基因工程论文-转基因水葫芦的应用

基因工程课程论文

转基因凤眼蓝治理重金属污染及富营养化水域的探索Exploration on Transgenic Water Hyacinth Treatment for

Heavy Metals Polluted and Eutrophicated Water Bodies

生物技术****班************

摘要：凤眼蓝(Eichhornia crassipes)亦称水葫芦，原产于南美洲，作为观赏植物引入中国，后推广为家畜饲料，现广布于我国南方地区，是我国主要的入侵物种之一。在生长适宜的地区，水葫芦生长迅速，经常过度繁殖，阻塞水道，破坏水体生态系统。利用水葫芦进行污染水体的修复不仅可以恢复水质，还能解决水葫芦疯长又无法利用的问题。水葫芦在环境治理方面有很大的前景，尤其是在富营养化水体氮、磷的去除方面。同时，水葫芦还能富集重金属离子，但是富集效率不高。利用根癌农杆菌转化技术将金属硫蛋白MTs(Metallothioneins)和植物络合素PCs(Phytochelatins)的基因转入水葫芦中，成功表达以后可以增强其富集重金属离子的能力和耐受力，加强净化污染水体的能力。

关键词：凤眼蓝金属硫蛋白植物络合素重金属污染富营养化

在过去的几十年间，中国的经济和社会高速发展，工业和人口的增长在提升我国综合实力的同时，也导致了环境污染也在不断加剧。目前中国的环境污染主要体现在空气污染、水体污染和土壤污染三个方面。近年来，社会上对城市空气污染的热议很多，但是对水体污染和土壤污染提及得却较少，尤其是不可见的重金属污染。历史上曾有过因重金属污染导致的严重损害人体健康的事件，如震惊世界的日本“痛痛病”和“水误病”，两次事件都是因工业废水中的重金属离子锡和汞被排放到环境中，经生物富集和转化作用最终被人体吸收，对人体造成极大的伤害。目前，我国面临着严峻的水体和土壤污染问题，主要是生活废水中的氮、磷排放，农业生产中过量的化肥施用，工业废水中的各种重金属离子，有机化合物等污染物。富营养化的水体容易引起藻类疯长，占据水体上层空间，消耗氧气遮挡阳光，引起水下生物的死亡。而重金属离子对动植物都造成不同程度的危害，通过生物富集作用，对处于食物链顶层的人类来说危害很大。

目前，针对富营养化水体修复技术有很多，从技术原理上看，可以分为物理方法、化学方法、生物方法和生态方法等[1]，而重金属污染水体的修复方法更多是采用沉积、氧化、还原、萃取、交换、渗透、吸附等物理和化学的方法[2]。传统的物理和化学修复技术不仅费用高昂，还容易造成二次污染，破坏生态环境。水生植物修复是结合生物方法和生态方法的修复技术，它是一种耗能低、效果好的新技术，在不破坏环境的条件下使土壤的重金属得以清除，是一种绿色环保技术。利用植物治理有以下优点：金属可以在低浓度下被选择性地去除；吸附效率高；对钙、镁离子吸附量较小；pH值和温度条件容易达到；治理费用投入低；可有效地回收一些贵重金属[3]。

在很多地区，水体的污染不仅仅只是富营养化，在工厂集中的地区，水体重金属离子含量也很高。单一的物理、化学或生物水体修复方法并不能彻底解决这

类水体的污染问题，如水葫芦虽然可以用来修复因氮、磷含量过高引起的富营养化水体，但是对重金属污染的修复能力有限，仅有一定的富集和耐受镉的能力，能富集4000-9300mg/kg（干重）的镉[4]。对更高浓度的镉不能耐受，且对其他重金属离子的富集能力较弱。通过基因工程的改造，可以将植物富集耐受重金属相关的基因转入水葫芦中表达，如金属硫蛋(MTs)和植物络合素(PCs)。它们与金属离子螯合成相对稳定的硫肽复合物，经转运蛋白运输到胞外或液泡等细胞器内储存，降低对植物的毒害，增加其吸收、富集重金属的能力。MTs(图2)是一类能结合金属的富含半胱氨酸的蛋白质的总称，通常由60-80个氨基酸组成，其中富含半胱氨酸的结构域可以螯合Cu2+、Cd2+和Zn2+，从而降低Cd2+、Zn2+和Cu2+对细胞的毒性[5]。MTs对Cu2+有较高的亲和力，在拟南芥中MT基因的表达提高了植物对Cu的耐受性[6]。PCs也是富含半胱氨酸的蛋白质，主要结构域为(γ-Glu-Cys)n-Gly(n=2~11)，在植物对镉的耐受机制中起着重要作用。在烟草中转入小麦PC合成酶基因TaPCS1后，对Zn2+、Pb2+、Cd2+和Ni2+的抗性均有所提高，其中对Cd2+和Pb2+的抗性分别提高6倍和3倍[7]。因此，若能将这两个基因转入水葫芦中表达成功，将有可能提高水葫芦修复重金属污染水体的能力。

图1凤眼蓝图2小麦金属硫蛋白空间结构

Fig1Eichhornia crassipes Fig2Wheat metallothioneins structure

利用基因工程技术改造水葫芦技术流程可以分为组织培养体系的构建、遗传转化体系的构建、转基因阳性植株的鉴定与后代稳定性的鉴定等，在组织培养的技术探索上，已有一定的文献报道其不易形成愈伤组织，需要较高浓度的外源细胞分裂素[8]。

1凤眼蓝组织培养体系的构建

1.1外植体的选择和无菌苗的获得

取实验室条件下生长的凤眼莲幼嫩植株，用自来水冲洗干净，取刚长出的顶芽或者幼嫩叶片，用0.05%HgCl2溶液表面灭10min，再用无菌水冲洗3-5次，在1/2M S培养基上培养成无菌苗，作为组织培养的材料。培养光照条件为愈伤组织诱导时全黑暗，分化诱导时12小时光照，光强为2000Lx，温度25-30摄氏度。

1.2诱导培养基及分化培养基的制备

诱导和分化培养基是在1/2MS培养基的基础上加入不同的植物激素配成的，其中诱导愈伤组织的培养基加入5mg/L的BA和2.5mg/L的NAA，以诱导凤眼蓝的愈伤组织的形成。愈伤组织是遗传转化的材料，成功转化后的愈伤组织将进行诱导分化形成新的植株。

表1诱导培养基和分化培养基的成分

Table1The proportion of differentiation culture media and induction culture media

1.3叶片愈伤组织接种诱导分化形成植株

在上面制备的分化培养基中培养愈伤组织，构建好的分化体系是获得转基因的关键，通过T-DNA插入得到转基因愈伤组织分化出的植株有可能是嵌合体，需要进一步的自交繁殖得到纯合的转基因个体。

2MTs和PCs基因的克隆和遗传转化

转基因所用的基因供体可以采用已有文献报道的小麦MTs和拟南芥PCs基因，在获得相关基因文库后，可以把保存在大肠杆菌中的基因克隆并连接到表达载体中，最常用的植物表达载体是pCAMBIAl30l和pI121，转入凤眼蓝的愈伤组织中。由于两个基因的随机转入导致无法获得转基因植株的可能性很大，因此可以分开进行，在获得两个转基因品种的稳定遗传后代后，用两个品种进行杂交。

2.1碱裂解法提取质粒、酶切、电泳、分离目的基因

2.2表达载体的构建

2.3大肠杆菌感受态细胞的制备和转化，保存目的基因

2.4根癌农杆菌转化愈伤组织

2.5愈伤组织诱导分化成植株，提取植株DNA和RNA，经PCR后检测是否转入目的片段及是否表达

2.6将得到的嵌合体植株自交产生的后代进行选择，得到纯合的转基因植株转MT凤眼蓝和转PC凤眼蓝

3重金属离子耐受度和富集效率检测和富营养化水体中的氮、磷吸收效率检测对得到的转基因植株进行实验室条件下的重金属离子耐受和富集效率检测，用含有不同浓度的重金属离子和不同程度的高氮、磷的培养液来培养转基因凤眼蓝，与野生型的植株对比其耐受和富集能力。若能得到富集对重金属离子耐受度和富集效率更高的植株，对重金属污染和富营养化水体污染的治理来说将是一个很大的突破。

参考文献：

[1]Mitsch William J,Lefeuvre Jean-Claude,Bouchard Virginie.Ecological engineering applied to river and wetland restoration[J].Ecological Engineering,2002,18(5):529-541

[2]任旭喜.土坡重金属污染及防治对策研究[J].环境保护科学,1999,25(5):31-33

[3]刘素纯,萦浪涛.植物对重金属的吸收机制与植物修复技术[J].湖南农业大学学报, 2004,30(5):28-33

[4]郭静,阮宜纶,林荣忱.水生植物对地热废水净化作用的研究.环境科学学报,1995, 15:251-255

[5]Murphy A.,and Taiz L.,1995,Comparison of metallothionein gene expression and nonprotein thiols in ten Arabidopsis ecotypes,Plant Physiol.,109(3):945-954

[6]Murphy A.,Zhou J.,Goldsbrough P.B.,and Taiz L.,1997,Purification and immunological identification of metallothioneins1and2from Arabidopsis thaliana,Plant Physiol.,113(4): 1293-1301

[7]Martinez M.,Bernal P.,Almela C.,Velez D.,Garcia-Agustin P.,Serrano R.,and Navarro-Avino J.,2006,An engineered plant that accumulates higher levels of heavy metals than Thlaspi caerulescens,with yields of100times more biomass in mine soils, Chemosphere.,64(3):478-485

[8]李学宝,刘永定.凤眼莲组织培养的研究.华中师范大学学报(自然科学版),1997,31(3): 332-334