细胞生物学实验报告

细胞生物学实验报告

叶绿体的分离、纯化与荧光观察

【实验目的】

⒈通过植物细胞叶绿体的分离与纯化，了解细胞器分离与纯化的原理和方法。

⒉熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光。

【实验原理】

⒈叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行。由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种的细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。

叶绿体结构模式图

组织细胞的破碎方法很多，包括机械法（研磨法、匀浆法、胶体磨法）和非机械法（超声波法、有机溶法、溶胀法、酶解法）。除了某些细胞外的多肽激素和某些蛋白质与酶以外，对于细胞内或多细胞生物组织中的各种生物大分子的分离纯化，都需要事先将细胞和组织破碎，使生物大分子充分释放到溶液中，并不丢失生物活性。不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同。

⒉细胞器分离的过程包括两个主要阶段：碎细胞和细胞组分的分离。将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行离心，差速离心和密度梯度离心是分离亚细胞组分的常用方法。

⑴差速离心

①原理：一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。

②事例：叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L 氯化钠或 0.4mol/L 蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000r/min 的条件下离心 2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在 3000r/min 的条件下离心 5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在 0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。

③特点：介质密度均一，速度由高到低，逐级离心。

④用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。

⑤沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。

差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。

⑵密度梯度离心

①原理：用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中。

②分类

速度沉降——分离密度相近而大小不同的物体。

等密度沉降——分离密度不同的物体。

⒊荧光的概念

①光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态回到基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称为“光致发光”。紫外辐射、可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光。

②荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并且立即退激发在极短的时间内能发射出比照射光波更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。荧光分为自发荧光或诱发荧光（次生荧光、续发荧光、间接荧光）。某些物质受激发光照射后可直接发出荧光，如叶绿素、血红素的火红色荧光或木质素的黄色荧光的等，称为自发荧光（直接荧光）。某些物质本身不发荧光，但它经荧光染料染色后，再通过紫外线照射同样也能发出荧光，这样荧光称为诱发荧光，如叶绿体被咩啶橙染色后可发桔红色荧光。

⒋染色剂

吖啶橙是一种与 DNA 和 RNA 都能结合的荧光染料，在紫外线或蓝光（330~485nm）激发下，DNA可被激发出

530nm 的荧光发射峰（细胞核发亮绿色荧光），RNA 可被激发出 640nm 的荧光发射峰（核仁和胞质 RNA 发桔红色荧光）。产生两种不同荧光是由于吖啶橙与双链 DNA 和单链 DNA 或 RNA 的结合方式和结合量不同而决定的。DNA 是高度聚合物，它与 DNA 结合是潜入双链之间，结合量相对少；而与单链 DNA 或 RNA 的结合则由静电吸引堆积在磷酸根上，结合量相对多些。我们推测，叶绿体的次生荧光的来由，大部分来自叶绿体的吸附作用，极少部分来自于叶绿体中的RNA。

【实验用品】

⒈材料

新鲜菠菜

⒉仪器

普通或高速离心机、电子天平、荧光显微镜、剪刀、研钵、移液管、漏斗、滴管、10ml离心管。

⒊试剂

⑴0.35mol/L 的 NaCl 等渗溶液。

⑵0.01% 吖啶橙（acridine orange）——称取 0.1g 吖啶橙加蒸馏水 100ml 做母液，储存于棕色瓶，置4℃冰箱保存。临用前取 1mL 母液加 1/15mol/L 磷酸缓冲液（pH 4.8）9mL。

【实验步骤】

⒈选取新鲜嫩绿的菠菜叶，去叶梗及其粗脉，洗净擦干，称取 30g 放于 150ml 0.35mol/L的 NaCl 溶液中。

⒉将叶片和溶液同时装入组织捣碎机中，均将 3—5 分钟，然后在 5000r/min 的条件下离心。

⒊将匀浆用纱布（6 层）过滤于 500ml 烧杯中。

⒋取滤液 4ml 在 1000r/min 的条件下离心 2min。

⒌取上清液在 3000r/min 的条件下离心 5 分钟（沉淀即为叶绿体和细胞核的混合物）。

⒍将沉淀用 2ml 0.35mol/L 氯化钠溶液配成悬浮液。

⒎取悬液 1 滴滴片，加上盖玻片后即可观察。

【实验结果】

⒈结果

⑴在普通光学显微镜下，叶绿体为橄榄形，呈现绿色。（图1）

⑵在荧光显微镜下，选用 B(blue)激发滤片，B 双色镜和 O530(orange)阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。（图2）

⑶加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧色。（图3）

⒉图像

图1普通显微镜下观察图2 自发荧光图3次生荧光图4保卫细胞

【分析与讨论】

⒈结果分析

⑴在光学显微镜下观察叶绿体时，不但能观察到正常的绿色橄榄型，还能看到一些形状较小，且不规则的碎片。造成这种现象的原因是因为在离心过程中，离心不纯造成了叶绿体沉降物中混有了其他组织的碎片。

⑵叶绿体在荧光显微镜下观察可看到火红色的自发荧光，且为点状。这是因为叶绿体自身在悬液中的分布呈点状，而且其内的叶绿素在经激发光波照射后，可放出火红色的自发荧光，而悬液其它组分没有此反应。

⑶叶绿体荧光染色后在荧光显微镜下观察，可以看到其呈现出的桔红色的斑块状，在此之外，其空白处背景色为绿色。这是因为叶绿体吸附吖啶橙后发出了桔红色的次生荧光，而绿色则是由叶绿体悬液中混有细胞核以及其内的 DNA 和 RNA，在吸附吖啶橙后经荧光反应，呈绿色。

⒉注意事项

⑴叶绿体的分离在等渗溶液中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。

⑵分离过程最好在 0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。

⑶离心机使用时要平衡。

⑷荧光显微镜的使用

?荧光显微镜镜检要在光线尽量暗的环境下进行；

?使用荧光显微镜时要注意不要直接观察激发光源，保护眼

睛；

?凡是荧光染料都有一定毒性，请做好保护；

?利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许

多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等；

?按 starter 按钮 3—5 秒以启动激发光源，但不能超过

5 秒；

?启动 2—3 分钟后方可稳定；荧光显微镜外观图

?启动 15 分钟内不得关闭电源；

?一旦关闭电源，3 分钟内不得重新启动，用完后关闭 main switch；

?在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照；

?观察时要选择相对应的激发滤片、阻断滤片和双色滤片；

?放置样品，要先在普通目镜下选好要观察的视野；

?在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油；

?贡灯开启后 15min 内不要关闭；

?试验结束，切断电源。

荧光显微镜光路图

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