isolation of LPMC 小鼠肠粘膜固有层单个核细胞的分离和纯化
小鼠肠粘膜单个核细胞的分离和纯化
一．材料：
（一）试剂：
1×Phosphate-buffered saline (PBS)、1×HBSS、FBS、100 U/ ml青霉素, 100 U/ ml链霉素、细胞分离液（Percoll）
（二）器材：
剪刀、镊子、培养皿、40um和100um的细胞筛、15ml和50ml离心管、巴氏管（三）试剂配制：
1）预消化液--HBSS (Hanks Balanced Salt Solutions)：5mM EDTA (100*)和1mM DTT(2000*)。
2）消化液：将0.05 g collagenase D (Roche)、0.05 g DNase I (Sigma)和0.3 g dispase II (Roche)溶解于100ml 1*PBS中。临用临配，配制后37℃孵育几分钟。
3）FACS缓冲液：1*PBS+3% FBS (vol/vol)。
4）40% Percoll(vol/vol)(100mL)：42.01 ml Percoll分离液（Sigma，密度为1.124 g/ml）+57.99ml 1*PBS。
5）80% Percoll(vol/vol)(100mL)：79.83 ml Percoll分离液（密度为1.124 g/ml）+20.17 ml 1*PBS。
二．操作步骤：
（一）获取小鼠结肠组织：
1. 颈椎脱臼法处死小鼠，75%酒精消毒2min，然后转移至无菌工作台。
2. 仰卧位固定小鼠四肢，剪开腹部皮肤，分离肌肉，将肠管从肠系膜脂肪组织上剥离下来。
3. 将肠道组织放入预冷的1*PBS中，并切成4-5cm的节段。
4. 用镊子夹住肠管的一端，在另一端用吸满无菌1*PBS的注射器进行冲洗。并去除肠管上粘附的脂肪组织和Payer’s结。
（二）获取肠粘膜单个核细胞：
1. 将肠管纵行切开，并切成1cm左右的片段，在预冷的1*PBS中冲洗
2. 将肠道组织片段放入50ml离心管中，并加入5ml预消化液，孵育40g*37℃*20min。
3. 用100um的细胞筛过滤，再将剩余片段放入含有新的预消化液的50ml离心管，过滤掉的为含有上皮细胞的结肠成分（可以用来匀浆或者存储以分离上皮内淋巴细胞-350g, 5min, FACS buffer 洗1次）。
4. 再次孵育40g*37℃*20min。
5. 用100um的细胞筛过滤。用剪刀将剩余组织切成1mm的片段，用1*PBS洗去残留的EDTA。将组织收集入含有5ml消化液的50ml离心管中孵育40g*37℃*20min。
6. 孵育结束后，漩涡混匀器剧烈晃动20s，用40um细胞筛过滤后收集入50ml 离心管中。
7. 收集碎片放入装有5ml新鲜消化液的50ml离心管中。
注：只要细胞筛上可以看到结缔组织即重复Step6 和Step7 （一般需要2-3次）。最理想状态是所有组织都被消化成不可见的小片段。
8.将所有消化所得的溶液收集入50ml离心管中，离心500g*20℃*10min (=1200 r.p.m. Megafuge 1.0R )，弃上清。
9.用预冷的FCAS缓冲液重悬，离心500g*20℃*10min。
10. 弃上清，用10ml 40%的Percoll分离液重悬。
11. 用巴氏管仔细地沿倾斜管壁将细胞悬液加到含有5ml 80% Percoll分离液的15ml离心管中。
12. 将40/80 Percoll 梯度溶液离心，1000g*20℃*20min。离心后即可见LPMC在两层Percoll液的界面上形成一个白色的环。夹杂的红细胞会出现的界面的下方。顶层是上皮细胞，底层是颗粒碎片和死细胞。
13. 用吸管小心的将细胞收集入新的15ml离心管中，并加1mlPBS。
14. 离心500g*20℃*10min。
15. 用FCAS缓冲液立即重悬，计数细胞，台盼蓝测活力，细胞活力95%以上继续。
三.后续处理：
细胞可以用来培养以获得含有细胞因子的上清或者采用FCM鉴定细胞抗原。
细胞还可以用来做增殖实验，分离mRNA用来做PCR，或者分离蛋白用来做WB。LP T细胞可以进一步通过使用结合CD4抗体的磁珠进一步分离。
注：
1.分离越快，细胞状态越好。
2.大约可收集0.5-3*10^6个细胞；若结肠炎可收集1-7*10^6个细胞。
参考文献：
Weigmann B, Tubbe I, Seidel D, Nicolaev A, Becker C, Neurath MF. Nat Protoc. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonictissue. 2007;2(10):2307-11.
衰老代谢与肠道
衰老，代谢与肠道 自从2009年Hans Clevers 实验室发明肠道类器官以来，肠道的研究如同插上了翅膀，在各个领域的研究都取得了令人瞩目的进展。 如今肠道类器官在国内的应用，也是遍地开花，甚至有专门的热心肠研究会。近期大神Hans Clevers 写了一篇Comments综述了类器官在病毒和covid-19中的应用（插入链接）。 今天给大家介绍一篇关于《衰老，代谢与肠道》的综述。顾名思义，本文主要综述代谢和衰老如何控制肠道干细胞的功能和上皮细胞的稳态。近期以果蝇和mouse为模式生物取得新的见解，本文聚焦衰老过程中代谢信号是如何导致肠道干细胞失去干细胞的可塑性和上皮细胞稳态的，以及最终如何影响机体的复原能力和寿命。同时比较了果蝇和mouse 之间的异同点。 民以食为天，消化食物的主要器官就是肠和胃。肠道上皮不但是外界环境的一个动态的屏障，同时也整合了多种信号，包括代谢产物，共生微生物，免疫反应和衰老压力。肠道每天都接收多种多样的生理和病理的刺激信号，这些刺激信号包括代谢物，免疫系统和肠道细菌的交流信号。所有的这些刺激信号都会影响小肠的对环境或者机体挑战的反应。而衰老又对肠道的自我更新和保护功能提出了额外的挑战。后果包括肠道干细胞增殖和分化的适应，干细胞耗竭，细胞衰老，免疫和炎症反应和上皮屏障功能的加强。重要的是这些因素影响了上皮的稳态与肠道的屏障功能，这些因素的异常调控可以导致上皮屏障功能的缺陷和对整个机体的损害。
肠道稳态，代谢和衰老的基本概念 肠道的稳态 上皮的稳态依赖于肠道干细胞的自我更新和分化，细胞的脱落和凋亡。mouse的肠道细胞3-5天就会更新一遍，维持mouse这种高速增殖的是潘氏细胞分泌的Wnt配体，在果蝇中内脏肌肉产生类似的Wnt 配体wingless(wg)。果蝇和小鼠的肠道组织平衡基于肠道干细胞分裂时两个对称分裂的子代细胞的中立的竞争，在分化的过程中，Notch信号抑制分泌细胞促进肠细胞的分化。 肠道的代谢
肠造口及其周围并发症的处理
肠造口及其周围并发症 的处理 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998
肠造口及其周围并发症的处理 肠造口常见并发症： （一）出血 (Stomal bleeding):通常在术后72小时内发生。 临床症状：造口粘膜表面出血，造口与皮肤的边缘渗血；肠腔内出血。 原因： 1．手术时止血不足:术后早期大出血则可能是肠系膜小动脉未结扎或结扎线脱落； 2．造口与皮肤的边缘渗血多源于肠造口粘膜与皮肤连接处的毛细血管及小静脉； 3．病人凝血功能障碍（放疗或化疗后血小板过低）； 4．造口用品使用不当； 5．肠腔内出血：血或血块从肠腔内流出多见于消化道疾病（如应激性溃疡）。 护理措施： 1．查找出血原因； 2．密切观察：出血的量颜色等，并做好记录和交班； 3．止血：轻微出血用棉球或纱布加压即可；效果欠佳可用皮肤保护粉或藻酸钙敷料再进行按压；若出血较多较频，用1‰肾上腺素溶液浸湿的纱布加压，或云南白药粉外敷后用纱布加压。 4．检查血液凝血功能； 5．选择适当的造口用品；
6．大量渗血，则需入手术室治疗或输血； 7．肠腔内出血，报告医生治疗原发病。 （二）水肿（Stomal oedema） 临床症状：造口隆起，肿胀和绷紧，粘膜发亮。通常发生在术后早期。 原因：腹壁及皮肤开口过小，低蛋白血症。 护理措施： 1．轻微者暂不用处理； 2．严重者用3%高渗盐水湿敷或硫酸镁湿敷； 3．评估造口用品的使用技巧，大2-3mm,避免造口用品紧箍肿胀的造口而影响血液循环导致缺血坏死； 4．后期出现造口水肿，大多发生在癌症晚期病人出现低蛋白血症伴全身水肿； 5．使用大容量，一件式造口袋，底板柔软，注意裁剪技巧。 (三)缺血（ Ischaemic） 临床症状：最严重的早期并发症，往往发生在术后24~48小时 1．轻度造口缺血坏死：造口边缘暗红色或微呈黑色，范围不超过造口粘膜外1/3，尚未有分泌物增多和异常臭味，造口皮肤无改变； 2．中度造口缺血坏死：造口粘膜外中2／3呈紫黑色，有分泌物和异常臭味，但造口中央粘膜仍呈淡红色或红色，用力摩擦可见粘膜出血； 3．重度造口缺血坏死：造口粘膜全部呈漆黑色，有多量异常臭味的分泌物，摩擦粘膜未见出血点，为严重缺血坏死； 原因：
人外周血单核细胞分离技术
人外周血单核细胞分离 1.抗凝血的预离心分别取正常人新鲜抗凝全血 A: 20 mL于50 mL离心管中，以2 000 r /min 离心20 min，吸弃上层血浆，获得下层沉淀细胞约10?12.5 mL 。 2.沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀 A中的细胞中加入Hank s液（不含Ca2+、Mg 2+, pH 7.2 ?7.6）体积比仍未1:1 , 混匀，制成细胞悬液。 B:无菌抗凝血与Hank s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。 另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处 将细胞悬液小心而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。此时稀释后的细胞悬液 分离液淋巴细胞体积为：1:1。与用水平离心机以2000 r /min 离心20min，离心结束后，取出离心管，可见管中液体已经分层。 管内可见分为4层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄的白膜层，主要台 单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞 沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜 3.单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁 吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的 2 / 3。混匀后离心1500r/mi n 离心 10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。 注意：还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。第二种方法，比较简单一些。 再用同样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min 离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。再以RPMI-1640 培养基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。按每毫升血液标本加0.2 mL含20%小牛血清的Hank s液（或含10%胎牛血清及25 mmol /L hepas的RPMI-1640 液3?4 mL）重新混悬细胞37 C、5% C02孵育箱中培养2?3 h 后去除上清，得到贴壁的单核细胞。于各培瓶中分别加入含10%胎牛血清的RPMI-1640
4例造口皮肤粘膜分离的护理
3例肠造口皮肤粘膜分离的护理分析报告 肠造口手术是结、直肠肿瘤的主要治疗方法之一，可以是永久性的，也可以是临时的。国外肠造口并发症发生率为11.0%～60.0%,国内文献报告为 16.3%～53.8%,平均20.8%[1]。造口本身已使患者生活不便,再加上造口术的并发症,更会增加患者痛苦,其生活质量必然会受到影响。肠造口皮肤粘膜分离是肠造口术后并发症之一，指肠造口处肠粘膜与腹壁皮肤的缝合处发生分离。2009年2月至2010年10月我们治疗护理了3例造口皮肤粘膜分离的患者，现分析报告如下： 1 临床资料 1.1一般资料：2009年2月～2010年10月有3例肠造口皮肤粘膜分离的患者。年龄45～84岁，平均年龄66.7岁，均为女性。其中结肠癌2例，结肠癌伴肠梗阻1例。3例患者手术后均有不同程度的营养不良，白蛋白在16.5g／L-24.7g／L。 1.2手术方法：3例患者中，1例行结肠癌根治加乙状结肠造口术，2例行结肠癌根治加回肠造口术。 1.3造口皮肤粘膜分离的情况：病例1，女，71岁，住院号：488762，分离范围5-7点钟位置，1.5cm×1.0cm；病例2，女，45岁，住院号：412885，分离范围6-9点钟位置，1.0cm×1.0cm。病例1、2均为红色组织。病例3，女，84岁，住院号：493735，分离范围1-4点钟和7-12点钟位置，其中1-4点钟位置 2.0cm×2.0cm，7-12点钟位置2.0cm×1.5cm，75﹪黄色组织，25﹪红色组织。同时伴有造口旁减张缝合处2.0cm×2.0cm× 3.0cm的溃疡，100﹪黄色组织。3例患者出现时间均在术后4-7天。 2 护理： 2.1心理护理：告知患者，皮肤黏膜分离是肠造口术后的并发症之一，如果得到及时、恰当的处理，愈合很快。在护理中，加强与患者沟通，树立患者治愈的信心，取得患者的信任和配合。 2.2肠外营养（PN）护理：（1）评估患者的营养状况，及时纠正低蛋白血症，3例患者术后均采取中心静脉置管肠外营养（PN）。在严格无菌技术操作下行中心静脉置管，穿刺成功后, 保持置管部位的清洁干燥, 每周换药2～3次。（2）掌握全肠外营养配制的原则。专人配置，严格无菌操作。以葡萄糖―脂肪双能源,常规给予钾、钠、钙、镁、磷制剂补充电解质和补充维生素;应用平衡氨基酸提供氮源,在开始3天，每天检测血电解质加肝、肾功能，稳定后每周测1～2次。（3）输注时要制定输液计划，保证液体在24小时内均匀输入，如果输入过快或浓度过高,加上手术及创伤后机体产生应激性反应, 极易引起血糖代谢紊乱,发生高血糖，检测血糖每日4次至平稳。糖尿病患者术后血糖控制在7.0～10.0mmol∕L水平。（4）中心静脉置管期间，注意局部有无红肿、分泌物等感染征象，如寒战、高热等，应拔管，将导管尖端0.5～1㎝处剪断作细菌培养。（5）应用白蛋白、血浆、输血等，白蛋白均升至正常范围，全身营养状况得到改善。 2.3 造口护理：（1）术后注意观察造口情况，外置肠管与皮肤附着是否正常。（2）病例1、2属表浅皮肤粘膜分离，伤口浅小，生理盐水清洗，无菌纱布抹干，局部使用溃疡粉，再粘贴康乐保5900造口袋。（3）病例3属深层皮肤粘膜分离，有感染存在，彻底清除坏死组织后，用生理盐水清洗，无菌纱布抹干使 1
细胞生物学设计性实验：细胞核的分离鉴定
细胞生物学设计性实验：细胞核的分离鉴定 医学细胞生物学设计型实验设计报告 班级10级k-7班 评分 实验项目： 细胞核的分离与鉴定 实验原理：1、细胞内各种结构的比重和大小不同，在同一离心场内其沉降速度也不同。所以，用差速离心法可将细胞内各种细胞器及组分分级分离出来。差速离心法也是用来研究亚细胞成分的化学组成，理化特性及其功能的主要手段。 2、分离细胞核最常用的方法是将组织制成匀浆，在特定的条下进行离心分离，然后分析鉴定。 3、匀浆是指在低温条下，将组织放入匀浆器，加入等渗匀浆介质进行研磨，破碎细胞，使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆液。 实验步骤：1、处死：断头处死小白鼠，手提尾部使其学业尽量流出。 2、取材：迅速开腹取肝，在盛有生理盐水的小烧杯中反复洗涤，称取湿重约为1g的肝组织放在烧杯中。 3、匀浆：加油8ml预冷的0.25mol/L蔗糖0.003mol/L绿化高永夜于烧杯中，尽量剪碎肝组织，将剪碎的刚组织倒入玻璃匀
浆器，是匀浆器下端侵入盛有冰块的器皿（如冰盘）。左手握持匀浆器，右手将匀浆捣杆垂直插入管中匀浆，直至看不到明显的组织块。 4、过滤： 用8层纱布（先用少量生理盐水或蔗糖液润湿纱布）过滤匀浆液于离心管中。 5、离心：在天平上平衡每对离心管，2500r/min离心 15min，取上清液于另一离心管中。 6、涂片：取上清液制一张涂片（涂片1）。将原离心管中剩余上清液吹打成沉淀成悬液，另制一张涂片（涂片2），自然干燥。 7、染色：分别在涂片1和2上低价甲苯胺蓝染液 ，染色5到7分钟（即滴染）。 8、洗涤：冲去染液，晾干。 9、镜检：结合实验结果的描述，镜下观察分析。 注意事项：1.操作规范，防止试剂污染。 2.细胞悬液的涂片制作要轻柔。 3.使用离心机要注意平衡，转速从低到高。 预期结果：低倍镜下找到标本，再换高倍镜，可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色，圆形，中央有2到4个甚至更多个深蓝色的核仁。 实验用品：材料：小白鼠肝脏。
单个核细胞分离.
Separation of Mononuclear Cells from Whole Peripheral Blood 外周血单个核细胞分离 Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation 聚蔗糖—泛影葡胺分层液密度梯度离心法【Materials】 (1)Lymphocyte Separation Medium: specific gravity 1.077±0.001g/L 淋巴细胞分层液（比重为1.077±0.001g/L） (2) 2％trypan blue solution 2％台盼蓝染液 (3) Hank’s balanced salt solution (HBSS) or RPMI-1640 medium Hank’s液或者RPMI-1640培养基 【Methods】 (1) Drawing 2ml blood from main vein and mixing with 0.1 ml Heparin solution in a tube. 采集静脉血2ml注入盛有0.1ml肝素的试管中，混匀。 (2) Dilute the whole blood with an equal volume of Hank’s balanced salt solution (HBSS) 加入等体积HBSS或PBS等倍稀释血液。
(3) Pipette 2ml lymphocyte separation medium into a centrifuge tube. Then, add the diluted blood sample carefully by flowing along the side of the tube on the LSM. The interface must be clear. 吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中，再将稀释血液小心沿管壁加至分层液上，应注意保持两者界面清晰。 (4) Centrifugation at 2000rpm for 20 min at room temperature. Four distinct layers are found from top to bottom: 室温2000r／min离心20min。管内可分为以下四层：
外周血单个核细胞的分离
实验二十四外周血单个核细胞的分离 (Separation of mononuclear cell in peripheral blood) 免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细 胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。外周血单个核细胞(PBMC) 的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque) 分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。 【实验原理】 血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll) 和泛影葡胺(Hypaque)按一定比例混合制成，20C密度为 1.077 士0.001，单个核细胞包括淋巴细胞 和单核细胞，其密度为 1.050?1.077，而粒细胞和红细胞的密度为 1.080?1.110。将待分离的 细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与 粒细胞沉于管底。 【主要试剂和器材】 1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077 士0.001。 2.5g/L 台盼蓝。 3.250U/ml肝素溶液用Hank's液配制。 4.Hank s 液。 5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。 6.水平离心机、显微镜。 【操作方法】 1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。再加入等量Hank's 液混匀。 2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。稀释血 液与分层液的容积比例以2：1?3 ：1为宜。 3.置水平离心机中，2000r/min 离心20min。 4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、 血浆层(含血小板和破碎细胞)。 5.用滴管直接吸岀单个核细胞层，或吸去血浆层后再吸了该层，置于另一离心管中。 6.加入4倍量以上的Hank's液，充分混匀，1000r /min离心l0min。离心后倾弃上清液，再用Hank,s液洗2次。 7.用含10%?20%灭活小牛血清的Hanks液或培养液配制细胞悬液。计数，并分别计数粒细胞和单个核细胞数，同时用台盼蓝检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。 【结果判断】 【注意事项】 1.将血液进行稀释可降低血液黏稠度和红细胞的聚集，提高单个核细胞的收获量。 2.温度变化可直接影响分层液的密度，即影响细胞的收获率和纯度。故应在室温(18?25C)下进 行实验，分层液使用前应预温至室温。温度过低，淋巴细胞丢失增多；温度过高，会影响淋巴细 胞活性。 3.分离时的转速与时间应根据不同样品作相应调整。离心速度在2000?2500r/min，离心时间为
首次分离出人肠道干细胞_
生物医学工程与临床2013年5月第17卷第3期BME ＆Clin Med,May 2013,Vol．17,No .3 氏骨折治疗方法的选择[J].中国骨与关节损伤杂志，2006，21（7）：518-520.] [2]LI Ze-lu,LIANG Bing-sheng.Progress on treatment of missed Monteggia fracture in children[J].International Journal of Or -thopedics,2011,32(3):173-175.[李泽璐，梁炳生.儿童陈 旧性孟氏骨折治疗进展[J].国际骨科学杂志，2011，32（3）： 173-175.] [3]ZENG Pei,YANG Jian-ping.Missed Monteggia fracture in chil -dren:pathological mechanism and surgical treatment[J].Chine -se Journal of Orthopedics,2012,32(5):457-461.[曾裴，杨建平. 儿童陈旧性孟氏骨折的手术治疗[J].中华骨科杂志，2012，32（5）：457-461.] [4]YI Shen-de,WANG Bao-li.Treatment of old Monteggia frac -ture in children[J].Practical Clinical Medicine,2010,11(7):68-69.[易申德，王保利.儿童陈旧性孟氏骨折治疗体会[J]. 实用临床医学，2010，11（7）：68-69.] [5]LIAO Su-ping,KAN Wu,YANG Zhong-hua,et al .Operative treatment of old Monteggia fracture [J].Orthopedic Journal of China,2003,11(14):966-967.[廖苏平，勘武，杨中华，等.陈 旧性孟氏骨折的手术治疗[J].中国矫形外科杂志，2003，11（14）：966-967.] [6]L 覿dermann A,Cerinoi D,Lef èvre Y,et al .Surgical treatment of missed Monteggia lesions in children[J].J Child Orthop,2007,1(4):237-242. [7]TANG Wei,MU Ming-zhang,TAN Jiang-wei,et al .Down -ward shift of the interposed annular ligament after capsular re -lease for the treatment of pediatric old Monteggia fracture[J].Chinese Journal of Pediatric Surgery,2011,32(9):682-685.[唐伟，慕明章，谭江威，等.关节囊松解被卡环状韧带下移 治疗儿童陈旧性孟氏骨折[J].中华小儿外科杂志，2011，32（9）：682-685.] [8]E Jian-cuo,GUO Li-ping,ZHANG Jian-ning.Treatment of 16 cases of old Monteggia fracture in children[J].Qinghai Medical Journal,2009,39(7):36-37.[阿尖措，郭立平，张建宁.手术治 疗儿童陈旧性孟氏骨折16例临床体会[J].青海医药杂志， 2009，39（7）：36-37.] [9]CHEN Yuan-ping,LIU Lan-zhi.The effect of ulnar lengthen -ing internal fixation for treatment in old Monteggia fracture in children of 38cases[J].Journal of Practical Orthopedics,2008,14(5):311-312.[陈元平，刘兰芝.尺骨延长内固定术治疗 儿童陈旧孟氏骨折38例[J].实用骨科杂志，2008，14（5）： 311-312.] [10]ZHOU Qin-po,WANG Ming-chun,HUANG Jian-guo,et al . Treatment of 30cases of old Monteggia fracture in children[J].Ningxia Medical Journal,2009,31(5):451-452.[周勤坡，王 铭春，黄建国，等.手术治疗儿童陈旧性孟氏骨折30例体会[J].宁夏医学杂志，2009，31（5）：451-452.] 首次分离出人肠道干细胞 据Gracz AD 2013年4月4日（Stem Cells ，2013Apr 4.doi ：10.1002/stem.1391.）报道，美国北卡罗来纳大学教堂山分校的研究人员首次从人肠道组织中分离出成体干细胞。这一发现给科学家们提供急需的资源以便揭示出人类干细胞的确切生物学机制。它也能够让科学家们探索新的策略来治疗炎症性肠病或缓解因化学治疗和放射治疗经常导致肠道损伤而带来的副作用。 研究这些干细胞的一大障碍就是不能获得它们。在此之前，研究者一直没有技术来分离和研究这些干细胞。如今，有方法解决其中的很多问题。 多年以来，科学家们不得不寻求来自小鼠的干细胞进行实验。尽管利用小鼠模型进行研究已取得重大进展，但是小鼠与人类之间的干细胞生物学特征上存在的差别一直不能让研究人员开发出新的方法来治疗人类疾病。尽管研究者从小鼠那里获得的信息是解释这种肠道组织如何工作的较好的基础机制性数据，但是除非在人类组织中开展过类似的实验，否则仍然有可能不能深入认识这种组织的作用机制。 Magness 实验室在美国曾经首次从小鼠体内分离出和培养单个肠道干细胞，因此当在人类组织中寻求类似的干细胞时，他们 有这方面的优势。此外，研究人员也能够获得人小肠组织切片来开展实验，其中小肠组织是在胃分流术（gastric bypass surgery ）中被切除下来的，并且通常被抛弃掉。 为了开发这种技术，研究人员研究了他们在小鼠体内采取的方法是否会在人类组织中起作用。他们首先观察在小鼠肠道干细胞表面上发现的分子是否同样在人肠道干细胞中存在。他们发现这些被称作CD24和CD44的特异性分子确实在小鼠和人体内是一样的。他们然后将荧光标记附着到这些分子上，并利用一种特殊的被称作荧光激活细胞分选仪（fluorescence activated cell sorter ）的机器鉴定和分离出来自人小肠样品中的干细胞。 研究人员发现，不仅能够从人肠道组织中分离出人类干细胞，而且也能够分离出不同类型的肠道干细胞。对干细胞研究人员而言，两类肠道干细胞———活跃肠道干细胞和储备肠道干细胞———是一个热门话题。为此，干细胞研究人员仍然一直试图找出储备干细胞如何周期性地激活从而弥补因损伤、化学治疗或放射治疗而遭受损伤的活跃干细胞。 研究者下一步就是仔细地描述这些干细胞群体的特征来评估它们的潜力。解决能够在体外增殖这些细胞从而潜在地提供一种细胞来源，或者特别地、能够对这些细胞基因修饰来治疗先天性遗传病或炎症性肠病。这些在未来是将要研究的问题。 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 ·信息动态· 265--
细胞核的分离
实验四细胞核的分离 [实验目的] 1. 为了研究细胞核及其组分。 2. 定量分析细胞核的生化组分及其它一些特殊成分。 [实验原理] 1956年由chauveau等人提出，用高密度介质来分离细胞核。由于细胞核的密度较大，在高密度介质中，在高速离心条件下沉降下来，从而达到与细胞质其它成分分开来的目的。chauveau 的方法是将动物肝脏直接在2.2mol/l蔗糖溶液中匀浆，然后高速离心40 000g 1小时，细胞核沉淀到底部，线粒体和完整细胞，包括红血球漂浮在液面，通过一步操作即可分离得到细胞核。其后又有不少研究者对此方法进行了改进，例如加进氯化钙、氯化镁、氯化钾等改变分离介质的渗透压；选择介质的ph以及不同的高密度蔗糖溶液离心方法等。这样减少了细胞核的脆性，防止聚集，维持恒定的ph，就能保持细胞核的精细结构。虽然这一方法比较简单，能得到较高纯度的细胞核，也已被广泛采用，但实验需要高速离心机，这在一般实验室不能进行，此方法要用高浓度的蔗糖，如果要分离大量的细胞核，也很不经济。 目前在一般实验室中更多的是用柠檬酸分离细胞核，在柠檬酸介质中分离细胞核可以显著地除去附着在细胞核膜上的细胞质成分。由于柠檬酸降低了溶液的ph值，这样可以减少细胞核的破碎率，并能分离得到较高分子质量的核酸，可能是由于核糖核酸（一种酸溶性蛋白）被柠檬酸除去，以及二价阳离子被柠檬酸螯合所致。 柠檬酸的浓度对分离细胞核的质量有较大影响。通常在较低的ph值时，可以得到较高的细胞核。但在过酸条件下，可能引起细胞核成分的改变和酶的失活。为了研究细胞内核酸，一般常在ph值为4，甚至在ph值为2.5时分离细胞核。如为了分离细胞核的酶，则需要较温和的条件，此时可以在ph值为6～6.2的极稀柠檬酸溶液中分离细胞核。
单个核细胞的分离
单个核细胞的分离：（密度离心法） （一）外周血中的单个核细胞的分离： 1. 眼眶静脉丛采血：（无菌条件下操作） 采血者的左手拇食两指从背部较紧地握住小鼠或大鼠的颈部(大鼠采血需带上纱手套)，应防止动物窒息。当取血时左手拇指及食指轻轻压迫动物的颈部两侧，使眶后静脉丛充血。右手持续接7号针头的1ml注射器或长颈(3～4cm)硬质玻璃滴管(毛细管内径0.5-1.0mm)，使采血器与鼠面成45℃的夹角，由眼内角刺入，针头斜面先向眼球，刺入后再转180度使斜面对着眼眶后界。刺入浓度，小鼠约2～3mm。当感到有阻力时即停止推进，同时，将针退出约0.1-0.5mm，边退边抽。若穿刺适当血液能自然流入毛细管中，当得到所需的血量后，即除去加于颈部的压力，同时，将采血器拔出，以防止术后穿刺孔出血。若技术熟练，用本法短期内可重复采血均无多大困难。左右两眼轮换更好。体重20-25g的小鼠每次可采血 0.2-0.3ml。摘除眼球取血： 左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。采血完毕立即用纱布压迫止血。每次采血量0.6-1mL。 2. 分离PBMC操作步骤： 1）用抗凝管（内含抗凝液0.2ml）收集血液，摇匀，加入的Hank’s液或PBS等体积（1:1）稀释血液。 或用肝素溶液：生理盐水将肝素配成125-250U/mL的无菌液，4度保存。每1mL全血加0.1mL 肝素溶液。 2）取淋巴细胞分层液2ml，放入15ml的离心管。 3）将离心管倾斜45°角，用吸管吸取稀释血液，在离分层液面上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液量叠于分层液上，保持两者界面清晰。 （稀释血液与分层液体积比例约为2:1）。 （或：将吸管嘴插入离心管底部，将分层液缓慢加入稀释血液的底部。） 4）18-20度，水平离心机以2000r/min离心20min，离心后其中的内容物分为四层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分层液，底层为红细胞和粒细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层（薄）。单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。（离心温度在18-20度） 5）用毛细血管（或1ml注射器）轻轻插入白膜层，沿试管壁周缘吸取界面层单个核细胞，移入另一离心管中。 （或：先吸去最上层的血浆，然后用另一只毛细吸管收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC，避免吸到过多的分层液和血浆。） 6）加入５ml的（不含Ca2+，Mg2+）的Hank's液或RPMI1640洗涤2次，混匀，依次以1500r/min、1000r/min离心10min，吸弃上清。 （*低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板） 7）末次离心后，弃上清，用含有10％小牛血清的RPMI1640 2ml，重悬细胞。 8) 细胞计数：取20ul细胞悬液加20ul 0.4%台盼兰染液，3-5分钟后取样进行计数。 活细胞不着色，折光强；死细胞被然成蓝色，体积略膨大。计数200个细胞，计算活细胞百分率。 单个核细胞浓度(细胞数／1ml细胞悬液)＝(4个大方格内细胞总数/4)310４32(稀释倍数) 活细胞百分率＝(活细胞数/总细胞数)3100％
肠上皮干细胞研究进展解析
肠上皮干细胞研究进展 作者：刘冠琳陈志强叶章群 【关键词】肠上皮 肠黏膜上皮是哺乳动物机体代谢最为活跃的场所，肠上皮细胞终生进行着不间断的自我更新，这是因为位于肠道隐窝内的干细胞保持着旺盛的增殖分化能力。成体细胞的凋亡脱落及受损坏死与干细胞增殖、分化之间保持着动态平衡，由此可见肠上皮干细胞在维持肠道屏障结构和功能的完整以及损伤后的修复中扮演着重要角色。因此了解肠上皮干细胞的相关生物学特性，对临床工作将有重要的意义。同时，肠道是机体营养物质吸收的主要场所，了解肠上皮干细胞群的构建方法，对某些因代谢原因引起的疾病治疗方法的探索上，也具有十分重要的意义。 1 肠上皮干细胞生物学研究进展 小肠与结肠的内壁是一单层柱状上皮，这层上皮由于细胞从有增殖能力的隐窝前移过来而不断被更新。小肠细胞离开隐窝转移到突出于肠腔的绒毛表面。只有位于隐窝出口的绒毛上皮才能成为完全成熟的，具有与分化相关的生化标志的细胞。这些细胞主要为上皮柱状细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞。下面就肠上皮干细胞的有关生物学特性做一个综述。 1.1 微环境干细胞在获得分化特征之前，先要离开隐窝底部［1，2］。这说明肠上皮干细胞群的维持需要一个独一无二的微环境。研究表明，微环境对干细胞的调节包括干细胞本身、细胞外基质以及成纤维细胞和成肌细胞等对干细胞的调节。 虽然目前对肠上皮干细胞在小肠隐窝中的具体位置还存在不少争议，但是仍然有不少观念认为隐窝中的潘氏细胞就是事实上的干细胞。潘氏细胞是一种能长期生存的细胞，因而在隐窝底部保持了一种稳定的环境。它们能产生大量的因子用以调节邻近细胞的增殖和分化。这些因子包括表皮生长因子、肿瘤坏死因子α和其他调节细菌数量的因子。 大量证据表明，细胞外基质（ECM）的成分以及它们之间的相互作用对维持肠上皮的功能是非常重要的。首先，这些成分通过调节干细胞对ECM的黏附，从而使隐窝底部干细胞数目的保持或削减达到最佳状态。其次，ECM对肠上皮干细胞增殖和分化的调节也很重要，在发育过程中对小肠上皮干细胞起到正、负两方面生长调节作用。例如，HLx是一种可在多处出现的小鼠同源异性盒基因，在中、后肠的间充质中表达。这种基因对于肠道延伸是必需的，是生长的正向调节因子［3］。相反，Fkh6缺乏的小鼠表现出肠过度生长，并且在发育和成体阶段均有增殖的严重失调，这说明它是肠上皮生长的负向调节因子
细胞核的分离与鉴定设计型实验设计报告_(2)
实验项目：细胞核的分离与鉴定 实验原理： 分离细胞核的可用方法有吸出法、原生质体破裂法、差速离心法排和排除法。差速离心法是根据细胞内各种细胞结构的比重和大小不同，因而在同一离心场内的沉降速率不同从而将细胞内的结构分级分离出来。本实验就采用差速离心法。 细胞核的鉴定，因为细胞核中主要含DNA，而DNA是碱性蛋白，可用甲苯胺蓝染液可使细胞核内碱性蛋白呈现出来。 实验器材：显微镜，普通离心机，离心管，滴管，玻璃漏斗，纱布，烧杯，解剖剪，镊子，玻璃匀浆器，载玻片/盖玻片，染色盘架，小白鼠肝脏。 实验试剂：甲苯胺蓝染液，蒸馏水，0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，生理盐水 实验步骤： （1）、用颈椎脱臼法处死小白鼠，迅速解开其腹腔取出肝脏，去出结缔组织，剪成小块，尽快置于盛有0.9%NaCl的烧杯中。反复洗涤尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。 （2）、将湿重为1g的肝组织放入烧杯中，用量筒取8ml预冷的0.25mol/L 蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，先加少量溶液于烧杯中，尽量剪碎肝组织后全部加入。 （3）、将剪碎的肝组织导入匀浆管中，使匀浆器下端侵入盛有冰块的器血
中，左手持，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3-5次。用3层纱布过滤于匀浆管中，然后制备一张涂片①，自然干燥。 （4）、将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机以2500r/min离心15min,弃去上清液。 （5）、用6mol 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液悬浮沉淀物，以2500r/min离心15min 弃去上清液，将残留液体用气管吹成悬液，滴一滴于干净的载盖玻片上，制成涂片②，自然干燥。 （6）在①·②上滴加甲苯胺蓝染液，染色5-7min，洗涤干燥后镜检。 ⑺记录观察结果 注意事项： （1）尽可能充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。 （2）将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离心，以防止浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。 （3）涂片制作过程中把握好涂片的力度，不可太厚。 （4）染色后的洗涤要注意时间，不可过长，避免将染色洗去，观察不到细胞核。 （5）开腹取出肝后，用生理盐水反复冲洗，避免血细胞对食盐的影响。 预期结果： 在低、高倍镜下，可以观察到经.0.1%碱性固绿染色的小白鼠肝细胞的细胞核体被染成绿色。说明这是碱性蛋白，即细胞核已游离出来。 涂片在高倍镜下可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色、圆形、中央有
人外周血单核细胞分离技术
人外周血单核细胞分离 1. 抗凝血的预离心分别取正常人新鲜抗凝全血 A: 20 mL于50 mL离心管中，以2 000 r /min离心20 min，吸弃上层血浆，获得下层沉淀细胞约10～12.5 mL。 2. 沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀 A 中的细胞中加入Hank′s液( 不含Ca2+、Mg2+, pH 7.2 ～7.6) 体积比仍未1:1，混匀，制成细胞悬液。 B: 无菌抗凝血与Hank′s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。 另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处将细胞悬液小心而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。此时稀释后的细胞悬液分离液淋巴细胞体积为：1:1。与用水平离心机以2000 r /min 离心20min，离心结束后，取出离心管，可见管中液体已经分层。 管内可见分为4层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄的白膜层，主要台单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜 3. 单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁 吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的2／3。混匀后离心1500r/min离心 10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。 注意：还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。第二种方法，比较简单一些。 再用同样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。再以RPMI-1640 培养基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。按每毫升血液标本加0.2 mL含20%小牛血清的Hank′s液( 或含10%胎牛血清及25 mmol /L
肠造口皮肤黏膜分离护理研究进展
肠造口皮肤黏膜分离护理研究进展 发表时间：2017-06-23T14:39:45.047Z 来源：《航空军医》2017年第8期作者：左红群黄静芳潘海辉潘意[导读] 肠造口手术是外科最常施行的手术之一［1］，肠造口术虽然拯救了许多人的生命。 （广西医科大学附属肿瘤医院胃肠外科二病区广西南宁 530021）肠造口手术是外科最常施行的手术之一［1］，肠造口术虽然拯救了许多人的生命，但肠造口术后并发症发生率很高，国外文献报道，肠造口并发症发生率为11.0%～60.0%［2］，国内文献报道为16.3%～53.8%［3］，其中肠造口皮肤黏膜分离是肠造口手术后并发症之一，系指肠造口处肠黏膜与腹壁皮肤的缝合处发生分离，多发生在术后1-3周内。肠造口黏膜皮肤分离后形成的开放性的伤口可浅可深，通常到达皮下层。黏膜皮肤分离后粪便收集困难，造口排出的粪便污染伤口，使之成为棘手的难愈性感染伤口。若不及时处理或处理不当，将有可能在近期发生造口回缩，在远期将有可能造成造口狭窄，严重者如过度狭窄甚至会影响排便，需二次手术才能解决问题，给患者身心造成极大的创伤。因此，及时采取有效措施进行处理，促进伤口愈合并提高患者生活质量就显得尤为重要。笔者现将肠造口皮肤黏膜分离的护理进展进行综述，现报告如下。 1.原因 造成皮肤黏膜分离的原因［5］有：（1）张力过大/坏死，如外科手术会导致血供破坏，继发肠系膜张力过大，危及造口周围血供等，均可导致皮肤黏膜分离。（2）造口缝线脱落，如缝合肠造口黏膜与皮肤的可吸收肠线比较细滑，若打结不牢或者缝线断裂使得缝线脱落也会导致皮肤黏膜分离。（3）感染，如粪便污染引起的感染和溃疡形成可导致皮肤黏膜分离。（4）营养不良/炎症性肠病，这类状况有可能导致伤口难愈合，形成黏膜皮肤分离。（5）造口术前定位不佳，造口在位置差，位置不佳，如位于脐旁左腰线皱褶处，造口周围皮肤凹凸不平，在黏膜造口用品时，过度拉伸皮肤造成缝线张力过大可导致皮肤黏膜分离。（6）腹压过高，如肥胖、用力咳嗽导致的皮肤黏膜缝线处牵张力增大可导致皮肤黏膜分离。（7）血液循环系统功能不良，如某些病人术后造口周围组织血液灌注不足，组织坏死，可导致皮肤黏膜分离。（8）糖尿病/长期使用类固醇药物/术前放疗，这些情况均可导致皮肤黏膜缝线处愈合不良，使皮肤与造口黏膜分离并留有开放性的创面。 2.护理干预方法2.1 造口发生皮肤黏膜分离危险因素评估及预防万淑琴［6］等报道，术后评估发生造口发生皮肤黏膜分离有数个危险因素，如皮下积液感染、黏膜缺血坏死、切口感染、术后白蛋白低于正常、术后血红蛋白低于正常、肠道准备差，这6个危险因素使得发生造口发生皮肤黏膜分离的概率会大大增加。所以关键是对发生造口皮肤黏膜分离的预防，预防措施有术前重视全身情况、做好肠道准备、手术后密切观察并及时发现。黄漫容等［7］也强调了指导患者掌握正确裁剪造口底板及粘贴技巧，并定期复诊对预防此并发症有一定作用。 2.2 造口皮肤黏膜分离的护理评估（1）对创面的评估，施婕［8］等报道强调创面局部评估包括：皮肤黏膜分离范围，创面面积、深度，是否有潜行及潜行的深度，创面渗液颜色、气味及量，创面基底肉芽颜色。裴新荣［9］等推荐伤口评估采用时钟法，用专用伤口测量尺测量面积及深度。（2）施婕［8］等指出对肠造口的评估内容包括：肠造口的颜色、大小、高度，有无支架管；造口与切口的相对位置；排泄物的性质；有无造口凹陷。（3）对全身状况的评估，赵琦［10］等强调处理任何创面不能只重视局部创面的评估和处理，必须重视患者的整体情况，除了评估创面和肠造口，还评估患者的营养状况、血糖水平、心理精神状况，以及患者的经济状况和社会支持系统等。 2.3 创面护理措施陈秀君[11]等用藻酸盐银离子敷料治疗肠造口术后重度皮肤黏膜分离8例，患者伤口均愈合良好。柴东芹[12]等对30例不同程度的造口皮肤黏膜分离患者中采用综合的、针对的护理措施（藻酸盐、水胶体敷料、银离子敷料、亲水性纤维敷料、溃疡粉），利用湿性愈合方法，愈合率高达96.5%. 另外指导患者掌握正确裁剪造口底板及黏贴的技巧，并定期复诊也可取得较好的预防效果。樊冬霞［13］等对38例肠造口并发不同程度皮肤黏膜分离患者采用湿性愈合疗法，愈合率高达94.47％。丁璐［14］等以72例肠造口黏膜皮肤分离患者作为研究对象，对创面选择生理盐水棉球对黏膜分离部位伤口进行清洗，再对造口附近皮肤进行清洗，最后对造口进行清洗，切忌不能使用消毒剂对造口进行清洗，且在其上方撒上水胶体糊剂或者是水胶体粉剂。依照分离部位创面大小，将大小适中的纱布填入其中，确保创面相平于周围皮肤，再将透明胶贴在上面，其总有效率达到94.44%。林善芳［5］等用藻酸盐、水胶体敷料治疗肠造口术后皮肤黏膜分离5例患者均痊愈出院。裴新荣［9］等对20例肠造口皮肤黏膜分离的病人进行循证护理的干预措施，将循证护理所获得的证据、护理经验和病人的实际情况相结合，明显缩短肠造口皮肤黏膜分离发生后的愈合时间及减少其他并发症的发生，愈合率高达100％。 2.4 造口皮肤黏膜分离后并发症及干预措施肠造口皮肤黏膜分离发生后易产生的相关并发症。造口皮肤黏膜分离后，造口乳头低于周围皮肤，既使排泄物不易收集又使造口周围皮肤愈合时间过长，会造成造口内陷；若瘢痕形成（愈合时间越长瘢痕形成越多）和瘢痕收缩则会导致造口狭窄。裴新荣［9］等强调使用凸面底盘配合造口腰带使造口周围皮肤下压，肠黏膜抬高，造口乳头部膨出，改善造口回缩的现象。同时通过皮肤下压，缩小了周围皮肤与肠管间的间隙，有利于防止粪便渗入创面，且能缩短分离愈合时间。爱康肤银由羧甲基纤维素钠和1.2％银离子组成，银离子有助于产生一个抗菌环境。该敷料有杀灭并抑制细菌的作用，同时吸收伤口渗液，在创面形成一层柔软、黏着的凝胶，凝胶与创面紧密粘着可以避免无效腔形成［15］，并保持湿润环境，使伤口中坏死组织容易去除，新型湿性敷料的应用，可明显缩短伤口的愈合时间，且减少瘢痕的形成，可有效防止造口狭窄的发生。并且在伤口愈合后评估造口有无狭窄，及时进行处理，适时扩肛。皮肤黏膜分离处在修复过程中形成的纤维组织易收缩导致造口狭窄，应及时扩肛防止造口狭窄。扩肛时机的选择应在术后1周后开始，如过晚，瘢痕已形成，造口已狭窄，影响扩肛效果。扩肛具体方法：修剪指甲，食指戴手套后涂液状石蜡或食用油，先扩开肠管外口，然后慢慢深入到第二指关节上，待3～5分钟。根据情况选择扩肛频率，如手指进出自如，可每周1次，如感觉造口有紧缩感则每日1～3次，且要使用两件式造口袋。 2.5 心理干预措施