等已经有几千年的历史。1897年Büchner发现磨碎的酵母仍然能够使糖液发酵产生酒精和二氧化碳。二十世纪初，有更多的酶被发现和分离提纯，注意到了某些酶的作用需要有低分子物质（辅酶）的参加，并陆续认识了很多酶所催化的反应。1926年Sumner第一次从刀豆中分离出脲酶并获得了该蛋白质的结晶。30年代，J.Northrop 又连续分离出结晶的胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶。今天已有500种酶得到结晶，2000多种酶得到鉴定，200种左右商品酶已经开发，但工业上应用的酶仅有50多种。二次世界大战后抗生素工业的通风搅拌发酵技术的利用，使微生物酶制剂工业得到迅速发展。20世纪40年代末，生产α-淀粉酶的液体深层发酵首先在日本实现了工业化生产，标志着现代酶制剂工业的开始。20世纪50年代后期遗传工程、蛋白质工程等现代生物技术的研究成果，促使世界酶制剂工业持续地高速发展，成为生物工程四大主导产业中最早产业化的高技术产业。由于酶制剂是一种绿色高效生物催化剂，具有高效、节能、安全和环保等特点，对酶制剂应用产业开发新产品、提高质量、节能
降耗、保护环境重要意义；因此，这一产业的发展受到各国政府的高度重视，有着广阔的发展前景。 国际酶制剂市场目前保持着9％的增长速度，2010年世界酶制剂年销售额达160亿美元，目前已有一大批可用于工业发酵生产的各种胞外酶的微生物，如芽孢杆菌、大肠杆菌、放线菌、毛霉、黑曲霉、青霉、酵母等。商品化的酶品种数量主要有糖化酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、凝乳酶、脂肪酶、DNA聚合酶、T4DNA连接酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶、a-乙酰乳酸脱羧酶、乳酸脱氢酶、天冬氨酸转氨酶、延胡索酸酶、青霉素酰化酶、溶菌酶、链激酶、漆酶、植酸酶、复合酶等等。应用范围覆盖洗涤剂、纺织、酒精、白酒、啤酒、味精、有机酸、淀粉糖、制药、制革、饲料、造纸、果汁、肉、蛋、豆、奶、面制品加工等诸多领域，创造工业附加值数千亿多元。我国自1965年建立起第一个专业酶制剂工厂，由于不断引进技术、资金和设备，酶制剂工业得到迅猛发展，产量由1965年的10吨增长到2010年的219万吨，平均每年以20％以上的速度增长，产值达6亿多元，应用范围愈来愈广泛。我国酶制剂工业与发达国家相比，存在的差距主要有：（1）技术研究与开发滞后，基础理论研究与技术开发研究严重脱节，科研资金力度不够且分散，科研技术转化能力不强。（2）行业规模小而分散，市场调控能力弱，我国现有100多家酶制剂生产企业，企业数量占世界三分之一还多，但销售额仅占世界酶制剂销售额5％，企业规模小、产品的市场覆盖率低，导致企业对市场的调控能力普遍较弱，企业间无序的
组氨酸发酵条件及高产菌株选育研究进展
2010No．9Serial No．222 China Brewing L-组氨酸（L-Histidine ）化学名为L-α-氨基-β-咪唑丙酸，是分子中含有咪唑核的碱性氨基酸[1]。L-组氨酸具有多种生理功能，广泛用于医药、饲料及食品行业。尤其在医药领域的作用日益受到重视，目前，其主要应用于氨基酸输液及综合氨基酸制剂方面，已成为中国医疗最常用的药物之一，用量逐年递增。但目前L-组氨酸生产的先进技术主要掌握在欧、美、日等发达国家手里，主要采用发酵法。日本在20世纪70年代就开展发酵生产组氨酸的研究，而国内在这方面还仅处于实验室研究阶段[2-3]。因此加快研究发酵法生产L-组氨酸具有非常重要的意义。1发酵法生产L-组氨酸 发酵法借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对组氨酸产生菌进行诱变，选育出营养缺陷型及组氨酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏，从而达到过量积累L-组氨酸的目的[4-5]。其具有原料成本低，反应条件温和极易实现大规模生产等优点，是一种非常经济有效的生产方法[6]。1.1L-组氨酸的产生菌 目前发现的组氨酸产生菌有谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、枯草芽孢杆菌和粘质赛氏杆菌。已投入工业化生产的有谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌和粘质塞氏杆菌，其产酸水平分别为15.4g/L 、12.5g/L 和17.0g/L ，糖酸转化率分别为15.4%、12.5%、10.0%[7]。1.2发酵过程中pH 值的控制 大部分组氨酸发酵培养基中的氮源是硫酸铵，当铵离子被利用之后，剩余的硫酸根离子会导致发酵液的pH 值下降，从而对发酵产生影响。可以考虑在发酵培养基中添加碳酸钙，因为碳酸钙可以中和硫酸根离子，通过优化试验确定碳酸钙的最佳添加量。1.3生物素对L-组氨酸发酵的影响 作为L-组氨酸的主要产生菌，谷氨酸棒杆菌是生物素缺陷型菌，生物素是细胞生长的必需因子，同时还是多种羧化酶的辅酶，在CO 2固定反应中起重要作用，可影响糖酵解速度，改变发酵代谢流向。添加适量的生物素可以增加单磷酸己糖支路（HMP ）途径的代谢流量，有利于L-组氨酸的产生[8]。 1.4柠檬酸钠对L-组氨酸发酵的影响 在发酵初期添加柠檬酸钠能够改变L-组氨酸生物合成途径的关键节点6-磷酸葡萄糖、丙酮酸及乙酰辅酶A 的代谢流分布，保持糖酵解途径、三羧酸循环与HMP 之间代谢流量平衡[9-11]。在发酵培养基中添加适量的柠檬酸钠后葡萄糖的酵解途径EMP 被抑制，使碳架流向HMP 途径，有利于组氨酸的生成[12]。 影响组氨酸发酵的因素还有许多，可以通过正交试验或响应面法进行优化试验。2L-组氨酸的测定方法 对L-组氨酸含量测定的研究较少，建立一种简便可行的测定方法，对组氨酸的生产具有指导意义。目前较常用 组氨酸发酵条件及高产菌株选育研究进展 孙希叶，杨平平，李 旋，王燕* （山东轻工业学院食品与生物工程学院，山东济南250353） 摘要：L-组氨酸是含咪唑核的碱性氨基酸，是人体和动物体内的半必需氨基酸。L-组氨酸具有多种生理功能，应用广泛，尤其在医 药领域中的应用日益受到重视，是市场上急需的氨基酸品种之一。文中简要介绍了发酵法生产L-组氨酸及产物检测方法，通过对L-组氨酸生物合成途径的分析指出了大量合成L-组氨酸的关键控制点及选育的基本思路，并重点概括了国内外对L-组氨酸高产菌株选育方案的研究。关键词：L-组氨酸；发酵；代谢途径；选育方法中图分类号：TQ922 文献标识码：A 文章编号：0254-5071（2010）09-0028-03 Study Progress of fermentation conditions of L-histidine and screening of high productive strain SUN Xiye,YANG Pingping,LI Xuan,WANG Yan* (College of Food and Biological Engineering,Shandong Institute of Light Industry,Jinan 250353,China) Abstract:L-histidine is an alkalescency amino acid with an imidazole core.It's a semi-essential amino acid in human and animals.L-histidine has a variety of physiological functions,and has been widely used,especially in the field of medicine.It is one of the urgently needed amino acid on the market.Production of L-histidine by fermentation and concerned detecting methods was briefly introduced.Critical control points of high-level synthesis of L-histidine and the basic idea for screening of strains were summarized after analysis of biosynthetic pathways L-histidine,and approaches to screening of strains were emphasized,as well. Key words:L-histidine;fermentation;metabolic pathway;screening approaches 收稿日期：2009-11-22 作者简介：孙希叶（1986-）女，山东临沂人，在读硕士研究生，研究方向为微生物资源开发；王燕*，教授，通讯作者。 Forum and Summary 28··
一株高产胞外蛋白酶菌株的选育
一株高产胞外蛋白酶菌株的选育 摘要：本实验采用的菌株来源于XXX大学动科院养牛场中的土壤，通过设置不同的培养基来筛选具有产胞外蛋白酶能力的菌株。以酪素培养基平板产生的透明圈的直径/菌落直径的大小作为选择标记，经初筛选择出比值大的菌株为出发菌株。经紫外线诱变处理，培养获得两种未知高产胞外蛋白酶菌株。对其进行形态观察和生理生化鉴定，结果表明突变菌株w1的形态、生理生化特性符合芽孢杆菌属的特征，而突变菌株w2为革兰氏阴性杆菌。 关键字：细菌；胞外蛋白酶；筛选；鉴定 蛋白酶（Protease）是催化蛋白质水解的一类酶，微生物蛋白酶主要由霉菌、细菌生产。蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。该酶催化反应速度较快，无工业污染，且反应条件适应性宽，被广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。目前微生物菌种选育所采用的诱变手段主要有激光诱变、DES诱变结合热处理、空间诱变、紫外线照射和亚硝基胍复合诱变等。蛋白酶分布广，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富。由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备。常见的能产生蛋白酶的蛋白微生物有细菌中的酸性蛋白酶生产菌（如黑曲霉、根霉）；碱性蛋白酶生产菌（如地衣芽孢杆菌）；中性蛋白酶生产菌（如枯草芽孢杆菌）。本实验以养牛场土壤中筛选得到的蛋白酶生产菌株为出发菌株，采用紫外线照射诱变方法育种，以筛选得到高产胞外蛋白酶菌株。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 土样：河北农业大学西校区养牛场中的土壤 1.1.2 培养基：（表中数据均为1000mL培养基中所含物质量） 筛选培养基： 肉汤培养基 淀粉培养基
十一产蛋白酶菌株的选育
实验十一产蛋白酶菌株的选育 碱性蛋白酶是一类最适宜作用PH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。 从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。 一基本原理 ?自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解 圈。 ?水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。 不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。 ?碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。 ?原理：Folin试剂与酚类化合物（Tyr,Trp,Phe）在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物， 用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶活大小。 二实验目的 1学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法 2学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术 3掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法 三实验器材 1 菌株 从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株 2 溶液和试剂 蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，Na2CO3,Folin试剂，硼砂，酪氨酸，水等 3 仪器和用品 三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸 四操作步骤 1 培养基和试剂的配制 （1）牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶 （2）发酵培养基：玉米粉4%，黄豆饼粉3%，Na2HPO4 0.4%,KH2PO4 0.03%,3 mol/l NaOH 调节pH到9.0,0.1MPa 灭菌20min,250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。 （3）PH11硼砂- NaOH缓冲液：硼砂19.08克溶于1000ml水中；NaOH4g，溶于1000ml水中，
产蛋白酶菌株的分离
产蛋白酶菌株的分离 一、教学目标及基本要求 1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术 2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法 3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术 4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法 二、实验原理 枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。 1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。 由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。 2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。 利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。 3. 枯草芽胞杆菌的形态特征
枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。 4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性 枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。葡萄糖发酵产酸不产气，需氧，适温25～31℃生长。 三、实验材料 1. 样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样， 并记录取样的地理位置、pH、植被情况等。（学生自取） 2. 培养基 ①肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1）：100 mL/组，其中20 mL液体培养基/250 mL△中（内装玻璃珠10颗）；50 mL固体斜面培养基分装在试管中：5mL/支，10支。 组成：牛肉膏0.5% 蛋白胨1% NaCl 0.5% pH 7.2～ 7.4 121℃，灭菌20min ②酪素培养基（附录Ⅱ-1.10）：200 mL/500 mL△×1（10-12个平板，每组6个平板） 组分配方要求(%) 母液浓度(%) 各成分的取量（mL）
α-淀粉酶和蛋白酶高产菌株的诱变选育
烟草科技／ＴｏｂａｃｃｏＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ烟草农学／ＴｏｂａｃｃｏＡｇｒｏｎｏｍｙ２００８年第８期（总第２５３期） Ｏｒ，一淀粉酶和蛋白酶高产菌株的诱变选育 赵铭钦１，李晓强１，王豹祥２，邱立友１，李芳芳１，郑艳燕１ １．河南农业大学，郑州市文化路９５号４５０００２ ２．武汉烟草（集团）有限公司技术中心，武汉市汉阳区十升路２２号４３００５１ 关键词：烟叶；巨大芽孢杆菌；Ｏｔ一淀粉酶；蛋白酶；诱变 摘要：以从烟叶表面筛选得到的巨大芽孢杆菌Ｂ。。（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｈｅｒｉｕｍ）为出发菌株，经理化诱变处理， 采用透明圈法进行初筛，即在淀粉培养基和蛋白培养基平板上挑取Ｈｃ值（透明圈直径与菌株直径之 比）较大的菌株，然后对这些菌株进行摇瓶复筛，测定发酵液ａ一淀粉酶和蛋白酶的活性，得到酶活性较 高的茵株Ｂ。。其产生的Ｏｆ．一淀粉酶活性是Ｂ。。的１．９６４倍，蛋白酶活性是Ｂ。。的２．２６６倍。该菌株能稳 定遗传，经五代传代培养后，其产生的ａ一淀粉酶和蛋白酶活性分别稳定在２．８２１—３．２７３Ｕ／ｍＬ和 ２１．２１—２７．３６Ｕ／ｍＬ范围内。 中图分类号：Ｔｓ４１４文献标识码：Ｂ文章编号：１００２—０８６１（２００８）０８—００５３—０５ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｔｘ－ＡｍｙｌａｓｅａｎｄＰｒｏｔｅａｓｅＨｉｇｈ?ｙｉｅｌｄＳｔｒａｉｎｓｂｙＩｎｄｕｃｅｄＭｕｔａｔｉｏｎ ＺＨＡＯＭＩＮＧ—ＱＩＮ（１），ＬＩＸＩＡＯ－ＱＩＡＮＧ（１），ＷＡＮＧＢＡＯ－ＸＩＡＮＧ（２），ＱＩＵＬＩ－ＹＯＵ（１），ＬＩＦＡＮＧ—ＦＡＮＧ （１），ａｎｄＺＨＥＮＧＹＡＮ?ＹＡＮ（１） １．ＡｇｒｏｎｏｍｙＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｅｎａｎＡ。ｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００２，Ｃｈｉｎａ ２．ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒｏｆＷｕｈａｎＴｏｂａｃｃｏ（Ｇｒｏｕｐ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｗｕｈａｎ４３００５１，Ｃｈｉｎａ Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｔｏｂａｃｃｏｌｅａｆ；Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｈｅｒｉｕｍ；ａ—Ａｍｙｌａｓｅ；Ｐｒｏｔｅａｓｅ；Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｓｐｏｒｅｓｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｈｅｒｉｕｍ（ＢｃＫ）ｆｒｏｍｔｏｂａｃｃｏｌｅａｆｓｕｒｆａｃｅｗｅｒｅｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄｐｈｙｓｉｃａｌｌｙ ａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ．Ｆｒｏｍｔｈｅｐｌａｔｅｓｗｉｔｈｓｏｌｕｂｌｅｓｔａｒｃｈａｎｄｃａｓｅｉｎｍｅｄｉｕｍｓ．ｔｈｅｓｔｒａｉｎｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒ吼ｖａｌｕｅ （ｔｈｅｄｉａｍｅｔｅｒｒａｔｉｏｏｆｃｌｅａｒｉｎｇｒｉｎｇａｎｄｃｏｌｏｎｙ）ｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅｓｅｌｅｃｔｅｄｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｒｅｐｅａｔｅｄｌｙｓｃｒｅｅｎｅｄ ｂｙｓｈａｋｉｎｇａｌｏｎｇｗｉｔｈｍｅａｓｕｒｉｎｇｄ—ａｍｙｌａｓｅａｎｄｐｒｏｔｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｉｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅｌｉｑｕｉｄ，ｓｔｒａｉｎＢＢｏｆｈｉｇｈｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ，ｗｈｏｓｅＯｆ，一ａｍｙｌａｓｅａｎｄｐｒｏｔｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｗｅｒｅ１．９６４ａｎｄ２．２６６ｔｉｍｅｓｏｆｔｈａｔｏｆＢｃＫ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｓｔｒａｉｎｈａｓａｇｏｏｄｇｅｎｅｔｉｃｓｔａｂｉｌｉｔｙａｆｔｅｒ５一ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ．ｉｔｓｄ—ａｍｙｌａｓｅａｎｄｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｓｔａｂｉｌｉｚｅｄｗｉｔｈｉｎｔｈｅｒａｎｇｅｓｏｆ２．８２１—３．２７３Ｕ／ｍＬａｎｄ２１．２１—２７．３６Ｕ／ｍＬ．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． 高效降解发酵烟叶中的淀粉和蛋白质等大分子物质，对改善烟叶内在品质，提高烟叶香气质量有重要的 基金项目：国家烟草专卖局资助项目“烟草微生物发酵增香机理与增香技术研究”（合同号１１０２００４０１０１４）。 作者简介：赵铭钦（１９６４?），在读博士研究生，副教授。主要从事烟草发酵与加工工艺方面的研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｍｑｚｈａ０９９９＠ｔｏｍ．ｔｏｍ 收稿日期：２００８—０２—２２ 责任编辑：董志坚Ｅ?ｍａｒｌ：ｙｃｋｊ２２５６＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ 电话：０３７１缶７６７２６５０作用…。有关外加微生物制剂加快烟叶发酵方面前人已进行了大量研究，添加含有巨大芽孢杆菌的微生物制剂后。通过微生物分泌的胞外酶和外源酶作用，可促进烟叶中的淀粉、蛋白质等大分子物质的进一步分解与转化，加速了烟叶的发酵进程，缩短了发酵周期Ｂ引。如果能通过物理或化学等方法对自然菌株进行诱变，使其发生基因突变，提高酶活性，将对生物制剂在烟草发酵上的应用具有重要意义¨１。但有关巨大芽孢杆菌的复合诱变研究目前的报道尚少见。为此，利用紫外线（ｕＶ）和硫酸二乙酯（ＤＥＳ）进行巨大芽孢杆菌的复合诱变，筛选得到一株产ａ一淀粉酶和蛋白酶较高的突变株Ｂ。，以期为生物制剂在烟草发酵上 ５３ 万方数据