产_淀粉酶菌株的分离_鉴定及酶学性质研究

3.3　该菌株在覆土栽培条件下,其转化率远低于苏延友(2002)报道的泰山株系100～120%[14],这一方面是由菌株特性引起的,另一方面是由于栽培管理技术的差异所引起的,可通过完善栽培技术来适当提高转化率。

综合上述试验表明,莱芜灰树花野生株系属高温出菇型菌株,其菌丝体生长的最适温度为28℃,最适pH 值为5.5,最适碳源为甘露糖,最适氮源为(NH 4)2S O 4,K H 2PO 4对菌丝体的生长具有明显的促进作用,培养料最适含水量为65%,子实体的生长发育温度为24～30℃,覆土栽培条件下转化率达66.37%左右,是具有较高利用价值的资源之一。

参考文献:

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技术与方法

TECH NI QUE AND METH ODS

产α-淀粉酶菌株的分离、鉴定及酶学性质研究

柳辉,杨江科,闫云君

(华中科技大学生命科学与技术学院,湖北武汉430074)

摘要:目的:筛选高产α-淀粉酶菌株,为工业生产α-淀粉酶提供储备菌株。方法:利用碘液显色法和摇瓶发酵法,从土壤中筛选产α-淀粉酶菌株;通过菌落形态、菌体特征观察和16S rDNA 序列比对对菌种进行鉴定;发酵粗酶液经硫酸铵沉淀、透析脱盐后,对其酶学性质进行初步研究。结果:从土壤中筛选到一株高产α-淀粉酶菌株,枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis X L -15。该

菌株所产α-淀粉酶的最适反应温度为50℃,最适作用pH 为6.5;Ca 2+和Mn 2+对酶有激活作用,而Cu 2+、Zn 2+

和E DT A 对酶有抑制作用;酶的动力学研究测出米氏常数K m 值为1.726mg Πm L 。结论:该菌株是产α-淀粉酶的较好材料,且具有一定的应用前景。

关键词:α-淀粉酶;Bacillus subtilis ;鉴定;酶学性质

中图分类号:Q556+.2 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2007)02-0034-04

Screening ,Identification and Characterization of An α-amylase -Producing

Bacillus subtilis X L -15

LI U Hui ,Y AN Jiang -ke ,Y AN Y un -jun

(C ollege of Life Science and T echnology ,Huazhong University of Science and T echnology ,Wuhan 430074,China )

Abstract :Objective :Screening of α-amylase -producing strain was undertaken to provide new strains for the produce of α-amylase in indus 2

try.Methods :α-amylase -producing strains were is olated from s oil samples by initial screening with iodine s olution and the flasks fermentation.Then strains were identified based on partial 16S rDNA gene sequence aligned with the G enBank database and its m orphological characteristics.The properties of α-amylase of the strain were examined after amm onium sulfate fraction and dialysis for desalting.R esults :An α-amylase -producing strain was is olated and identified as Bacillus subtilis X L -15.The results showed that the optimum temperature and pH of the enzyme

were 50℃and 6.5respectively ,the enzyme activity was obviously inhibited by Cu 2+,Zn 2+and E DT A.While stimulated by Ca 2+and Mn 2+

,its K m was 1.726mg Πm L.Conclusion :This study provided a g ood experimental material for the further studies on α-amylase.K ey w ords :α-amylase ;Bacillus subtilis ;identify ;enzyme property

收稿日期:2006-11-23;修回日期:2006-12-22

作者简介:柳辉(1981-),男,在读硕士,研究方向:微生物分子生物学,E -mail :liuhui0303@https://www.360docs.net/doc/4511482285.html, ;3通讯作者:闫云君(1969-),男,教授,博士生导师,研究方向:能源生物技术与生态学,发表论文70余篇,E -mail :yanyunjun @https://www.360docs.net/doc/4511482285.html, 。

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的统称,是最早实现工业化生产,迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种[1]。按水

解淀粉方式不同,把淀粉酶分为α-淀粉酶(

α-amylase ,EC3.2.1.1)、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶四类,其中尤以

α-淀粉酶最为常用。α-淀粉酶已广泛地应用于食品、发酵(葡萄糖和酒精生产)、畜牧业生产、谷物加工、纺织、造纸、轻

化工业、医药和临床分析等领域[2-4]

。除动物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外,淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物,其中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )是其主要生产菌种之一,具有很高的研究意义[5,6]。随着社会需求的增大,工业生产对α-淀粉酶的需求量越来越大,其在各领域应用广泛,急需寻找更高酶活的产酶菌株满足生产需要。本研究从淀粉厂附近土壤中筛选到一株高酶活菌株,经鉴定为枯草芽孢杆菌,本文对

该酶学性质作了初步研究,为进一步利用奠定了基础。

1　材料和方法

1.1　材料1.1.1　实验材料

采自武汉市郊区、仙桃和河南等地酿酒厂、醋厂、面粉加工厂和粮食加工厂附近水样、土样20余份。1.1.2　试剂

本试验所用试剂均为进口或国产分析纯。T aq DNA 聚合酶、dNTPs 、A ΠT 克隆试剂盒等分子生物学试剂购自大连宝生物(T AK ARA )生物工程有限公司。大肠杆菌(E .coli )菌株DH5α实验室保存。16S rDNA PCR 扩增引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,DNA 序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成。1.1.3　仪器

PCR 扩增仪、高速离心机为E ppendorf 公司产品,凝胶成像系统为K odak 公司产品。电泳仪、分析天平、灭菌锅、超净工作台、摇床、培养箱、超级恒温水浴锅等均为国产仪器。1.1.4　培养基

①平板筛选培养基:牛肉膏0.5%,蛋白胨1.0%,NaCl

第17卷第2期:342007年4月生　物　技　术BI OTECH NO LOGY

V ol 117,N o 12:34

Apr 12007

0.5%,可溶性淀粉2.0%,琼脂1.5～2.0%,pH自然。121℃灭菌20min。

②摇瓶复筛培养基:玉米粉3%,玉米浆3%,CaCl20.13%, Na2HPO40.3%,(NH4)2S O40.4%,pH6.0。121℃灭菌20min。

③斜面保存培养基:肉汤蛋白胨培养基。

④种子培养基:肉汤蛋白胨培养基。

⑤产酶液体培养基:同摇瓶复筛培养基。

⑥LB培养基:蛋白胨1.0%,NaCl1.0%,酵母粉0.5%,氨苄抗生素60μgΠm L,固体培养基加2%琼脂,121℃灭菌20min。

1.2　实验方法

1.2.1　菌种初筛

称取土壤样品1g溶于9m L无菌水中,或水样品5m L溶于45m L无菌水中,分别用无菌水梯度稀释至1×107倍,取1×105、1×106、1×107稀释液涂布于平板筛选培养基表面。37℃培养72h,用无菌的牙签挑选单菌落影印2～3皿,同时用签字笔对各单菌落标号。影印过的培养皿37℃培养72h,取其中一皿喷洒稀碘液记录有水解圈的单菌落。根据记录从剩余2皿中挑取对应有透明圈的单菌落,转接,经平板划线法得到纯种。接种斜面保存培养基中,培养后于4℃保藏。

1.2.2　菌种复筛

初筛纯菌种接种于30Π250m L种子培养基,37℃、250rΠmin 摇床培养过夜。种子液以2%接种量接种于产酶液体培养基50Π500m L,相同条件培养72h,发酵液8000rΠmin离心10min,取上清液测酶活,每个样品重复3次,最后结果取平均值。

1.2.3　酶活测定方法

测定方法:3,5-二硝基水杨酸比色法[7]。

酶活力定义:在40℃、pH6.0,1min从可溶性淀粉中释放出1μm ol还原糖所需的酶量。

1.2.4　菌落形态观察和分子生物学鉴定

形态观察、菌体特征:参照《伯杰细菌鉴定手册》[8]。

分子生物学鉴定:细菌总DNA的提取参照方法[9]。

菌株16S rDNA PCR扩增采用引物为正向引物序列5’-AAGG AGG TG AT CC AG CCG-3’;反向引物序列:5’-AG AG TTT2 G AT CCTGG CT C AG-3’。PCR扩增体系为:PCR扩增体系50μl,包括无菌双蒸水50μl,10×Bu ffer5.0μl,20mm olΠL,dNTPs1. 0μl,20μm olΠL正向引物和反向引物各2.5μl,模板DNA1.0μl, T aq DNA聚合酶2个单位。每个反应为30个循环,每个循环包括94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸2min,最后72℃延伸10min;首次循环在95℃预变性10min。最后经0.8%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统观察并保存。

特异性片断(约1.5kb)经AΠT克隆至载体pM D18-T,然后转化大肠杆菌DH5α,筛选并获得阳性克隆。外源片段经序列测定、分析,选取该菌株约500bp16S rDNA序列,并与相邻种属的16S rDNA序列进行同源性比较。

1.2.5　酶学性质的初步研究

将斜面保藏菌种接入种子培养基,于37℃、250rΠmin培养16～18h,。按2%接种量接入产酶液体培养基于同样条件下培养48h,发酵液8000rΠmin离心10min,取上清液用60%的硫酸铵沉淀,透析脱盐后进行酶学性质研究,每个样品重复3次,最后结果取平均值。

1.2.6　米氏常数测定

底物为淀粉,浓度取0.08、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 gΠ100m L,用双倒数:1ΠV(速度的倒数)对1Π[S](浓度的倒数)作图法求K

值[10],每个浓度重复3次,最后结果取平均值。

2　结果与分析

2.1　产淀粉酶菌株的筛选

从20余份土样、水样中共筛选到11株产淀粉酶菌株,其中细菌5株、真菌6株。通过摇瓶复筛测酶活,其中编号为X L -15的菌株酶活最高,液体发酵酶活达到30.0UΠm L。2.2　菌种鉴定结果

形态观察:该菌菌落较大,中央有皱褶(图略),圆形、规则、无光泽、灰白色,不透明。显微镜观察菌体特征:杆状,直或接近直,多数运动,有侧生鞭毛,芽孢中生,椭圆形。根据以上特征并参照《伯杰细菌鉴定手册(第八版)》初步鉴定为芽孢杆菌类。

16S rDNA序列是细菌鉴定的重要指标,已成为现代细菌分类的重要手段。本研究通过扩增菌株X L-15的16S rDNA 的序列,扩增结果如图1所示。将该片段的测序结果用NC BI 的Blast软件进行核苷酸同源性比对,得出其分类地位的系统发育树(图2)。由图2可知,菌株X L-15与枯草芽孢杆菌的16S rDNA的序列同源性为100%,由此将X L-15菌株归属为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

。

图1　菌株X L-1516S rDNA的PCR产物

Fig.1　PCR product of16S rDNA from the strain X L-15

D LM-3000DNA M arker;1-3:PCR products of16S rDNA.

图2　分离菌株X L-15与枯草芽孢杆菌代表菌株16S rDNA系统发育树

Fig.2　Phylogeny of X L-15and the representatives of Bacillus subtilis

2.3　酶学性质研究

2.3.1　酶反应最适温度研究

在不同温度下测定酶活力,以最高酶活为100%,结果如图

3所示。由图3可知,该酶反应的最适温度为50℃,在65℃时还有保留40%的残余酶活。

图3　温度对α-淀粉酶活性的影响

Fig.3　E ffect of tem perature on activity ofα-amylase

2.3.2　酶反应温度热稳定性研究

将酶液在35～65℃水浴保温30min,立即置于冰水中冷却,在40℃下测定残余酶活,以最高酶活为100%,结果见图4。由图4可知,在35～55℃范围内,该稳定性较好。

2.3.3　酶反应最适pH研究

用不同pH的柠檬酸缓冲液配制可溶性淀粉溶液,测定酶活力,溶液pH值范围为4.0～8.0。以最高酶活为100%,结果如图5所示。由图5可知,酶反应的最适pH值为6.5。

2007年4月产α-淀粉酶菌株的分离、鉴定及酶学性质研究

图4　α-淀粉酶的热稳定性Fig.4　K inetics of therm ostability of α-

amylase

图5　pH 对α-

淀粉酶活性的影响

Fig.5　

E ffect of pH on activity of α-amylase

2.3.4　酶的pH 值稳定性研究

用不同pH 的柠檬酸缓冲液调节酶液,在室温下放置1h 后测定残余酶活。以最高酶活为100%,结果见图6。由图6可知,该酶在pH 值为5.0～7.0范围内较稳定。

图6　α-淀粉酶的pH 稳定性Fig.6　K inetics of pH of α-amylase

2.3.5　不同金属离子的影响研究

在反应体系中加入不同的阳离子,使其终浓度为2mm ol Π

L ,测定酶活力,以不加阳离子的空白对照(CK )为100%,结果见图7。由图7可知,CaCl

2和MnS O 4对酶有明显的激活作用,而CuS O 4、ZnCl 2和E DT A 对酶有抑制作用。2.3.6　米氏常数K m

配制底物淀粉的不同浓度S ,测定其相对应的酶活性质,以1ΠV 对1Π[S]作图,得到一个斜率为K m ΠV 的直线,结果见图8。由图8可求得K m =1.726mg Πm L ,说明该酶与底物具有较高的亲和力,酶的作用效率高。

3　讨论

传统的细菌鉴定方法是依据微生物的细胞形态、生理生化特征、血清反应、噬菌体敏感性等多方面进行综合鉴定的,

图7　离子对α-淀粉酶活性的影响

Fig.7　E ffect of cation on activity of α-amylase

图8　双倒数作图求酶的K m 值Fig.8　Determination of K m of the amylase by constructing the figure of 1ΠV vs 1Π[S]

使用该方法进行鉴定的依据为细胞的表性特征,缺点是检测

项目多、耗时、结果不稳定等,易出现弱反应或假阳性。细菌的16S rRNA 具有很高的保守性,因而近年来细菌分类学家们广泛采用16S rRNA 序列分析法进行发育分类学研究[11]。通过将某一未知细菌的16S rRNA 编码基因的序列与基因库的16S rDNA 序列进行同源性比较,可以初步确定该细菌的种属地位,有些细菌甚至可以鉴定到种的水平[12]。本研究正是根据这一分子生物学鉴定方法,并结合菌落形态、菌体特征对菌株进行了鉴定。该方法是在分子水平上对细菌进行分类,具有快速、准确、重复性好等诸多优点,可避免传统细菌鉴定方法的一些缺点,从而对菌株进行了鉴定。

α-淀粉酶研究起步较早,迄今已经获得了很高酶活的菌株且研究很深入,但到目前为止全世界有关研究工作者仍没有停止对其研究,并在此基础上进一步研究开发新型α-淀粉酶[13-16]。Marco J.L ,et al.[17]将枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因克隆到大肠杆菌中表达,并对表达蛋白进行分离纯化研究其酶学性质。结果表明分泌表达的α-淀粉酶最适pH 为6.5,最适温度为50℃,Mn 2+和C o 2+对酶活具有激活作用,而Fe 3+、Al 3+和Hg 2+

则抑制酶的活性,米氏常数K m =3.845mg Πm L ;

M ohsen F.N.[18]

也分离到一株Bacillus subtilis AX 20,其α-淀粉酶酶活达到38U Πm L ,对其纯酶酶学性质研究得出,最适pH 为

6.0,最适温度为55℃,Cu 2+、Ag 2+和Hg 2+

抑制酶的活性、K m =3.3mg Πm L 。本研究分离的Bacillus subtilis X L -15菌株,酶活测定为30.0U Πm L ,产酶能力比上述菌株稍低,酶学性质也与上述两种α-淀粉酶相比略有差别,分析原因可能是所用酶液为粗酶液。虽然经硫酸铵初步沉淀,但其中仍含有杂蛋白,对酶活测定有影响,下一步研究工作准备对粗酶液进一步分离、上柱纯化收获纯酶,具体研究其酶学性质、底物特异性、水解产物分析、蛋白质分子量等内容。

本研究从土壤样本中成功地分离到一株高产α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌X L -15。初步的酶学性质测定表明该菌株具有较好的应用前景。本研究为高产α-淀粉酶菌株的遗传改良、基因工程菌的构建等工作奠定了基础。

3 生　物　技　术第17卷第2期

参考文献:

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大肠杆菌JM109感受态形成因素分析

游雷鸣1

,翁海波

,韩绍印1,席宇1,孙春花

(1.郑州大学生物工程系,河南郑州450001;2.河南省花花牛实业总公司,河南郑州450001)

摘要:目的:分析大肠杆菌JM109感受态形成因素,提高转化效率。方法:采用不同生长状态、不同转化溶液、不同保存时间及热激处理时间的细菌制备感受态,分析转化效率。结果:以20mm ol ΠL MgCl 2+80mm ol ΠL CaCl 2为处理液,经活化培养OD 600为0.

82的菌液制备感受态细胞,4℃放置12～24h 之内,42℃热激处理60s ,转化效率最高,可达9.8×106～1.2×107

cfu Πμg DNA

(pUC19)。随着质粒长度增加,转化效率下降。结论:感受态细胞形成与生长状态关系密切,金属离子、有机溶剂对感受态的形成影响显著。感受态形成过程中,细胞可能发生了一系列的生理变化。

关键词:大肠杆菌JM109;感受态细胞;转化效率

中图分类号:Q785 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2007)02-0037-04

A ffecting F actors of Forming Competent Cells of Escherichia coli JM 109

Y OU Lei -ming 1

,WE NG Hai -bo

,H AN Shao -yin 1,XI Y u 1,S UN Chun -hua

(1.Department of Bioengineering ,Zhengzhou University ,Zhengzhou 450001,China ;

2.Parent C om pany of Huahua M ilch C ow Industry ,Zhengzhou 450001,China )

Abstract :Objective :Analyzing the affecting factors of forming competent cells of E scherichia coli JM109to increase trans formation efficiency.Methods :A series of E scherichia coli JM109competent cells were produced in different conditions ,including growth status ,trans formation s olut 2ions ,storing time at 4℃,activating time at 42℃,plasmid length.Different effects on trans formation ability of competent E scherichia coli JM109were evaluated.R esult :The highest trans formation ability was obtained when the activated cells was cultured to an OD 6000.82,then prepared with 20mm ol ΠL MgCl 2and 80mm ol ΠL CaCl 2,kept at 4℃between 12h to 24h ,hot shocked at 42℃for 60s.The trans formation efficiency for opti 2

mized protocol was found to be as high as between 9.8×106to 1.2×107

cfu Πμg DNA (pUC19).The lower efficiency was ,the longer the length

of the plasmid was.Conclusion :The formation of the competent cells was concerned with growth status ,s ome metal ions and organic s olutions.The physiologic change could take place in the process of forming competent cells.K ey w ords :E scherichia coli JM109;competent cell ;trans formation efficiency

收稿日期:2006-11-27;修回日期:2006-12-29

作者简介:游雷鸣(1981-),男,河南信阳新县人,硕士生,从事动物重要疫病快速检测技术研究;3通讯作者:翁海波(1974-),男,博士,硕士生导师,T el :0371-********,E -mail :hbweng @https://www.360docs.net/doc/4511482285.html, 。

自然环境中细菌可以吸收外源遗传物质以增加自身对环境的适应性。人工感受态的形成,需要低温和钙处理,这样可能破坏了细胞膜上的脂质阵列[1],Ca 2+与膜上的多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物利于外源DNA 的渗入[2,3],外部理化因素促进了感受态的形成。同时,刘志洪等

发现[4]

,Ca 2+会进入细菌细胞内,但有一定域值,并且Umem oto

Aiko 等[5]发现大肠杆菌crp -基因影响感受态的转化效率,所

以感受态形成可能有细菌自主生理调控的参与。目前有关形成机理还知道的很少,人工制备感受态的方法很多,不同的制备方法,影响因素存在差别,普通的低温CaCl 2处理[6]制备大肠杆菌感受态细胞是一个相对比较成熟的技术,制备处理过

程中,很多因素都影响到转化效率,有些研究给了具体的分析[7,8],但还有一些影响因素没有给出详细的数据,本研究在此基础上,对可能影响感受态转化效率的因素都给出了详尽、精确的分析数据,为改进转化策略,提高转化效率提供依据。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　实验材料:大肠杆菌(E scherichia coli )JM109、质粒pUC19、pBI121由郑州大学生物工程系分子生物学实验室保存。

1.1.2　试剂:DMS O 、DTT 、甘油、溶菌酶,均为Amresco 产品。CaCl 2、PEG 6000、MgCl 2、SrCl 2、ZnCl 2、K Cl 、MnCl 2、NaCl 、CuS O 4、Mg 2

S O 4、(NH 4)2S O 4、FeS O 4,均为分析纯,均为生工生物工程上海有

限公司产品。氨苄霉素(Amp ):工作浓度100μg Πm L ;卡那霉素:

工作浓度200μg Πm L ,均为S igma 产品。胰蛋白胨和酵母粉均为

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第17卷第2期:372007年4月生　物　技　术BI OTECH NO LOGY

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