酶联免疫吸附法检测梅毒抗体试验灰区结果分析

酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理

酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体；②酶标记的抗原或抗体；③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 （一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时问，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量成正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固医学教丨育网整理相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 （二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步法不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再医学教丨育网整理形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。

酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附测定法（ELISA） 1.定义 (2) 2.原理 (2) 2.1抗原抗体反应 (2) 2.2免疫测定在临床检验中的应用 (4) 3.ELISA的类型 (4) 3.1双抗体夹心法测抗原： (5) 3.2双抗原夹心法测抗体 (5) 3.3间接法测抗体 (5) 3.4竞争法测抗体 (6) 3.5竞争性测抗原 (6) 3.6捕获包被法测抗体 (6) 3.7ABS-ELISA法 (7) 4.ELISA试剂的组成 (8) 4.1固相载体： (8) 4.2包被的方式 (8) 4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。 (9) 4.4包被的条件： (9) 4.5洗涤液： (9) 4.7酶的催化性； (10) 4.8结合物的制备 (10) 4.9结合物的保存 (11) 4.10酶的底物 (11) 4.11酶反应终止液 (11) 4.12参考标准品 (12) 4.13加样： (12) 4.14保温 (12)

4.15保温方式： (12) 4.16室温温育的反应 (12) 4.17洗涤 (13) 4.18显色 (13) 4.19比色 (13) 4.20酶标比色仪 (14) 4.21结果判定 (14) 4.22定量测定 (15) 4.23ELISA的操作要点 (15)

1.定义 酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。 2.原理 采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。 2.1抗原抗体反应 2.1.1可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为： Ag+Ab→Ag·Ab 抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原和抗体均能保持原有的结构和活性。 2.1.2特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。因此，在很多时候，测定某一特定的物质不需分离待测物。2.1.3最适比例 只有当抗原抗体的浓度比例是当时，才出现可见反应。 以沉淀反应为例（Ab量固定，Ag量递增）

酶联免疫吸附试验

实验三酶联免疫吸附试验（ELISA） 一、实验目的 了解ELISA的基本原理，掌握间接ELISA方法的原理与操作步骤。 二、实验原理 将抗原或抗体固化于某种载体的表面，并保持其免疫活性，加入待检血清（抗体），然后加入与其相对应的既有酶活性又有免疫活性的酶标抗体或抗原，它们之间反应后，通过洗涤去掉未结合的标记物。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，酶的降解底物和呈现的色泽在一定条件下是呈正比的，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析，因此可用分光光度计进行测定，计算出参加反应的抗原或抗体的含量，从而达到测定抗原或抗体的目的。 常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色 辣根过氧化物酶（HRP） RZ>3.1 碱性磷酸酶（AP） 邻苯二胺（OPD） 四甲基联苯胺（TMB） 对硝基苯磷酸酯（p-NPP） 橙黄色 蓝色 黄色 棕黄色 黄色 黄色 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。常用的三种类型： 1、间接法测抗体（间接ELISA）

间接法用于测定抗体。它的原理是将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。 2、双抗体夹心法（双抗夹心ELISA） 双抗体夹心法用于检测抗原。它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。操作：将抗体吸附于固相表面；加抗原，形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物。底物的降解量＝抗原量。 3、竞争ELISA 竞争法既可用于检测抗原又可用于检测抗体。它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。 三、主要仪器及试材 以伪狂犬全病毒（PRV）间接酶联免疫吸附试验（PRV－ELISA）为例。 使用猪伪狂犬抗体检测试剂盒。本试剂盒含: 1、包被抗原的微孔板； 2、阴、阳性对照血清； 3、抗猪IgG-HRP结合物； 4、洗涤液； 5、底物A液、B液； 6、终止液； 7、样品稀释液 本实验所需仪器和试剂： 1、酶联免疫测定仪 2、已包被抗原（Ag）的酶标板（PRV蛋白） 3、血清：PRV阳性血清、PRV阴性血清、待检样品血清 4、酶标抗体（E-Ab）：兔抗猪IgG-HRP 5、包被液（0.025mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液）： 1.59g NaCO 3，2.93g NaHCO 3 ，加 ddH 2 O至1000mL 6、洗涤液（0.05% Tween-20的PBS（pH7.4））： 8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na 2HPO 4 ·12H 2 O，0.2g KH 2 PO 4 ，0.5mL吐温-20（Tween-20），加ddH 2 O至1000mL。 7、保温液（含0.1% BSA 的洗涤液）：0.1g 牛血清白蛋白（BSA），洗涤液100mL

影响酶联免疫吸附试验检测结果的原因分析及应对措施

影响酶联免疫吸附试验检测结果的原因分析及应对措施 酶联免疫（EliSA）是检验科目前常用的免疫学检测方法之一，其操作方便、简单，不须要特殊设备，使其在各级医院都可应用。但如果忽视了影响其结果的因素，难免会造成假阴性或假阳性的结果。因此了解影响结果的因素，是减少差错事故发生很必要的。 1实验室操作人员的基本素质因素 实验室人员的素质主要包括五个方面：思想素质、文化素质、技术素质、心理素质、身体素质。因为我们是为人服务的，所以我们的职业道德水平直接关系到人们的生命健康和生命安全。如果在工作中出现了张冠李戴，就有可能造成严重后果。其次文化素质和技术素质很重要，我们必须熟练掌握本专业的基本理论和操作技术。还要不断努力学习新的理论知识，努力提高业务水平。有良好的心理素质勇于面对工作中的挫折，在繁忙工作中有条不紊。所以人员素质问题对检验结果有重要的影响因素。 2标本处理因素 实验室人员收到标本后应：“三查七对”，对不符合要求的标本和申请单拒收，合格标本及时分离血清，避免溶血。提取血清时不能混有大量纤维蛋白或细胞成分，对不能及时检测的标本要妥善保存于4℃冰箱，做好原始记录。从冰箱取出的标本要预温至室温，对冰冻的样品要融化好，充分混匀再用。 3操作过程的影响因素 3.1 操作前应对实验的物理参数有充分的了解，如环境温度（保持在18～25℃），反应孵育温度和孵育时间、洗涤的次数等，各种条件必须符合要求。 3.2 正确使用加样器，加样器应垂直加入标本或试剂，避免摩擦包被板底部。加样过程中避免液体外溅，血清残留在反应孔壁上，加样器吸头要一次性使用，加样次序要与说明书一致，否则易发生错误，造成实验重复性差。 3.3 手工洗板加洗液时冲击力不能太大，洗涤次数不超过说明推荐的次数，洗涤液在反应孔内滞留的时间不宜太长。不要让洗液造成孔间污染，导致假阴性和假阳性。 3.4 要保证加液量一致，我们在使用时感觉加样器比滴瓶加样准确，滴瓶加液量不准造成显色不一，造成判断错误。 3.5 显色液的量不可过多，加样的工作环境不能阳光直射，加显色液后避光反应，显色液量要合适。 4试剂的影响因素 应选用有国家批准文号，质量保证的产品。试剂要妥善保存于4℃冰箱内，在使用时先恢复至室温，不同批号的试剂组分不宜交叉使用。试剂打开后要在一周内用完，剩余试剂下次用时先检查是否变质，显色剂如被污染变化将造成全部显色，导致错误结果。过期试剂不宜，应做好双份质控品的监测，确保结果的可靠性。 5采取措施，避免差错事故的发生 创造一个良好的工作环境，实验室工作人员应团结友爱，互相关心，互相学习自然心情舒畅，工作情绪高涨。再就是建立完善的质量保证体系，以书面的形式发给每位成员以及临床科室，做到人人熟悉，人人重视影响实验结果的因素，并在操作过程中时刻注意，将质控贯穿到整个实验过程中。制定一系列的制度，用制度管人，明确责任，这样才能提高质量，避免错误结果的发生。

酶联免疫吸附试验(ELISA)注意事项

龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/5f8054593.html, 酶联免疫吸附试验（ELISA）注意事项 作者：任小龑 来源：《新校园·上旬刊》2015年第07期 摘要：本文主要探讨了酶联免疫吸附试验（ELISA）中常见的影响因素，对学生实验中常出现的问题进行原因分析，并总结解决办法。ELISA试验操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，有可能导致显色不全、假阴性或假阳性结果。 关键词：酶联免疫;吸附试验;满版 实验室常用固相酶免疫测定方法在1971年最初建立，称为酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunsorbent assay），简称ELISA。原理为抗原抗体特异性结合和抗原抗体的酶标记，以酶催化底物显色来判断结果。 影响酶联免疫测定的因素较多，如标本的采集保存、试剂的准备、加样的技术、温度的 控制、洗涤反应板的方式、显色反应时间的控制等，均可能对试验结果产生很大影响。只有避免这些因素，才能保证试验结果的准确性和可靠性。 一、移液枪的使用 我院免疫实验室常用手动单道移液器。注意事项：（1）吸样前要保证枪头和液体处于相同温度;（2）若容量瓶中的液体太少，可倒入ep管中，方便吸取;（3）严格精确调节方法;（4）安装枪头要垂直插入，左右轻微转动上紧，上下敲击会引起内部的零部件因瞬间强烈撞击而松散;（5）垂直吸液，枪头吸嘴尖端需浸入液面2～4mm以下，一般液体，正向吸液1～2档，粘稠液可反向吸液2～1档，缓慢吸取，控制好弹簧的伸缩速度，太快会产生反冲和气泡，吸取后将移液枪提离液面，停顿1秒钟，观察是否有液滴流出，若有流出，说明有漏气现象;（6）放液时将吸嘴贴到容器内壁并保持10～400倾斜，平稳把按钮压到1档，停约一秒钟到2档，排出剩余液体。 吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，不能突然松开，以防溶液吸入过快而冲入枪体 内腐蚀柱塞造成漏气。 移液枪应轻拿轻放，不能将已吸有液体的移液枪平放或倒置。 不要将按钮旋转出量程，否则会卡住内部机修装置而损坏;长时间不用时建议将刻度调至最大量程，让弹簧恢复原形，可延长使用寿命;定期对移液枪校准。 二、加样

酶联免疫吸附实验ELISA操作规则(新手适用)资料

酶联免疫吸附实验ELISA －－操作规则（新手适用） 一、实验目的 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原)，再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。 二、实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。 辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A(1cm 403nm 1%)＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP纯度(RZ)=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的

白介素与酶联免疫吸附法

细胞因子 白细胞介素 ---多能的细胞因子 一、细胞因子及分类 细胞因子：是由细胞分泌的具有介导和调节免疫、炎症和造血过程的小分子蛋白物质。 分类：白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、生长因子、趋化因子二、白细胞介素（interleukin ,IL） 在1979年第二届国际淋巴因子专题讨论会上，将来自单核-巨噬细胞、T淋巴细胞所分泌的某些非特异性发挥免疫调节和在炎症反应中起作用的因子称为白细胞介素（interleukin，IL）。并以阿拉伯数字排列，如IL-1、IL-2、IL-3。许多IL不仅介导白细胞相互作用，还参与其它细胞的相互作用，如造血干细胞、血管内皮细胞、纤维母细胞、神经细胞、成骨和破骨细胞等的相互作用。 白细胞介素，简称白介素，是指在白细胞或免疫细胞间相互作用的淋巴因子。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。 （一）IL-1(又称淋巴细胞刺激因子) 1、细胞来源： IL-1 主要是由活化的单核和（或）巨噬细胞合成与分泌，另外有树突细胞、郎格罕氏细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞等，是最具多效性的细胞因子之一，几乎对所有体内细胞产生作用[1]。 2、存在形式： 白介素1(IL-1)族由两种促效剂(IL-1a 和IL-1β)和一种拮杭剂(IL-1受体桔杭剂)组成[2]。其中IL-1α 主要存在于细胞内，IL-1β 主要存在于体液中，故IL-1 的生物学作用主要由IL-1β介导 3、主要生物学功能： IL-1在体内的靶细胞范围也很广泛，不仅有淋巴细胞，还有嗜中性粒细胞、成纤维细胞以及肝、胰、骨、软骨等器官的细胞，这一特点也是其生物学作用广泛的原因。其主要生物学作用有：（1）介导炎性反应。IL-l 除自身能引起炎性反应外，还可诱导其他炎性细胞因子如IL-6、IL-8、趋化因子、黏附分子和组织重建酶等合成，进而加重炎性反应，另外，IL-1还能诱导COX 基因转录，引起前列腺素分泌增加，介导炎性反应。（2）免疫调节作用。（3）诱导急性时相蛋白，参与急性期反应。（4）参与恶液质的形成，致负氮平衡效应。（5）诱导成纤维细胞增殖 4、相关疾病： （1）眼底病变 （1）糖尿病视网膜病变（2）增殖性玻璃体视网膜病变（3）不伴有PVR的单纯性视网膜脱离（4）视网膜退行性病变 （2）肥胖与2型糖尿病联系的主要原因 白介素-1β是机体的重要细胞因子，白介素-1β可通过促进胰岛β细胞的一氧化氮生成和细胞凋亡而引起β细胞选择性的破坏,诱导胰岛素抵抗[3]。

酶联免疫吸附实验

ELISA酶联免疫吸附试验在动物生产过程中的 应用 简介 随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，大大提高了ELISA的特异性，由于电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面，ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。 基本原理 ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

特性 用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。如今应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。 辣根过氧化物酶 过氧化物酶（HRP）广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%），分子量约40 000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH 3-9，催化反应的最适pH 值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm和403nm。 酶的纯度以RZ表示：RZ=OD403/OD275 纯酶的RZ多在3.0以上，最高为3.4。RZ在0.6以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占 75%，不能用于标记。RZ在2.5以上者方可用于标记。HRP的作用底物为过氧化氢，催化反应时的供氢体有几种：⑴邻苯二胺（OPD），产物为橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼观察判别，容易被浓硫酸终止反应，颜色可在数小时内不改变,是目前国内ELISA中最常用的一种；⑵联大茴香胺（OD），产物为橘黄色，最大吸收值在400nm，颜色较稳定；⑶5－氨基水杨酸(5－AS）：产物为深棕色，最大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性较差；⑷邻联甲苯胺（OT）产物为蓝色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不稳定，不耐酸，

ELISA(酶联免疫吸附测定)实验报告

ELISA Lin Chengyu Bio 04 2010030007 Experiment Date: 2012-03-12 Submitting Date: 2012-03-21 1Introduction 1.1Background information ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) is a solid-phase assay for antibodies employing ligands labeled with enzymes which is widely used for immunological assays. This technique can be applied to detect antigens or antibodies for qualitative or quantitative purpose. Since enzyme reactions are very well known amplification processes, the signal is generated by enzymes which are linked to the detection reagents in fixed proportions to allow accurate quantification.1 1.2Major principles Figure 1 Schematic diagram of ELISA2 Figure 2 Procedure of indirect ELISA3

elisa酶联免疫吸附实验报告材料

elisa酶联免疫吸附实验报告 一．实验目的 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。 二．实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。

辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。 ELISA的基本原理有三条： （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为

酶联免疫吸附试验竞争法检测HBeAg的探讨

万方数据

万方数据

酶联免疫吸附试验竞争法检测HBeAg的探讨 作者：李熙梁 作者单位：云南省大理州第二人民医院检验科,671000 刊名： 检验医学与临床 英文刊名：LABORATORY MEDICINE AND CLINIC 年，卷(期)：2011,08(3) 参考文献(1条) 1.梁宝铎;曾真;赵祥胜乙型肝炎血清学标志间非特异性交叉反应的研究 1995(03) 本文读者也读过(10条) 1.王燕萍.詹峰加样方式对竞争法ELISA的影响及其对策[期刊论文]-现代中西医结合杂志2011,20(4) 2.王建华.唐勇.向军俭.王宏.杨红宇.凌钦婕镉离子多克隆抗体ELISA竞争法的初步建立[期刊论文]-中国生物制品学杂志2008,21(1) 3.李长贵.周铁群.王剑锋.邱平应用ELISA竞争法检测疫苗制品中残余的牛血清白蛋白[期刊论文]-中国生物制品学杂志2002,15(2) 4.成军.孙长责.成玉生.王国政.詹峰不同加样方式对竞争ELISA法检测抗HBc的影响[期刊论文]-临床检验杂志2008,26(3) 5.万善霞.徐修远.王建立.张淑萍间接竞争ELISA检测兔肉中氯霉素残留方法的确定[期刊论文]-动物科学与动物医学2004,21(7) 6.杜华.谢闻悦.贺柳杨.赵田.Du Hua.Xie Wen-yue.He Liu-yang.Zhao Tian引起HBV e系统双阳模式的另一种机制[期刊论文]-中国卫生检验杂志2008,18(12) 7.邢冬红.潘菊芬.黄焕军.缪慧单抗ELISA竞争法在测定激素中的应用研究[期刊论文]-天津医科大学学报2001,7(2) 8.陈先国.支海兵.滕颖牛瘟诊断技术规程中竞争法酶联免疫吸附试验的复核试验[期刊论文]-中国兽医杂志2007,43(6) 9.曹红.张国元.魏锦.马春蓉.臧泽林急性白血病患者血清新喋呤的变化及临床意义[期刊论文]-川北医学院学报2004,19(2) 10.唐中.张国元.郭晓兰.凡瞿明.周彤.邓仁兵乙型肝炎病毒前S1抗原与乙肝两对半定量检测的对比分析及意义[期刊论文]-四川医学2004,25(2) 本文链接：https://www.360docs.net/doc/5f8054593.html,/Periodical_jyyxylc201103049.aspx

实验六 酶联免疫吸附测定法

实验六酶联免疫吸附测定法 摘要：酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术 (immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，具有操作简便、灵敏性高等优点，是生物化学等领域检验的常规测定方法。本实验采用ELISA间接竞争法对牛奶中鼠抗氯霉素（CAP）进行了检测和分析。 关键词：酶联免疫吸附测定鼠抗氯霉素检测 60 年代初期，Averameas 及Ram 等在不破坏酶的催化活性及免疫球蛋白的免疫活性或 蛋白质结构的前提下，利用特殊的交联剂将辣根过氧化物酶（HRP）与人血清白蛋白（HSA）连接在一起，后来又用酸性磷酸酯酶（AP）与抗体（Ab）结合，这些结合物统称为酶标记 物或酶结合物，被用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定，从此建立了免疫酶技术。1971 年瑞典的Engvall 和荷兰的Van Weeman 等人使抗体与溴化氰激活的纤维素结合或使抗体吸附于聚苯乙烯试管上制成固相免疫吸附剂（固相载体），再与免疫酶技术结合，建立了酶联免疫吸附测定法，用于检测抗体或抗原。1974 年Voller 等用聚苯乙烯微量反应板作为吸附载体吸附抗体（抗原），再与相应的酶标记物结合，使ELIS A 操作更方便，易重复，灵敏度可高达ng （10-9g）至pg（10-12g），并且所需仪器设备简单，因而成为生物化学，临床医学检验的常规测定方法之一，原则上ELISA 可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。在实际应用方面可作疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断鉴定等。因此，它和生物化学、免疫学、微生物学、药理学、流行病学及传染病学等方面密切相关。ELISA 过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原)，再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。ELISA 常用的测定方法主要有直接法和间接法两种：直接法是酶标记抗体与待检测样本中固相抗原直接作用，加入底物后，显色(其颜色深浅与样本中抗原量成正比)；间接法是使已知抗原吸附在固相载体上，与待检测样本中的抗体作用，再加入酶标记抗同种动物抗体的免疫球蛋白(二抗)，使与特异抗原抗体复合物中的抗体作用，加入酶底物，显色(颜色深浅与样本中抗体量成正比)。ELISA 有许多改良方法, 如夹心法( sandwich ELISA) 、双抗体夹心法( double-antibody sandwich technique) 、竞争法、酶- 抗酶法和均质法(homogeneousELISA) 、生物素- 亲和素放大系统(biotina-vidin system, BAS) ELISA 及斑点- ELISA ( dot-ELISA)等。常用方法大致可分为三类：(a) 测定抗体的间接法；(b)测定抗原的双抗体夹心法；(c) 测定抗原的竞争法。前两种方法主要用于测定抗体和大分子抗原，适用于临床诊断上，而竞争法是测定小分子抗原的方法，因而尤其适用于食品分析。竞争酶联免疫吸附分析法又可分为直接竞争法和间接竞争法。直接竞争法主要有三步：抗体吸附于固相载体，温育后清洗→加入含有抗原的待测液及酶标记的抗原，温育后清洗→加入酶底物温育后显色，判断结果。间接竞争法主要有四步：抗原吸附于固体载体，温育后清洗→加入含有抗原的待测液和抗体，温育后清洗→加入酶标记抗体，温育后清洗→加入酶底物温育后显色，判断结果。 影响ELISA 测定结果的因素主要包括以下几点： (1) 抗原：在ELISA 中，包被于固相载体表面的抗原或抗体的来源和制备方法对试验结

(完整word版)酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附测定法(ELISA) 1.定义 (3) 2.原理 (3) 2.1抗原抗体反应 (3) 2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5) 3.ELISA 的类型. (5) 3.1双抗体夹心法测抗原： (6) 3.2双抗原夹心法测抗体 (6) 3.3间接法测抗体 (6) 3.4竞争法测抗体 (7) 3.5竞争性测抗原 (7) 3.6捕获包被法测抗体 (7) 3.7ABS-ELISA 法 (8) 4?ELISA试剂的组成 (9) 4.1固相载体： (9) 4.2包被的方式 (9) 4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原 (10) 4.4包被的条件, (10) 4.5洗涤液： (10) 4.7爾的催化性； (11) 4.8结合物的制备 (11) 4.9结合物的保存 (12) 4.10酶的底物 (12) 4.11酶反应终止液 (12) 4.12参考标准品 (13) 4.13加样： (13) 4.14保温 (13)

4.15保温方式： (13) 4.16室温温育的反应 (13) 4.17洗涤 (14) 4.18显色 (14) 4.19比色 (14) 4.20酶标比色仪 (15) 4.21结果判定 (15) 4.22定量测定 (16) 4.23ELISA的操作要点 (16)

1.定义 酶联免疫吸附测定法(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay),简称ELISA,采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶打底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。 2.原理 采用抗原勺抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。 2.1抗原抗体反应 2.1.1 可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态半衡，其反应式为： Ag+Abf AgAb 抗体的亲和力(affinity),可以用平衡常数K表示：K=[Ag Ab] [Ag][Ab], Ag ? Ab的解离槿度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结介牢固，不易解离。解离后的抗原和抗体均能保持原有的结构和活性。 2.1.2特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。因此，在很参时候，测定某一特定的物质不需分离待测物。2.1.3 最适比例 只冇当抗原抗体的浓度比例是当时，才出现可见反应。 以沉淀反应为例(Ab最固定，Ag最递増)

酶联免疫吸附法和化学发光法对甲胎蛋白检测效果的比较

酶联免疫吸附法和化学发光法对甲胎蛋白检测效果的比较 发表时间：2013-08-02T11:09:06.187Z 来源：《中外健康文摘》2013年第25期供稿作者：刘雅萍王爱燕 [导读] CL较ELISA稳定性好、敏感性高、重复性好，而ELISA具有经济、在AFP浓度值低于400μg/L时也具有较好的敏感性。刘雅萍王爱燕 (山东潍坊市坊子区人民医院检验科 261200) 【摘要】目的比较ELISA (enzyme linked immuno-sorbent assay)和CL(chemi-luminescence)两种检测方法对AFP检测的稳定性、敏感性及重复性。方法2012年5月以来，我院对120名患者同时采用酶联免疫法以及化学发光法进行AFP检测，分析两种方法对AFP的敏感性、稳定性以及重复性。结果化学发光法具有较好的重复性以及稳定性，当AFP<400μg/L时，ELISA和CL法检测AFP敏感性相似，当AFP>400μg/L时，CL法敏感性高于ELISA（P<0.05）。结论CL较ELISA稳定性好、敏感性高、重复性好，而ELISA具有经济、在AFP浓度值低于400μg/L时也具有较好的敏感性。 【关键词】甲胎蛋白酶联免疫吸附法化学发光法 肿瘤标志物(Tumor Marker)是反映肿瘤存在的化学类物质。它们或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织，或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量，它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。最常见的有甲胎蛋白（alpha fetal protein, AFP）和癌胚抗原（carcinoma antigen embryo，CEA）等，其中甲胎蛋白（AFP）被公认为是诊断原发性肝癌的重要肿瘤标志物[1]。甲胎蛋白(AFP)是胚胎发育早期的一种主要血清蛋白，由胚胎期肝脏卵黄囊合成的一种糖蛋白，分子量约70000，含糖40g/L，由96%蛋白质和4%的碳水化合物组成，正常人血清中AFP含量在2-8g/L之间，AFP正常值一般低于25g/L，AFP是诊断肝癌最特异的标志物，是目前最好的可实际用于早期诊断原发性肝癌的指标，可在症状出现之前作出诊断。 1 临床资料 1.1一般资料 2012年5月以来，我院对120名患者同时采用酶联免疫法以及化学发光法进行AFP检测，其中男80例，女40例，年龄45-75岁，平均年龄60岁。 1.2方法对同一患者的血清分别用ELISA和CL法进行AFP检测，每份标本每天检测1次，连续检测20天，比较ELISA和CL在AFP检测上的重复性和稳定性，同时比较ELISA和CL检测AFP的敏感性。 2 结果 2.1AFP敏感性测定：当AFP小于400ug/L时，酶联免疫法与化学发光法在检查数量上，差别不大，不具有统计学意义；当AFP大于400ug/L时，可见化学发光法测定的患者的数量明显高于酶联免疫法，P小于0.05,二者比较具有统计学意义。 2.2 重复性和稳定性测定：采用批内和批间差异进行确定。ELISA和CL两种检测方法分别对低、中、高值质控品进行精密度试验,每份标本连续测定20次，计算均数和标准差,求批内变异系数（coefficient variable，CV）值。每份标本每日测定1次，连续测定20 天，计算均数和标准差，求批间CV值。我们得到的结果CL较ELISA重复性好、稳定性高。 3 讨论 3.1酶联免疫法1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即:酶联免疫吸附法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) 。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫技术 (immunoenzymatic techniques) 的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 [2]。 3.2化学发光现象是一种常见的自然现象，利用化学发光测定化学发光反应反应物、催化剂、增敏剂、抑制剂，偶合反应中的反应物、催化剂、增敏剂的方法叫做化学发光法。化学发光是物质在化学反应过程中，其物质分子吸收化学能产生光的辐射现象。 3.3化学发光法优于酶联免疫法首先CL具有较好的稳定性：CL 是一种特异性化学发光反应,，是当今国内外最新最先进的临床免疫技术的集中体现，根据待测物的不同灵活选择不同的分析技术、分析步骤和分析过程，以达到最佳的检测效果、最高的检测精密度，结果准确可靠，因此具有较好的稳定性；其次CL具有较高的敏感性；最后CL具有较高的稳定性。 总之，化学发光法的应用实现了免疫测定的自动化，具有结果稳定可靠、敏感性高、重复性好的优点，显示出具有良好的应用前景，ELISA法具有快速、简便、成本低廉的优点,及在健康体检, 人群普查, 良性肝病患者定期检查中起到很好筛查作用。参考文献 [1] 林英,柳丽娟,林秀珍.荧光酶免定量测定甲胎蛋白的临床评价[J].国际检验医学杂志,2006,27（2）:182-184. [2] 卫生部临床检验中心和中国医院协会临床检验管理专业委员会、《医疗机构临床实验室管理办法》及配套文件.

ELISA酶联免疫吸附试验报告

大学实验报告酶联免疫吸附试验 学院： 专业： 姓名： 学号：

一．实验原理 酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种用酶标记抗原或抗体的方法，此法是将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的技术，可敏感地检测体液中微量的特异性抗原或抗体。基本原理如下：①先使用抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或酶标抗体，这种酶标抗原或酶标抗体即保留了其免疫活性，又保留了酶活性；③试验时，把受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原或酶标抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤法去除固相载体上的游离物质，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的多少有关。当加入酶反应的底物后，底物被酶催化而产生有色物质。颜色反应深浅与受检抗原或抗体的量成正比。因此，可借助颜色反应的深浅来定性、定量抗体或抗原。本技术的特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察。 图1 ELISA实验原理示意图 二．实验材料 BSA抗原、兔抗BSA抗体（一抗，分别用PBS稀释成1:2, 1:4, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256七个浓度）、酶标羊抗兔IgG（二抗）、0.05M PH9.6碳酸盐包被缓 冲液、洗涤液（PBS）、底物溶液、2mol/L H 2SO 4 。

三．实验方法 1.包被板的处理：加BSA（包被缓冲液稀释为10μg/ml）至酶标板中，每孔100μl，置湿盒中4℃过夜。第二天取出，用PBS洗涤3-4次。 2.取包被好的酶标板，在第一孔中加入100μl PBS作阴性对照，在第2-8孔加入上述稀释的一抗各100μl，置37℃保温1h。 3.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入二抗各100μl，置37℃保温30min。 4.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入底物溶液各100μl，在暗处37℃避光显 色20min，最后加入50μl、2M H 2SO 4 终止反应。 5.在波长490nm处，测定各孔的光密度吸收值。 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在检测仪上，于490nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 四．实验结果 表1 酶联免疫吸附OD值检测表 目测各孔颜色较浅;检测其OD值结果如上表所示，各孔OD值与阴性对照之比都小于2.1，全部为阴性。

酶联免疫吸附实验

酶联免疫吸附实验 一、实验目的 1、用间接竞争酶联免疫吸附实验（ELISA法）测定多抗血清(pAb)敏感性，从而 筛选出融合备用鼠融合前3～5d腹腔注射OTA的计量。 2、采用间接ELISA 法测定pAb效价，采用阻断ELISA法鉴定pAb敏感性，从 而筛选出效价高且IC50（赭曲霉毒素A（OTA）多抗血清对OTA的50%抑制浓度）低的小鼠做细胞融合备用鼠。 3、用间接ELISA 和间接竞争ELISA 筛选出效价高、敏感性好、细胞生长旺盛 的杂交瘤细胞株。 4、采用间接ELISA 法测定单克隆抗体效价，采用阻断ELISA法测定单克隆抗 体敏感性，采用间接ELISA 检测方法进行单克隆抗体同种型及亚类鉴定。 二、实验原理 ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 ELISA法根据种类和变化可分为以下几类：双抗体夹心法、间接法、竞争法、阻断法双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。 在本实验中应用了间接法、阻断法和竞争法，利用酶分子与小鼠血液中的抗体共价结合，在底物的作用下，产生颜色反应，通过颜色的深浅筛选出融合备用鼠融合前腹腔注射OTA的计量和效价高且IC50低的小鼠做细胞融合备用鼠。 三、实验试剂与器材 1、实验试剂 在本测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂） 在此实验中所采用的免疫吸附剂是1μg/mL OTA-OV A；标记物是1:1000 倍用含5% 猪血清的PBST 稀释的50μL/ 孔的GAM-IgG-HRP；显色剂是50μL/ 孔的T M B OTA、牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OV A)、小鼠单抗同种型检测试剂盒美国Sigma公司； 碳化二亚胺(EDC)英国Thermo Scientific 公司； 弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、基础培养基1640、选择培养基HAT、HT、PEG21500美国Invitrogen公司； 羊抗鼠酶标二抗(GAM-IgG-HRP)华美生物工程有限公司； 实验用水为重蒸去离子水