环巴胺抑制+Shh+信号对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响
环巴胺抑制Ｓｈｈ信号对乳腺癌细胞
增殖和凋亡的影响
邵力伟，姚春，伍龙，任德发
（江汉大学附属第二医院、武汉市第五医院，武汉４３００５０）
摘要：目的 探讨环巴胺靶向抑制Ｓｈｈ信号对乳腺癌细胞增殖、凋亡以及Ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达的影响。方法 采用荧光定量ＰＣＲ法检测乳腺癌组织及癌旁正常组织中Ｓｈｈ、ＰＴＣＨ１及ＧＬｉ１的表达，ＭＴＴ法检测不同浓度环巴胺对人乳腺癌细胞ＭＣＦ－７增殖抑制的影响，流式细胞术检测环巴胺对ＭＣＦ－７细胞凋亡的影响，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测环巴胺处理前后ＭＣＦ－７细胞ＧＬｉ１和Ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达。结果 Ｓｈｈ、ＰＴＣＨ１及ＧＬｉ１在乳腺癌组织中均呈高表达；不同浓度环巴胺均可抑制ＭＣＦ－７细胞增殖并诱导其凋亡；环巴胺处理后ＧＬｉ１和Ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达均降低。结论 Ｓｈｈ信号在乳腺癌组织中呈激活状态，靶向抑制Ｓｈｈ信号可抑制乳腺癌细胞增殖并诱导其凋亡，其可能通过抑制Ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达发挥作用。
关键词：乳腺癌；Ｓｈｈ信号；环巴胺；细胞增殖；细胞凋亡；Ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白
doi：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－２６６Ｘ．２０１５．１８．０２１
中图分类号：Ｒ７３７．９ 文献标志码：Ｂ 文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１５）１８－００５８－０３
研究显示，Ｓｈｈ信号在多种恶性肿瘤中异常激活并与肿瘤的恶性程度密切相关，针对Ｓｈｈ信号通路的靶向治疗有望成为治疗恶性肿瘤的新途径［１～３］。凋亡抑制蛋白Ｓｕｒｖｉｖｉｎ是抑制细胞凋亡的重要成分之一，抑制肿瘤细胞中Ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达可起到抑制增殖、促进凋亡的作用［４］。本研究通过检测乳腺癌细胞中Ｓｈｈ信号分子（Ｓｈｈ、ＰＴＣＨ１、ＧＬｉ１）的表达情况，进一步利用Ｓｈｈ信号通路特异性抑制剂环巴胺作用于人乳腺癌细胞系ＭＣＦ－７，观察其对乳腺癌细胞增殖、凋亡及Ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达的影响。
1 资料与方法
１．１ 临床资料 选择２００８年１月～２０１２年１２月我院收治的乳腺癌手术患者４６例，年龄３０～６９（４２．８±３．１）岁。术前均未接受放化疗，术后经病理检查确诊。其中浸润性导管癌３９例、其他７例。
ＴＮＭ分期Ⅰ期２例，Ⅱ期８例，Ⅲ期３１例，Ⅳ期５例。术中分别取肿瘤组织和癌旁正常乳腺组织迅速冷冻于液氮，－８０℃保存备用。
１．２ 细胞与试剂 人乳腺癌细胞系ＭＣＦ－７（由武汉大学人民医院中心实验室自行传代培养）培养于含１０％胎牛血清、１００ＩＵ／ｍＬ青霉素、１００μｇ／ｍＬ链霉素的ＲＰＭＩ１６４０培养基中，置于３７℃、５％ＣＯ２、饱和湿度的培养箱中常规传代培养。ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥＸＴａｑ试剂盒购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＲＰＭＩ１６４０培养基、胎牛血清、Ｔｒｉｚｏｌ试剂为美国Ｇｉｂｃｏ公司产品；环巴胺、四甲基偶氮唑蓝（ＭＴＴ）、二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）、胰酶等为美国Ｓｉｇｍａ公司产品；一抗ＧＬｉ１、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＧＡＰＤＨ兔抗人单克隆抗体均购自Ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ公司；二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
１．３ 检测方法
１．３．１ Ｓｈｈ信号相关蛋白检测 采用实时荧光定量ＰＣＲ方法。取乳腺癌组织和癌旁正常组织，按Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒说明书提取总ＲＮＡ，以其为模板进行逆转录，合成ｃＤＮＡ第一链，－２０℃保存备用。按照ＳＹＢＲ试剂盒说明书操作。Ｓｈｈ上游引物：５′－ＣＣＣＡＡＴＴＡＣＡＡＣＣＣＣＧＡＣＡＴＣ－３′；下游引物：５′－ＴＣＡＣＣＣＧＣＡＧＴＴＴＣＡＣＴＣＣＴ－３′。ＰＴＣＨ１上游引物：５′－ＴＧＡＧＡＣＴＧＡＣＣＡＣＧＧＣＣＴＧ－３′；下游引物：５′－ＡＣ－ＣＣＴＣＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ－３′。ＧＬｉ１上游引物：５′－ＧＴＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＣＣＡＧＡＡＣＡ－３′；下游引物：５′－ＡＴ－ＡＧＧＧＧＣＣＴＧＡＣＴＧＧＡＧＡＴ－３′。内参ＧＡＰＤＨ上游引物：５′－ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ－３′；下游引物：５′－ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ－３′。引物由上海生工生物工程公司合成。
１．３．２ 细胞增殖检测 采用ＭＴＴ法。将ＭＣＦ－７以５×１０４／ｍＬ接种于９６孔板中，每孔２００μＬ。在３７℃、饱和湿度、含５％ＣＯ２的培养箱中培养２４ｈ后换液。分别加入５、１０、２０μｍｏｌ／Ｌ环巴胺，未处理细胞作为对照，每组设３个复孔。继续培养２４、４８、７２ｈ后，每孔加入５ｍｇ／ｍＬ的ＭＴＴ２０μＬ，继续孵育４
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ｈ。更换培养液为１５０μＬ的ＤＭＳＯ，震荡混匀，用酶标仪检测波长４９０ｎｍ处的吸光度值。细胞生长抑制率（％）＝（对照组吸光度－实验组吸光度）／对照组吸光度×１００％。重复实验３次取平均值。１．３．３ 细胞凋亡检测 将ＭＣＦ－７消化重悬后，以２×１０５／孔接种于６孔板中，分别加入５、１０、２０μｍｏｌ／Ｌ环巴胺，未处理细胞作为对照，每组设３个复孔，继续培养４８ｈ。常规胰酶消化收集细胞，ＰＢＳ洗涤２次，加入ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ和ＰＩ避光室温孵育１５ｍｉｎ，上流式细胞仪检测。实验重复３次取平均值。１．３．４ Ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白检测 采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法。收集０、５、１０、２０μｍｏｌ／Ｌ环巴胺处理４８ｈ后的ＭＣＦ－７细胞，提取蛋白，测定蛋白浓度。取２０μｇ蛋白上样，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳并转移至ＰＶＤＦ膜。常规封闭、洗膜后加入一抗４℃孵育过夜，ＴＢＳＴ洗３次，加入二抗室温孵育２ｈ，化学发光显色。
１．４ 统计学方法 采用ＳＰＳＳ１７．０统计软件，计量资料采用珋x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜０．０５为有统计学差异。
2 结果
２．１ Ｓｈｈ信号在肿瘤组织与癌旁组织中的表达 肿瘤组织中Ｓｈｈ、ＰＴＣＨ１和ＧＬｉ１的表达均显著高于癌旁组织（P均＜０．０１）。见表１。
表1 Shh信号相关蛋白在乳腺癌中的
表达（n＝3，相对表达量，珔x±s）
检测部位ＳｈｈＰＴＣＨ１ＧＬＩ１
肿瘤组织０．４７３±０．３２４０．３６±０．２０９０．２９６±０．１０６
癌旁组织１．５５８±０．４３１倡０．９９±０．２０２倡２．１０５±０．７００倡 注：与肿瘤组织比较，倡P＜０．０１。
２．２ 不同浓度环巴胺对ＭＣＦ－７增殖的影响 ＭＴＴ实验结果显示，５、１０、２０μｍｏｌ／Ｌ环巴胺均可抑制乳腺癌细胞ＭＣＦ－７增殖，其抑制作用具有时间和剂量依赖性。见表２。
表2 不同浓度环巴胺对MCF－7增殖抑制率的
影响（n＝3，％，珔x±s）
组别
ＭＣＦ－７增殖抑制率
２４ｈ４８ｈ７２ｈ
对照组０．１４±０．５９１．５８±０．８３３．７１±３．３４
环巴胺组
５μｍｏｌ／Ｌ８．７３±０．４５１０．４７±０．７０１３．１７±０．４５
１０μｍｏｌ／Ｌ１８．９０±２．９５２７．０７±４．０５３３．２０±２．７５
２０μｍｏｌ／Ｌ２９．４０±６．２６３７．８３±３．２３３８．５７±４．５２
F３９．９４２１１６．３７８８２．４９５
P０．０００ ０．００００．０００２．３ 不同浓度环巴胺对ＭＣＦ－７凋亡的影响 流式细胞仪检测结果显示，０、５、１０、２０μｍｏｌ／Ｌ环巴胺均可诱导ＭＣＦ－７细胞凋亡，其凋亡率分别为（１．９４±０．６４）％、（１１．０９±１．６５）％、（２６．８７±０．９７）％、（３２．５６±２．６７）％，随环巴胺浓度增加，凋亡率明显增加（P＜０．０１）。
２．４ 不同浓度环巴胺对Ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白表达的影响 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示，不同浓度环巴胺均可降低
ＧＬｉ１和Ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达，其作用随浓度增加而增强。见图
１。
图1 不同浓度环巴胺对乳腺癌细胞GLi1和
Survivin蛋白表达的影响
3 讨论
研究显示，多种信号转导途径在乳腺癌中呈激活状态，靶向抑制这些信号通路可能成为一种新的治疗乳腺癌的手段［５］。Ｓｈｈ信号通路在调控胚胎发育和干细胞分化中具有重要作用，其异常激活与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。Ｓｈｈ信号通路的关键因子包括Ｓｈｈ、ＰＴＣＨ、ＧＬｉ等，在Ｈｈ信号激活时，Ｈｈ与ＰＴＣＨ（ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２）结合，进一步将信号传递给转录因子ＧＬｉ（ＧＬｉ１、ＧＬｉ２、ＧＬｉ３），后者进入核内，促进基因表达，参与对细胞增殖与凋亡的调控过程。研究表明，在肝癌、胃癌、骨肉瘤、乳腺癌［６］等恶性肿瘤中均存在Ｓｈｈ信号的异常激活。本研究显示，乳腺癌组织及癌旁正常组织中Ｓｈｈ信号分子Ｓｈｈ、ＰＴＣＨ１和ＧＬｉ１均呈高表达，与文献［７～９］报道相符。
本研究使用Ｓｈｈ信号通路的特异性抑制剂环巴胺体外作用于乳腺癌细胞，观察不同浓度环巴胺对ＭＣＦ－７细胞增殖和凋亡的影响。结果显示，不同浓度环巴胺均可抑制Ｓｈｈ信号关键分子ＧＬｉ１的表达，且可抑制乳腺癌细胞的增殖并诱导其发生凋亡。提示体外靶向抑制Ｓｈｈ信号通路可抑制乳腺癌细胞的生长，有望对乳腺癌起到治疗作用。
Ｓｈｈ信号激活后可通过作用于多种效应分子来调控肿瘤细胞的增殖与凋亡［１０］。Ｓｕｒｖｉｖｉｎ是凋亡抑制蛋白家族的新成员，其在恶性肿瘤中常呈高表达而起到促进增殖和抑制凋亡的作用，采用各种手段抑制肿瘤细胞中Ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达可起到抑制肿瘤生长的作用［１１］。本研究显示，应用环巴胺抑制Ｓｈｈ信号后，乳腺癌细胞ＭＣＦ－７中Ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达显著降
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低，提示环巴胺靶向抑制Ｓｈｈ可能是通过抑制Ｓｕｒ－ｖｉｖｉｎ的表达而对乳腺癌细胞起到杀伤作用。
综上所述，Ｓｈｈ信号在乳腺癌的发生、发展中起重要作用。应用Ｓｈｈ信号通路特异性抑制剂环巴胺靶向抑制Ｓｈｈ信号可有效抑制乳腺癌细胞增殖并诱导其凋亡，其可能是通过抑制Ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达发挥作用。
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（收稿日期：２０１４－１２－３１）
ＩＬ－１７对乳腺癌细胞侵袭力的影响及机制
赵严冬，王建
（徐州医学院第二附属医院，江苏徐州２２１００４）
摘要：目的 探讨ＩＬ－１７对人乳腺癌细胞侵袭能力的影响及其可能机制。方法 选择对数生长期乳腺癌细胞株ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１，分别加入含浓度为１、１０、１００ｎｇ／ｍＬ的ＩＬ－１７的培养液进行干预处理（处理组），将不含
ＩＬ－１７培养液处理的细胞作为空白对照组。采用ＣＣＫ－８实验检测细胞增殖能力，Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室实验检测细胞穿透能力，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测乳腺癌细胞中磷酸化细胞外信号调节激酶（ｐ－ＥＲＫ）、基质金属蛋白酶－９（ＭＭＰ－９）的表达。
结果 １００ｎｇ／ｍＬ的ＩＬ－１７作用７２ｈ可明显抑制ＭＣＦ－７增殖，１０、１００ｎｇ／ｍＬＩＬ－１７分别作用４８ｈ和７２ｈ可明显抑制ＭＤＡ－ＭＢ－２３１增殖。与空白对照组比较，各处理组ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１穿膜数明显增加，ｐ－ＥＲＫ、ＭＭＰ－９表达水平明显升高（P均＜０．０５），且其表达呈浓度依赖性。结论 ＩＬ－１７能促进人乳腺癌细胞的侵袭，其机制可能与上调人乳腺癌细胞中ｐ－ＥＲＫ和ＭＭＰ－９表达有关。
关键词：白细胞介素１７；乳腺癌；磷酸化细胞外信号调节激酶；基质金属蛋白酶－９
doi：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－２６６Ｘ．２０１５．１８．０２２
中图分类号：Ｒ７３７．９ 文献标志码：Ｂ 文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１５）１８－００６０－０３
乳腺癌的发生发展是多基因、多因素共同参与的复杂过程。感染因素在部分乳腺癌的发生发展过程中起重要作用，约２０％的乳腺癌归因于病毒感染，如ＥＢ病毒和人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）［１，２］。乳腺癌作为一个炎症相关性肿瘤，其发生发展可能与炎症因子ＩＬ－１７有关［３］。２０１３年１２月～２０１４年１０月，我们观察了ＩＬ－１７对人乳腺癌细胞侵袭转移的影响，并对细胞中基质金属蛋白酶－９（ＭＭＰ－９）和磷酸
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细胞的增殖、分化、癌变、衰老和凋亡
细胞的增殖、分化、癌变、衰老和凋亡 一、单项选择题： 1．下图为人体细胞的分裂、分化、衰老和凋亡过程的示意图，图中①—⑥为各个时期的细 胞，a —c 表示细胞所进行的生理过程。据图分析，下列叙述正确的是 A ．⑤与⑥的基因型相 同，蛋白质的种类也相同 B ．细胞的衰老与凋亡就会引起人体衰老与死亡 C ．若⑤⑥已失去分裂能力，则其细胞内遗传信息的流动方向为DNA →RNA →蛋白质 D ．与①相比，②的表面积与体积的比值增大，与外界环境进行物质交换的能力增强 2．下列关于观察减数分裂实验的叙述中，错误．． 的是 A ．可用蝗虫卵母细胞、蚕豆花粉母细胞的固定装片观察减数分裂 B ．用桃花的雄蕊比用桃花的雌蕊制成的装片中，容易观察到减数分裂现象 C ．能观察到减数分裂现象的装片中，可能观察到同源染色体联会现象 D ．用洋葱根尖制成装片，能观察同源染色体联会现象 3．动物和人体内具有分裂和分化能力的细胞称为干细胞。对下图的相关叙述中，错误的是 A ．a 过程表示干细胞能自我更新 B ．b 、c 过程表示干细胞具有分化能力 C ．a 、b 、c 过程中细胞的遗传信息表达情况不同 D ．b 过程形成的细胞直接组成器官，可供器官移植使用 4．为了观察减数分裂各时期的特点，实验材料选择恰当的是 ①蚕豆的雄蕊 ②桃花的雌蕊 ③蝗虫的精巢 ④小鼠的卵巢 A ．①② B ．③④ C ．①③ D ．②④ 5．下列关于植物组织培养的叙述中，错误．． 的是 A ．培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压 B ．培养基中的生长素和细胞分裂素影响愈伤组织的生长和分化 C ．离体器官或组织的细胞都必须通过脱分化才能形成愈伤组织 D ．同一株绿色开花植物不同部位的细胞经培养获得的愈伤组织基因相同 6．关于细胞生命历程的说法，错误．． 的是 A ．细胞分化由遗传物质控制 B ．细胞癌变过程中遗传物质发生改变 C ．细胞衰老过程中部分酶活性改变 D ．人在胚胎发育后期尾的消失是通过尾部细胞衰老死亡而实现的 二、多项选择题： 24．下列关于细胞衰老的说法正确的是 A ．生物体内绝大多数细胞都要经过未分化、分化、衰老和死亡这几个阶段 衰老、凋亡 a b b c c ① ② ③ ④ ⑤上皮细胞 ⑥骨骼肌细胞
如何在组织中检测细胞增殖,分化和凋亡
在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡的方法一、检测细胞增殖的方法 （1）直接方法：通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力 1、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR ）渗入法 胸腺嘧啶核苷（TdR ）是DNA 特有的碱基，也是DNA 合成的必需物质。用同位素3H 标记TdR 即3H-TdR 作为DNA 合成的前体能掺入DAN 合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN 的代谢及细胞增殖情况。但是具有放射性。 2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE ）检测法 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE ）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE 成为一种良好的细胞标记物。CFSE 进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时，CFsE 标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm 激发光和荧光检测通道可对其进行分析。 3、Brdu 检测法 Brdu 中文全名5- 溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA 合成期（S 期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu 单克隆抗体，ICC 染色，显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义 4、增殖标志检测 有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增值细胞缺乏这些抗原，您也可以通过特异性的
单抗来对细胞增殖进行检测。例如，在人体细胞中，Ki-67 抗体识别同名蛋白，在细胞周期 S 期、G2 期和M 期表达，而在G0 期和G1 期（非增殖期）不表达。用针对Ki-67 蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括，增殖细胞核抗原PCNA 、拓扑异构酶IIB 和磷酸化组蛋白H3 。 （2）间接方法：通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力 1、MTT 检测法 MTT 检测法主要反映细胞的能量代谢，是检测细胞增殖活力的一种简便准确的方法，其原理是在活细胞生长和增殖过程中，线粒体内的脱氢酶可将黄色的MTT 分解成兰紫色的甲 （Formazan ），生成的甲量的多少与细胞的数量和细胞的活力成正比。 2、ATP 检测 细胞内的ATP 含量受到了严格调控，检测ATP 也可以得到细胞增殖的信息。死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP ，在细胞溶解物或提取物中测得的ATP 浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。利用荧光素酶luciferase 及其底物荧光素luciferin 的ATP 检测以生物发光为基础，能够为您提供非常灵敏的结果。如果有ATP 存在荧光素酶就会发光，而且其发光强度与ATP 浓度成正比，用能读取发光信号的光度计和酶标仪都可以方便的进行检测。这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测和筛选。 二、检测细胞分化的方法 1 、流式鉴定细胞表面标志，以判断细胞是否分化 2、观察细胞形态，与已分化的细胞进行对比 3、分化诱导评估其分化能力
四种甘草对人乳腺癌细胞增殖抑制和诱导凋亡作用的比较研究(精)
四种甘草对人乳腺癌细胞增殖抑制和诱导凋亡作用 的比较研究 [ 08-05-16 15:17:00 ] 作者：马淼编辑：studa20 【摘要】目的比较新疆四种野生甘草活性成分对人乳腺癌细胞的增殖 抑制作用，以期筛选出药效最佳的甘草种类。方法采用MTT法检测不同样品对BCAP37细胞的增殖抑制作用，Hoechst33258荧光染色法检测各样品诱导BCAP37细胞凋亡的作用。结果4种甘草的活性成分对人乳腺癌BCAP37 细胞具有显著的增殖抑制与诱导凋亡的作用，且存在显著的种间与产地间差 异。结论抗癌药效最佳的甘草种类为阿拉尔甘草。 【关键词】甘草活性成分人乳腺癌BCAP 37细胞 Comparative Study on the Anti-proliferation and Apoptosis- inducing Effects of Active Components from Four Glycyrrhiza Species on Human Breast Cancer BCAP-37 Cell Abstract:ObjectiveTo select the optimal glycyrrhiza species for medicinal utilization by comparing the anti-proliferation and apoptosis-inducing effects of active components from four wild glycyrrhiza species in Xinjiang on human breast cancer BCAP37 cell. MethodsThe anti-proliferation effects of different samples on BCAP 37 cell were measured by MTT assay. The cell apoptotic rate was detected by Hoechst 33258 stain.ResultsActive components of four Glycyrrhiza species inhibited the proliferation of BCAP37 cells and induced apoptosis significantly. What's more, there were significant interspecific and spatial variations in the anti-proliferation and apoptosis-inducing effects. ConclusionThe optimal Glycyrrhiza species for anticancer utilization is Glycyrrhiza alalensis L. Key words:Glycyrrhiza; Active Component; Human breast cancer BCAP37 Cell 甘草是我国十分重要的中药材，素有“十方九草”的美誉。近年来，随着对甘草开发利用的不断深入，甘草被广泛用于药品、食品、保健品、化妆品 等领域［1］，甘草的市场需求量剧增。我国是世界上甘草出口大国，其中 80％为野生甘草，仅有20％为栽培甘草。我国甘草储量锐减，由建国初期 200～250万吨下降到50～70万吨［2］。现存的野生甘草资源已无法满足日益 增长的市场需求，因此，人工栽培甘草势在必行，野生优质甘草品种的筛选显
乳腺癌细胞
形态生长方式类型培养条件 人乳腺癌细胞MCF7 上皮样贴壁生长常规该细胞是从一名69岁的白人女性 乳腺癌患者的胸腔积液中分离建立的。该细胞保留了多个分化乳腺上皮的特性，包括：能通过胞质雌激素受体加工雌二醇并能形成隆突结构( domes );该细胞表达WNT7B 癌基因；TNF- a可以抑制MCF-7细胞的生长；抗雌激素处理能调节细胞胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)的分泌。ER(+),PR(+),Her-2(-) 人乳腺癌细胞MDA-MB-231 上皮样贴壁生长三阴MDA-MB-231是从一名 51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-a受体和WNT7B癌基因。属于高转移性恶性乳腺癌细胞系，易成瘤，且常用 于肿瘤转移研究 人乳腺导管癌细胞MDA-MB-435S 上皮样贴壁生长三阴，转移性乳腺导管腺 癌MDA-MB-435S 是一种纺锤形的细胞，1976年由其亲本(MDA-MB-435)中筛选得到。MDA-MB-435是从一名31岁的转移性乳腺导管腺癌女性患者胸水中分离得到的。但近来证明MDA-MB-435细胞被M14黑色素瘤细胞污染。 人乳腺癌细胞MDA-MB-453 上皮样；多角形贴壁生长三阴，转移性乳腺癌 该细胞系由Cailleau R在1976年从一名48岁的患有转移性乳腺癌的白人女性的心包渗出液中分离建立的。该细胞表达FGF的受体。 人乳腺癌细胞MDA-MB-157 上皮样贴壁生长髓样癌该细胞源自一位患有 乳腺髓样癌的44岁黑人女性，表达WNT7B癌基因，细胞与细胞边界处有细胞桥粒、微绒毛、张力细丝。 人乳腺癌细胞SK-BR-3 上皮样贴壁生长这株细胞是1970年由Trempe G和 Old LJ从一位43岁的白人女性乳腺癌患者的胸腔积液中分离得到的。该细胞亚显微结构特征包括微丝和桥粒、肝糖原颗粒、大溶酶体、成束的细胞质纤丝；过表达 ______________ HER2/c-erb-2 基因产物。 人乳腺导管癌细胞ZR-75-1 上皮样贴壁生长该细胞产生高水平的黏液素 MUC-1 mRNA，低水平的MUC-2 mRNA，但不表达MUC-3基因；表达雌激素受体。 人乳腺导管癌细胞HCC38 上皮样贴壁生长该细胞于1992年从一位50岁的白 人女性乳腺导管癌组织中分离建立，该患者曾有平滑肌肉瘤的病史，其母亲死于乳腺 癌；该细胞癌基因her2/neu- , p53+ ;上皮细胞特异性标志物EGP2 (上皮糖蛋白2) 和CK19
【CN109694853A】一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910151712.6 (22)申请日 2019.02.28 (71)申请人 贵州省人民医院 地址 550002 贵州省贵阳市南明区中山东 路83号 (72)发明人 侯净 倪青 魏娜 贾琦 刘欣 胡诗航 (74)专利代理机构 北京栈桥知识产权代理事务 所(普通合伙) 11670 代理人 潘卫锋 (51)Int.Cl. C12N 5/09(2010.01) C12N 15/85(2006.01) (54)发明名称 一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构 建方法 (57)摘要 本发明公开了一种HER2基因过表达的乳腺 癌细胞系的构建方法，包括以下步骤：S1：对乳腺 癌细胞进行培养；S2：通过对乳腺癌细胞PCR扩 增，建立表达系统；S3：对乳腺癌细胞系进行构 建，S4：进行细胞观察和荧光强度对比。本发明通 过实时荧光定量PCR检测HER2基因在mRNA中的表 达情况，以证明细胞系构建成功。本发明构建的 乳腺癌细胞系可以稳定表达HER2基因，具有整合 效率高，假阳性率低等优点，为进一步研究HER2 基因乳腺癌发生、发展、治疗及后续耐药过程中 提供基本且有力的研究工具。权利要求书2页 说明书7页CN 109694853 A 2019.04.30 C N 109694853 A
权 利 要 求 书1/2页CN 109694853 A 1.一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤： S1：将新鲜的乳腺癌细胞在含有10％FBS的液体培养基中，在温度为30-35℃条件下培养1-2h,然后用FBS充分洗涤后，置于转动频率为50-80r/min、温度为20℃的恒温摇床上进行悬浮细胞培养，对培养后的细胞通过灭菌处理，再100目过滤，进行转接培养3-5次，再在水浴温度为30℃、通气量为5-10m3/h的条件下震荡处理2-4h，得到乳腺癌细胞； S2：提取乳腺癌细胞的总mRNA，将总mRNA进行稀释后放入到反应离心管，在温度为60-75℃的条件下，加入反转录缓冲液，然后温度按照1.5℃/min的降温速率下降至20-30℃，向其加入反转录酶、DNA聚合酶，期间不断用磁力棒搅拌处理，处理30-45min，得到cDNA，再对得到的cDNA通过上下引物分别进行PCR扩增，通过切酶SnaBI剪切，进行琼脂凝胶电泳，通过pBS-T Mini Kit中片段连接的方法，分别克隆到pBS-T载体中，通过电泳结果筛选及其琼脂糖凝胶电泳，获得质粒； S3：所述质粒作为模板，pGenesil-1载体，构建出相应的pGenesil-ETV1A、pGenesil-ETV1B、pGenesil-ETV1C、pGenesil-NC重组siRNA表达载体；在200μlPCR管中配制如下连接体系：pGenesil-1/HindⅢ/BamHⅠ载体大片段1μl；双链片段DNA5ul；T4DNAligase1ul；10×T4DNAligasebuffer1ul；ddH2O2μl。以上体系配制好后放入金属浴，16℃反应4小时，将连接产物全部加入到100μlDH5α感受态中，冰浴15min，加入500μlLB液体培养基，在温度为30℃，70rpm条件下，振荡培养1h，然后在35℃热激90s后立即冰浴100s，取150μl培养物涂布于LB/ Kan平板上37℃倒置培养10小时； S4：对培养后培养物进行转染Marc-145细胞，通过消化，振荡过滤将Marc-145细胞重选，调节细胞悬浮液密度，培养3-6h，然后将培养后的Marc-145细胞放入到四孔板中培养，待细胞密度为60-70％时，向四孔中分别加入转染试剂离心搅拌，观察细胞病变，培养4代后，加入含有乳腺癌细胞的新鲜培养基培养3-5h，洗涤，观察细胞状态及荧光强度。 2.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中液体培养液为硝酸铵15-20g/L、黄豆粉3-7g/L、磷酸氢二钾0.03-1g/L。 3.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中液体培养液为黄豆粉3-7g/L、磷酸氢二钾0.03-1g/L、硝酸铵15-20g。 4.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中PCR反应体系及反应条件：通过无菌超纯水稀释至10μM/L；取已经稀释好的两条互补的mRNA靶点序列片段各1.5μl，10×T4buffer1μl，加水至总体积20μl，放于200μl的PCR管中，RT产物8.7uL，4×PCR缓冲液3uL，15mM的氯化钾3uL，PCR引物溶液1.5uL，DNA聚合酶0.5uL混匀后加入到87孔样品板上进行PCR反应，反应条件：85℃，8min；90℃，25min，60℃，30秒钟，65℃，2min，循环30次；70℃1min；4℃直至收取PCR产物。 5.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中所得的质粒通过阳性克隆筛选，进行阳性克隆筛选时，先平均取得质粒，均匀涂布到含去去甲基金霉素培养基平板上，培养6h，然后抽提质粒，将培养物在温度为20-30℃的条件下，滤膜过滤，通过EcoRI进行单酶切鉴定，被EcoRI切开的可能是阳性克隆。 6.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S4中从-70℃中取出质粒细胞，冰上放置4min，待质粒细胞解冻后，加入9μL连接产物，轻柔混匀内容物，冰中放置10min；然后将之放到预加温到30℃的水浴锅中，静置70s；快 2
乳腺癌细胞培养
MCF-7 是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可，10－15％的小牛血清就能长得很好。一般两到三天传一代。传代也很常规。吸出培养基，加入0.25％的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除残余的培养基。再加入2ml胰酶（25ml培养瓶）静置消化2－5min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。 MDA-MB-231人乳腺癌细胞
细胞中文名称人乳腺癌细胞 细胞英文名称 MDA-MB-231 物种人 细胞形态特征上皮样 细胞生长特性贴壁生长 细胞特种特性 MDA-MB-231是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-α受体和WNT7B癌基因 培养基 L15: Leibovitz Medium 血清 10%FBS 细胞传代方法 1:2~1:4传代；每周2~3次 细胞传代情况 C5 细胞冻存条件MDA-MB-231 人乳腺癌细胞基础培养基 +5%DMSO+20%FBS 支原体检测阴性 说明 培养基：DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10% 培养条件：37℃ 5% CO2 消化条件：0.25% (w/v) Trypsin-0.53mM EDTA溶液，消化5-10min 传代的比例：1：2~1：4 换液时间：2~3天换液一次 冻存液比例：85%培养基，10%FBS, 5% (v/v) DMSO
第八章 细胞增殖和凋亡异常与疾病
第八章细胞增殖和细胞凋亡异常与疾病 一、A型题 1．细胞凋亡的概念是 A．由体内外因素引起的细胞渐进、缓慢的病变导致的细胞死亡过程 B．由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程 C．由体内外因素诱导的一种生理性、主动的细胞死亡方式 D．由体内外因素引起的细胞急性、严重的改变导致的细胞死亡过程 E．由体内外因素诱导的一种病理性、被动的细胞死亡方式 [答案] B [题解] 细胞凋亡是指由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程。 2．有关细胞凋亡的生理和病理意义下列哪一项是错误的？ A．确保机体正常发育D．保证机体正常生长 B．维持内环境稳定E．发挥积极的防御功能 C．促进生物进化 [答案] C [题解] 细胞凋亡的生理和病理意义包括：①确保机体正常发育、生长；②维持内环境稳定；③发挥积极的防御功能；并不包括促进生物进化。 3．有关细胞凋亡的特征下列哪一项是错误的？ A．由较弱刺激触发，可见于生理或病理情况 B．DNA片段化，电泳时呈“梯”状条带 C．溶酶体相对完整，局部无炎症反应 D．主动过程，耗能，无需新蛋白合成 E．胞膜皱缩内陷，分割胞浆成凋亡小体 [答案] D [题解] 细胞凋亡不仅是一个主动过程，需要耗能，而且还需要有新蛋白质合成。 5．促进细胞凋亡的基因是 A．Bcl-2 D．c-myc B．Fas E．Bcl-XL C．突变型p53 [答案] B [题解] Bcl-2、突变型p53和Bcl-XL都是抑制凋亡基因，而c-myc是双向调节基因，只有Fas基因是促进细胞凋亡的基因。 6．抑制细胞凋亡的基因是（0.377，0.392，03临床） A．Fas D．Bcl-2 B．野生型p53 E．Bcl-Xs C．c-myc [答案] D [题解] Fas、野生型p53和Bcl-Xs是抑制凋亡基因，而c-myc是双向调节基因，只有Bcl-2是抑制凋亡基因。 10．细胞凋亡时发生的变化下列哪一项出现最早？ A．线粒体膜通透性增加D．核酸内切酶激活 B．线粒体跨膜电位下降E．核转录因子激活 C．凋亡蛋白酶激活 [答案] B [题解] 线粒体跨膜电位下降使线粒体膜通透性增加，随后才引起凋亡蛋白酶激活、核酸内切酶激活以及核转录因子激活。 11．细胞凋亡的双向调节基因是 A．野生型p53 D．Bcl-2 B．Fas E．Bax C．c-myc [答案] C [题解] 野生型p53、F as和Bax是促进凋亡基因，Bcl-2是抑制凋亡基因，而c-myc才是细胞凋亡的双向调节基因。 13．细胞凋亡的主要执行者是 A．核转录因子和核酸内切酶D．凋亡蛋白酶和谷氨酰胺转移酶
如何在组织中检测细胞增殖,分化和凋亡
在组织中检测细胞增殖、分化与凋亡得方法 一、检测细胞增殖得方法 (1)直接方法:通过直接测定进行分裂得细胞来评价细胞得增殖能力 1、胸腺嘧啶核苷(3H-ＴｄR)渗入法 胸腺嘧啶核苷(TdR)就是ＤNA特有得碱基,也就是DＮＡ合成得必需物质、用同位素３H 标记TdＲ即3H—TdR作为ＤNA合成得前体能掺入DAN合成代谢过程,通过测定细胞得放射性强度,可以反映细胞DＡN得代谢及细胞增殖情况。但就是具有放射性、 2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CＦＳE)检测法 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(ＣFＳE)就是一种可穿透细胞膜得荧光染料,具有与细胞特异性结合得琥珀酰亚胺脂基团与具有非酶促水解作用得羟基荧光素二醋酸盐基团,使ＣFＳE成为一种良好得细胞标记物。ＣFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内得氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时,CＦsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度就是亲代细胞得一半。这样,在一个增殖得细胞群中,各连续代细胞得荧光强度呈对递减,利用流式细胞仪在48８nm激发光与荧光检测通道可对其进行分析、 3、Ｂｒdu检测法 Brｄｕ中文全名５—溴脱氧尿嘧啶核苷,为胸腺嘧啶得衍生物,可代替胸腺嘧啶在DＮＡ合成期(S期),活体注射或细胞培养加入,而后利用抗Brdu单克隆抗体,IＣＣ染色,显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物,双重染色,可判断增殖细胞得种类,增殖速度,对研究细胞动力学有重要意义 ４、增殖标志检测 有些抗原只存在于增殖细胞中,而非增值细胞缺乏这些抗原,您也可以通过特异性得单抗来对细胞增殖进行检测、例如,在人体细胞中,Ki—６7抗体识别同名蛋白,在细胞周期S期、G2期与M期表达,而在Ｇ0期与Ｇ1 期(非增殖期)不表达、用针对Ki-６7蛋白得单抗就可以检测细胞得增值情况、由于需要组织切片,这种方法无法进行高通量分析。不过这一方法颇受癌症研究者们得青睐,因为它能够用来检测体内肿瘤细胞得增殖。其她普遍使用得细胞增殖或细胞周期调控标志还包括,增殖细胞核抗原PCＮA、拓扑异构酶IIB与磷酸化组蛋白H3。 (2)间接方法:通过检测样品中健康细胞得数目来评价细胞得增殖能力 １、MTT检测法 MTT检测法主要反映细胞得能量代谢,就是检测细胞增殖活力得一种简便准确得方法,其原理就是在活细胞生长与增殖过程中,线粒体内得脱氢酶可将黄色得MTT分解成兰紫色得甲(Foｒmazａn),生成得甲量得多少与细胞得数量与细胞得活力成正比。 2、ATP检测 细胞内得ATＰ含量受到了严格调控,检测ＡTP也可以得到细胞增殖得信息。死亡细胞或即将死亡得细胞几乎不含ATP,在细胞溶解物或提取物中测得得ATP浓度与细胞数之间存在严格得线性关系。利用荧光素酶ｌuｃifeｒaｓｅ及其底物荧光素lucｉferin得ＡＴＰ检测以生物发光为基础,能够为您提供非常灵敏得结果。如果有ATＰ存在荧光素酶就会发光,而且其发光强度与ＡＴP浓度成正比,用能读取发光信号得光度计与酶标仪都可以方便得进行检测。这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测与筛选。 二、检测细胞分化得方法 1、流式鉴定细胞表面标志,以判断细胞就是否分化 2、观察细胞形态,与已分化得细胞进行对比 3、分化诱导评估其分化能力 三、检测细胞凋亡得方法 (1)形态学检测
细胞增殖、衰老、分化和癌变知识点
第二章细胞的增殖和分化 1、（了解）细胞周期 定义：连续分裂的细胞从一次分裂结束到下次分裂结束所经历的整个过程。 不同生物或同一生物不同种类的细胞，细胞周期长短不一。 2、（理解）动、植物细胞有丝分裂的过程、各时期分裂图 3、（理解）动、植物细胞有丝分裂异同及意义
细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。细胞有丝分裂的重要意义（特征），是将亲代细胞的染色体经过复制以后，精确地平均分配到两个子细胞中去，因而在生物的亲代和子代间保持了遗传性状的稳定性，对生物的遗传具重要意义。 4、（理解）“观察细胞的有丝分裂：目的要求、材料用具、方法步骤、实验现象和结果、讨论 5、（理解）“制作并观察植物细胞有丝分裂的临时装片”：目的要求、材料用具、方法步骤、实验现象和结果、讨论(见课本) 6、（理解）细胞分化的概念和生物学意义 特点：分化是一种持久的、稳定的渐变过程。 细胞分化的意义：一般多细胞生物体的发育起点是一个细胞（受精卵），细胞的分裂只能繁殖出许多相同的细胞，只有经过细胞分化才能形成胚胎、幼体，并发育成成体，细胞分化是生物个体发育的基础。细胞分化使多细胞生物体中的细胞趋向专门化，有利于提高各种生理功能的效率。 细胞分化的实例：如根尖的分生区细胞不断分裂、分化，形成成熟区的输导组织细胞、薄壁组织细胞、根毛细胞等；胚珠发育成种子，子房发育成果实；受精卵发育成蝌蚪，再发育成青蛙；骨髓造血；皮肤再生等都包涵着细胞的分化。 细胞分化过程：细胞通过有丝分裂数量越来越多，这些细胞又逐渐向不同个方向变化 定义：在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态，结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。 实质：基因选择性表达的结果 7、（了解）癌细胞的主要特征 （1）能够无限增殖。（2）癌细胞的形态结构发生了变化。（3）癌细胞的表面也发生了变化。癌细胞表面的糖蛋白减少, 细胞彼此之间黏着性减小，导致在有机体内容易分散和转移。8、（理解）细胞发生癌变的原因 （1）内因：人体细胞内有原癌基因和抑癌基因 （2）外因：①物理致癌因子；②化学致癌因子；③病毒致癌因子。 恶性肿瘤的防治：远离致癌因子。做到早发现早治疗 9、（理解）细胞的全能性 （1）概念：已经分化的细胞仍然具有发育成完整个体的潜能 （2）体细胞具有全能性的原因 由于体细胞一般是通过有丝分裂增殖而来的，一般已分化的细胞都有一整套和受精卵相同的DNA分子，因此，分化的细胞具有发育成完整新个体的潜能。 （3）全能性大小：受精卵>生殖细胞>体细胞 （4）植物细胞全能性高度分化的植物细胞仍然具有全能性。
乳腺癌细胞培养
MCF-7是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可，10- 15%的小 牛血清就能长得很好。一般两到三天传一代。传代也很常规。吸出培养基，加入0.25%的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除残余的培养基。再加入2ml胰酶(25ml 培养瓶)静置消化2—5min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。 MDA-MB-231人乳腺癌细胞 细胞中文名称人乳腺癌细胞 细胞英文名称MDA-MB-231 物种人 细胞形态特征上皮样 细胞生长特性贴壁生长 细胞特种特性MDA-MB-231是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该 细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-a受体和WNT7BS基因 培养基L15: Leibovitz Medium 血清10%FBS 细胞传代方法1:2~1:4 传代；每周2~3次 细胞传代情况C5 细胞冻存条件MDA-MB-231人乳腺癌细胞基础培养基+5%DMSO+20%FBS 支原体检测阴性 说明 培养基：DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10% 培养条件：37 C 5% CO2 消化条件：0.25% (w/v) Trypsin-0.53mM EDTA 溶液，消化5-10min 传代的比例：1 : 2~1: 4 换液时间：2~3天换液一次 冻存液比例：85%培养基，10%FBS, 5% (v/v) DMSO 冻存密度：1-2 X 10 6/管，液氮保存 MDA-MB-231人乳腺癌细胞复苏方法：取出冻存管后，投入37 C水浴中，震荡解冻2 min , 酒精消毒管壁外侧后，将其转入超净台中，将管内细胞转移至离心管中，加入 5 ml 37 C预热的培养基，并清洗冻存管一次，将离心管离心( 1000 rpm , 5 min),弃去上清液，再加入 2 ml培养■基，转入培养瓶中培养。 产品名称：人正常乳腺细胞Hs 578Bst 规格：70%密度的25cm2培养瓶的细胞一瓶 特点：细胞代数为4-5代左右 包装：内层无菌自封袋；专用防压泡沫盒；外层防压保温气泡袋；说明书 细胞来源：ATCC、sciencell、ICLC
肿瘤细胞凋亡的关系
第10卷 第1期中 华 男 科 学 Vol.10 No.1 2004年1月 National Journal of Andrology Jan.2004 ?论著? survivin 蛋白在前列腺癌中的表达及其与 肿瘤细胞凋亡的关系 高吴阳1,胡传义1,易慕华2 (三峡大学仁和医院,1.泌尿外科,2.病理科,湖北宜昌443001) 摘要: 目的:探讨新的凋亡基因survivin 蛋白在前列腺癌(PCa )的表达及其与肿瘤细胞凋亡的关系。 方法:采用免疫组化SP 法和DNA 原位未端标记T UNE L 法分别测定42例PCa 组织及10正常前列腺(NP )组织中survivin 蛋白的表达和细胞凋亡。 结果:survivin 蛋白在PCa 中的阳性表达为80.59%,与病理分级、临床分期和淋巴结转移密切相关(P <0.05),而NP 中无阳性表达;PCa 组织及NP 组织中细胞凋亡指数(AI )分别为3.03±1.33、1.07±0.77,其差异有显著意义(P <0.05);survivin 蛋白的表达与细胞AI 呈负相关(r =-0.679,P <0.001)。 结论:survivin 蛋白的异常表达而引起的细胞凋亡抑制,在PCa 的发生、发展中起一定的作用;联合检测survivin 蛋白和AI ,有助于对肿瘤细胞的分化程度作出正确评价,以指导临床治疗及估计预后。关键词:survivin 蛋白;凋亡;前列腺癌;免疫组化 中图分类号:Q255;R737.25 文献标识码:A 文章编号:100923591(2004)0120012203 Expression of survivin Protein in Prostatic Carcinoma Tissues and Its Correlation with Apoptosis of Cancer Cells G ao Wuyang ,Hu Chuanyi ,Y i Muhua Department o f Urology (Gao WY ,Hu CY ),Department o f Pathology (Yi MH ),Rehe Hospital ,Three Gorges Univer sity ,Yichang ,Hubei 430031,China Correspondence to :Gao Wuyang Abstract : Objective :T o investigate the expression of survivin protein in the tissues of prostatic carcinoma and its correlation with apoptosis of cancer cells. Methods :Expression of survivin protein and apoptosis index (AI )were detected by immunohistochemical and terminal de 2oxynucleotidyl transterase 2mediated dUTP biotin nich end labeling (T UNE L )technique in the tissues of 42cases of prostatic carcinima (PCa )and 10cases of normal prostate (NP ). Results :Survivin prosteins were expressed in 34of the 42(80.59%)cases of PCa.The positive rate of survivin was strongly ass ociated with pathological grades ,clinical stages and lymphmetastasis in PCa (P <0.05).In contrast ,NP did not express survivin.Survivin protein expressioin was negatively correlated with AI in PCa (r =-0.679,P <0.001). Conclusions :Apop 2tosis inhibition by survivin may participate in the onset and progression of PCa ,and the detection of survivin protein and AI in PCa may help to evaluate the degree of cell diferentiation ,decide therapeutic strategies and estimate prognosis. Natl J Androl ,2004,10(1):12214K ey w ords :survivin protein ;apoptosis ;prostatic carcinoma ;immunohistochemistry 前列腺癌(prostatic carcinoma ,PCa )是男性泌尿生殖系肿瘤中最重要的一种,其病因和发病机制尚 ?21?收稿日期:2003207215;修回日期:2003210208 作者简介:高吴阳(19622),男,湖北宜昌市人,副主任医师,本科,从事泌尿男科学专业。通讯作者:高吴阳
细胞凋亡与肿瘤
细胞凋亡与肿瘤 巴桑卓玛 (西藏大学医学院基础医学研究所) 摘 要 细胞凋亡是一种进化保守的细胞死亡形式,不仅在正常的生理状态具有重要作用,而且与多种疾病的发生发展密切相关。近年来研究认为,细胞凋亡异常可能与肿瘤发生有关。凋亡调控基因已被看作是一类新的肿瘤发生相关基因。肿瘤的发生,是由于细胞增殖与细胞凋亡之间的平衡失调的结果,细胞凋亡在肿瘤生长过程中起负调控作用,因此研究抑制多种肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡而对正常细胞影响不大是肿瘤治疗的新思路。 关键词 细胞凋亡 诱导 治疗 肿瘤 多细胞机体,包括人,均存在着细胞增殖与死亡的平衡,以维持机体的稳态,二者是一个矛盾的两个方面,此矛盾的运动发展推动着机体的生、老、病、死。传统的肿瘤研究者关注的首先是细胞的增殖。肿瘤细胞是永生性细胞,如何抑制肿瘤细胞的无限增殖能力,是他们首先考虑的问题。然而,机体还存在另一普遍现象,即死亡。细胞的死亡有两种形式,一种是病理性死亡,称为坏死(necrosis)。它是由于局部缺血、高热、理化因素及微生物的侵袭所致的细胞急速死亡。其重要的特点是细胞肿胀、溶解、释放出裂解产物,使周围组织产生炎症反应。另一种是生理性死亡———凋亡(apoptosis)。 1 细胞凋亡与一般的死亡有很大的不同,主要表现以下几个方面 形态学特征:细胞凋亡是细胞在生物体发育过程中,在一定诱导条件下接受指令而发生的程序化事件,是导致最终自我消亡的生命活动。发生时首先是染色质的凝集,嗜碱性染色增强,然后细胞核崩解,此时线粒体保持形态正常,最后细胞体积缩小,一部分细胞质和核碎片进入由膜包被的程序死亡小体,它们从细胞表面出芽脱落,并被组织专职巨噬细胞、上皮细胞吞噬。由于细胞内容物不泄漏,因而没有炎症反应。 生化特征:染色质降解,核小体间连接DNA部位被降解,产生寡聚核小体DNA 片段,即180-200bp整数倍的不同长度的DNA片断。 细胞凋亡的化学信号:在细胞程序死亡时出现快速持续的Ca2+浓度上升。如在胞质钙离子载体tributyrin和抗-CD3抗体诱导的胸腺细胞凋亡中就发现有钙离子浓度升高的现象。研究发现Ca2+增加与A TP一起作用于染色质,使原来折叠的很紧的染色质变松散,露出亲水部分,以便脱氧核糖核酸酶(Dnase)水解。Danson (1993)发现Ca2+可以参与Ca-calmokulin dependent phospatase作用,产生凋亡。Wornonicz提出Ca2+可以直接作用于核内转录因子引起凋亡。另外Ca2+还可活化
乳腺癌细胞培养
MCF-7 就是一种很好养的人乳腺癌细胞,培养基用DMEM或RPMI1640均可, 10－15％的小牛血清就能长得很好。一般两到三天传一代。传代也很常规。吸出培养基,加入0、25％的胰酶1ml,轻轻晃动培养瓶,使胰酶流遍瓶壁,以去除残余的培养基。再加入2ml胰酶(25ml培养瓶)静置消化2－5min,待细胞缩起变圆,将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。我一般都不用缓冲液冲洗,而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用,感觉效果还不错。因为MCF-7消化较快,一般不放到培养箱中消化,以免消化太过。需要注意的就是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起,一般都来不及抢救。 MDA-MB-231人乳腺癌细胞 细胞中文名称人乳腺癌细胞 细胞英文名称 MDA-MB-231 物种人 细胞形态特征上皮样 细胞生长特性贴壁生长 细胞特种特性 MDA-MB-231就是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-α受体与WNT7B癌基因 培养基 L15: Leibovitz Medium 血清 10%FBS 细胞传代方法 1:2~1:4传代;每周2~3次 细胞传代情况 C5 细胞冻存条件MDA-MB-231 人乳腺癌细胞基础培养基+5%DMSO+20%FBS 支原体检测阴性 说明 培养基:DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10% 培养条件:37℃ 5% CO2 消化条件:0、25% (w/v) Trypsin-0、53mM EDTA溶液,消化5-10min 传代的比例:1:2~1:4 换液时间:2~3天换液一次 冻存液比例:85%培养基,10%FBS, 5% (v/v) DMSO 冻存密度:1-2 ×10 6/管,液氮保存 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞复苏方法:取出冻存管后,投入37 ℃水浴中,震荡解冻2 min,酒精消毒管壁外侧后,将其转入超净台中,将管内细胞转移至离心管中,加入5 ml 37 ℃预热的培养基,并清洗冻存管一次,将离心管离心(1000 rpm,5 min),弃去上清液,再加入2 ml培养基,转入培养瓶中培养。 产品名称:人正常乳腺细胞 Hs 578Bst 规格:70%密度的25cm2培养瓶的细胞一瓶 特点:细胞代数为4-5代左右 包装:内层无菌自封袋;专用防压泡沫盒;外层防压保温气泡袋;说明书 细胞来源:ATCC、sciencell、ICLC
抗肿瘤药物对细胞增殖及凋亡的影响
抗肿瘤药物对细胞增殖及凋亡的影响 【摘要】 本实验室自主创新实验。本实验主要有药物对细胞对细胞增长速率的影响，药物对细胞周期时相分布及细胞凋亡的影响和细胞凋亡的形态学观察等三个内容。通过本次实验我们了解了细胞生物学研究的基本思路和理解设计实验的基本原则的同时通过实际操作，理解了细胞增值与凋亡在有机体正常生命活动中的作用及意义，掌握细胞增值与凋亡分析的基本方法。 一、药物对细胞对细胞增长速率的影响 【实验原理】 1.细胞生长曲线：一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过潜伏期进入指数生长期。在细胞到达包和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。典型的生长曲线可分为潜伏期，指数增长期，稳定期和衰退期。以存活细胞数对培养时间作图，及得生长曲线，生长曲线常用与测定药物等外来因素对细胞生长的影响。 2.利用MTT比色法测定药物等外来因素对细胞生长的影响： 黄色的MTT能被活细胞线粒体脱氢酶还原成不溶鱼水的蓝紫色产物——formazan,后者被溶解所呈现的色度反映出活生活细胞的代谢水瓶，死亡细胞则没有脱氢酶活性。Formazan产生的量与活细胞数成正比。 【实验步骤】 1.溶液的配制： ①MTT母液 ②裂解液 ③药物与对照组：A（对照），B，C，D 实验步骤： 2.细胞制备： 取对数生长期的细胞，用胰酶消化计数，配制悬液浓度为2.5~3×10 个/ml。
3.细胞的接种（96孔板）： 设定调零组，对照组，假药组（8个平衡孔），每孔加入200ul细胞悬液。 4.加药处理：细胞贴壁后，弃培养基，换等体积的药液。 5.对细胞生长情况进行测定： ①配制MTT使用液：无血清的5ml培养基中加入600ulMTT母液避光混匀。②待测细胞孔，弃去培养基，每孔加100ulMTT使用液。没有细胞的孔同样重复上述操作，作为调零孔，继续培养。 6.第二天，每孔加入100ul裂解液，调零孔中也加 7.下午取出孔板，用移液器充分混匀，每孔取出150ul样品，转移到检测板中。用考热的针头挑破孔中的气泡，用酶标仪读取OD值。 8.计算每种药物的生长抑制率（细胞生长抑制率=（1—药物组OD值/细胞对照组OD值）×100%） 二、药物对细胞周期时相分布及细胞凋亡的影响 【实验原理】 流式细胞仪(Flow Cytometer):是集激 光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、细胞荧光化学技术以及单克隆抗体技术为一体的高科技细胞分析仪。流式细胞术(Flow Cytometry，FCM):利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞或亚细胞结构进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。 2.PI荧光探针的特性： PI（碘化丙啶）为定量细胞化学的荧光染料，能插入双链DNA和RNA的碱基对之间，每隔5个碱基插入一个PI分子。如样品经RNA酶消化后，样品中的