基因工程讲义

中国农业科学院研究生院《基因工程原理》课程补充讲义

（三）

吴乃虎

（中国科学院遗传与发育研究所）

黄美娟

（北京大学生命科学学院细胞遗传学系）

2011年4月26日

DNA聚合酶

吴乃虎

（中国科学院遗传与发育研究所）

黄美娟

（北京大学生命科学学院细胞遗传学系）

一DNA聚合酶

DNA聚合酶（DNA polymerase），也叫做依赖于DNA的DNA聚合酶（DNA-dependent DNA polymerase），或叫做DNA指导的DNA聚合酶（DNA-directed DNA polymerase），此外还有一种依赖于RNA的DNA聚合酶（RNA-dependent DNA polymerase）。这些核酸酶在原核和真核细胞中都有广泛的分布。根据氨基酸序列的同源性关系，可将各种DNA聚合酶，包括原核和真核的分为A、B、C、D、X、Y和RT（反转录酶）等7个不同的家族。反转录酶由于它能够用RNA为模板合成DNA，故也被归类为DNA聚合酶的一个家族。在分子遗传学研究中常用的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶、Klenow大片段酶、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、修饰的T7 DNA聚合酶以及各种不同类型的真核DNA聚合酶。它们具有如下几个方面的基本特点。

第一，DNA聚合酶只能按照5，→3，的方向延长新生的DNA互补链。它能够根据与模板链上核苷酸碱基互补规则，按序把反应体系中游离的dNTP逐个地添加到生长链的3，-0H 末端基团。换句话说，DNA聚合酶只具有催化新加入的dNTP分子的5，-P基团，与新生链自由的3，-0H末端基团之间形成磷酸二酯键的功能，而不具备催化新生链的5，-P基团与新加入的dNTP的3，-0H基团形成磷酸二酯键的活性。因此它不能够以相反的3，→5，的方向延长新生的DNA互补链。

第二，DNA聚合酶不能从头开始（de novo）合成新生的DNA互补链。已知在DNA 聚合酶当中，除了参与RNA引物合成的聚合酶α/引发酶之外，所有的催化新生DNA互补链的合成，都必须有“引物”的参与。这种引物通常是一种RNA短片段，它务必在DNA 聚合酶开始延长新生DNA互补链之前，就已经按照与模板链碱基互补的规则先期合成出来。DNA聚合酶能够识别RNA引物，并同其自由的3，-0H末端结合，在这种情况下才能够利用反应体系中游离的DNA结构元件dNTP，延长新生的DNA互补链。

第三，DNA聚合酶具有不同的持续合成能力（processivity）。当DNA聚合酶完成了一个核苷酸分子的参入之后，它或是先从DNA分子上解离下来，尔后再结合上去完成另一个核苷酸分子的参入；或者是继续保持结合状态，并沿着DNA模板链移动，到完成了多个

核苷酸参入之后再解离下来。因此说，DNA聚合酶的解离与再结合的时间间隔，是其持续合成能力的制约因素。由此可见，所谓DNA聚合酶的持续合成能力，实质上是指在DNA

聚合酶与DNA分子的一次结合的时间内，所能参入的核苷酸分子的平均数。不同类型的

DNA聚合酶的持续合成能力相差悬殊，有的仅能参入少数几个或10几个核苷酸，有的则可参入高达数千个核苷酸分子。

第四，同一种DNA聚合酶往往具有多种不同的核酸酶活性。例如DNA聚合酶Ⅰ，除了具有合成DNA的5，→3，方向的聚合酶活性之外，还具有3，→5，方向的和5，→3，方向的核酸外切酶活性。前者这种外切酶活性，是构成DNA校正体系（proofreading system）的酶学基础；而后者这种外切酶活性，则可用于按切口平移的方法制备同位素标记的DNA 分子杂交探针。再如DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ，也都具有5，→3，方向的聚合酶活性和3，→5，方向的外切酶活性，但与DNA聚合酶Ⅰ不同，它们二者都不具有5，→3，方向的外切酶活性。由此可见，在大肠杆菌DNA聚合酶当中，唯有DNA聚合酶Ⅰ才具有5，→3，方向的外切酶活性，可以用来在体外体系中向DNA分子参入具放射性同位素标记的脱氧核糖核苷酸。

1. 大肠杆菌DNA聚合酶

根据酶学特性、亚基组成和胞内含量水平三个参数划分，大肠杆菌DNA聚合酶至少有5种不同的类型，即DNA聚合酶Ⅰ（PolⅠ）、DNA聚合酶Ⅱ（Pol Ⅱ）、DNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）、DNA聚合酶Ⅳ（Pol Ⅳ）和DNA聚合酶Ⅴ（Pol Ⅴ）。下面主要讨论与DNA 复制关系最为密切的PolⅠ和Pol Ⅲ两种DNA聚合酶。

（1）PolⅠ

PolⅠ是美国生物化学家Arthur Kornberg及其合作者，于1955年从大肠杆菌中分离纯化的头一种DNA聚合酶，所以通常也叫做Kornberg酶。1957年，他们应用PolⅠ酶首次实现了DNA分子的体外合成。1959年，Kornberg因此荣获该年度的诺贝尔奖。Pol Ⅰ酶是由polA基因编码的一种单链多肽蛋白质，分子量约为103kD，在大肠杆菌中含量相当丰富。PolⅠ酶具有两个大小不同可彼此分开的结构域。其中大的结构域又叫做Klenow 片段，分子量为68kD。它位于多肽链的C端，具有5，→3，方向的聚合酶活性和3，→5，方向的核酸外切酶活性。小的结构域的分子量为35kD，定位在多肽链的N端，只具有5，→3，方向的核酸外切酶活性。由这两个大小结构域合在一起的完全多肽叫做PolⅠ全酶（holoenzyme），亦即通常所说的PolⅠ酶。它是一种具有3种不同催化活性的多功能的DNA聚合酶（图5-20）。

图5-20 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的三种催化活性

（a）5，→3，方向的聚合酶活性。（b）5，→3，方向的核酸外切酶活性。

（c）3，→5，方向的核酸外切酶活性。

PolⅠ5，→3，方向的聚合酶活性PolⅠ的突出功能是从DNA分子的糖-磷酸骨架中，由磷酸二酯键断裂形成的切口（nick）处，开始DNA的合成。因为在单链切口上，PolⅠ酶5，→3，方向的核酸外切酶活性和聚合酶活性可以同时发生，所以当外切酶活性从切口的5，一侧移去一个5，核苷酸之后，聚合酶活性就会在切口的3，一侧补上一个新的核苷酸。然而由于PolⅠ酶不能够催化在3，-0H和5，-P之间形成一个磷酸二酯键，故尔随着反应的进行，5，一侧的核苷酸不断地被移去，3，一侧的核苷酸按序的参入，于是便出现了切口的位置沿

着DNA分子按合成的方向逐步移动的情况。此种移动特称为切口平移（nick translation）。在反应体系受到严格控制的条件下，可以做到在单链切口只发生5，→3，方向的聚合作用，而不发生3，→5，方向的降解作用。如此反应的结果，便可使生长链取代原有的亲本链。在迄今已发现的所有大肠杆菌DNA聚合酶中，惟有PolⅠ酶能够进行此种独特的链的取代反应。它可用于制备带放射性32P标记的DNA分子杂交探针。

除此之外，DNA聚合酶Ⅰ还可以有效地用于清除为DNA复制所必须的RNA引物（removal RNA primer）、冈崎片段之间的缺口填补（gap filling）以及核苷酸的切除修复等（图5-21）。而参于DNA链的合成，并不是PolⅠ的主要的生物学功能。因为它延长DNA新链的持续合成能力（processivity）较差，每次与DNA链结合之后，都只能参入20～200个左右的核苷酸分子，便会解离下来。

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大亚基Klenow片段（Klenow fragment）酶，又叫做Klenow聚合酶或Klenow大片段酶。它系由PolⅠ全酶经枯草芽孢杆菌蛋白酶（一种特殊的蛋白质分解酶）处理之后，产生出来的一种大片段的蛋白质多肽分子。Klenow聚合酶仍然具有5，→3，，方向的聚合酶活性和3，→5，方向的核酸外切酶活性，但丧失了PolⅠ全酶所具有的5，→3，方向的核酸外切酶活性。因此，Klenow聚合酶只具有聚合和校正两种功能，业已被广泛地应用于分子遗传学及分子生物学的研究，例如按照随机引发技术（random priming）标记DNA分子。

PolⅠ3，→5，方向的外切酶活性当反应体系缺乏dNTP时，大肠杆菌PolⅠ具有的3，→5，方向的外切酶活性，便能够催化DNA发生水解作用，即从DNA链的3，-0H末端开始向5，方向前进，逐个地移走具有自由3，-0H末端基团的单核苷酸分子。这种外切酶活性的作用底物，可以是单链的DNA，也可以是双链的DNA。但对于双链的DNA分子在具有dNTP的条件下，PolⅠ酶的这种3，→5，方向的外切酶活性便会被5，→3，方向的聚合酶活性所抑制。因此说，PolⅠ的3，→5，方向的降解作用，是要在缺少dNTP的特定条件下才会发生。

PolⅠ具有的这种3，→5，方向的外切酶活性，对于校正新合成的DNA链中错误参入的碱基，具有重要的作用，因此也被称为校正核酸外切酶（proofreading exonuclease）活性。因为如果PolⅠ把错误的核苷酸加入到新生链，它便无法同模板链上相应的核苷酸正确配对。这种错误的核苷酸必须被适时地清除掉，新生的DNA链才能正常地继续延长。但是，Pol Ⅰ的3，→5，方向的核酸外切酶活性，能够终止这种核苷酸的错误参入，并进而将错误的核苷酸清除掉，使DNA的复制得以继续进行。

PolⅠ5，→3，方向的外切酶活性大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，同样也具有5，→3，方向的核酸外切酶活性，可以从DNA链的5，-末端开始水解DNA分子。这种降解作用释放的产物主要的是5，-磷酸核苷，同时也有少量的较大的10nt的寡核苷酸片段。正是由于PolⅠ具有此种5，→3，方向的外切酶活性，因此它在DNA复制中主要的作用是特异性地用于清除RNA引物（图3-21）。而且这种活性还可以切除因紫外光照射形成的嘧啶二聚体，参与DNA分子UV损伤的修复。

PolⅠ5，→3，方向的外切酶活性与其3，→5，方向的外切酶活性相比，有如下几个方面的不同。第一，PolⅠ5，→3，方向的外切酶活性所切割的DNA链，必须是位于双螺旋的区段上。第二，PolⅠ5，→3，方向的外切酶活性的切割部位可以是5，-末端磷酸二酯键，也可以是在距5，-末端数个核苷酸远的磷酸二酯键，其5，-末端可以是自由的羟基基团，也是可以是磷酸化的基团。第三，伴随发生的DNA链的合成，可以增强PolⅠ5，→3，方向的外切酶活性。第四，5，→3，方向的外切酶活性位点，显然是同聚合作用的活性位点及3，→5，方向的水解作用的活性位点分开的，前者位于小亚基，后者位于大亚基。第五，PolⅠ5，→3，方向的外

切酶活性，对于双链DNA中的单链切口也具有催化作用，只要它存在一个自由的5，-P末端基团就行。

图5-21 引物清除、缺口填补及切口封闭

（a）两段相邻的新生片段之间有一个因单链断裂形成的切口，其右

边片段的5，-端具有一个RNA引物。（b）PolⅠ结合在双链DNA中的

单链切口处。（c）PolⅠ酶清除掉RNA引物，并同时填补因左边DNA

片段的正向延伸所造成的单链缺口。（d）DNA连接酶以在两段相邻新

生链之间形成磷酸二酯键的方式封闭单链切口。

（2）PolⅡ

如上所述，体外系统研究表明，DNA聚合酶Ⅰ具有3种不同的催化活性，它能够参与DNA的合成与修复。那么它是否在活细胞中也同样具有这些功能呢？在发现DNA聚合酶Ⅰ的早期，回答这个问题有一定的难度。一方面同一种酶在体外和胞内的反应条件可能有所不同；另一方面在细胞中除了Po1Ⅰ之外有可能还存在着其他类型的DNA聚合酶。事实的确如此，在20世纪70年代经过众多科学工作者的艰苦努力，人们终于又在大肠杆菌中分离到了两种新的DNA聚合酶，并分别命名为DNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）和DNA聚合酶Ⅲ（Pol Ⅲ）。

表5-2 三种大肠杆菌DNA聚合酶的结构及功能比较

______________________________________________________________________________ DNA聚合酶

比较项目__________________________________________________

PolⅠPol ⅡPol Ⅲ

_______________________________________________________________________________ 编码基因的名称*1pol A pol B pol C*2

不同型的亚基数目 1 ≧4 ≧10

分子量（MW）103kD 88kD 83kD

5，→3，方向的聚合酶活性具有具有具有

3，→5，方向的外切酶活性具有具有具有

5，→3，方向的外切酶活性具有不具有不具有

对于具自由3，-0H末端基团之

引物的需求需要需要需要

聚合作用速率（核苷酸数/秒）16～20 40 250～1000

持续合成能力*3 20～200 1500 ≧500000

______________________________________________________________________________

注：*1. 对于多亚基的DNA聚合酶，仅指编码聚合酶活性亚基的基因。

*2. 该基因原先命名为dnaE。

*3. 每次聚合酶结合期间平均参入的核苷酸数

由于在野生型的大肠杆菌菌株中，DNA聚合酶Ⅰ的含量要比聚合酶Ⅱ和聚合酶Ⅲ丰富得多，因此Pol Ⅱ和Pol Ⅲ的存在事实上被高水平的PolⅠ的活性完全掩盖了。直到1969年，此时离PolⅠ的发现年份已经过去了将近15年，John Cairns才分离到了pol A基因发

生了突变的、大肠杆菌DNA复制温度敏感突变体菌株（pol A－）。由于这种突变株无法正常合成PolⅠ，故其含量仅为野生型菌株的1%，因此为分离PolⅠ以外的其他类型的DNA聚合酶提供了良好的实验材料。1971年，Thomas Kornberg和Malkolm Gefter应用磷酸纤维素层析技术（phosphocellulose chromatography），从大肠杆菌PolⅠ缺陷突变体菌株中分离纯化到DNA聚合酶Ⅱ和聚合酶Ⅲ。

这两种DNA聚合酶与DNA聚合酶Ⅰ具有多方面的共同特点（表5-2）。它们都具有5，→3，方向的聚合酶活性和3，→5，方向的核酸外切酶活性；在指导DNA合成过程中，都需要DNA模板、前体物dNTP以及具有自由的3，-0H末端基团的引物分子的参与。

DNA聚合酶Ⅱ的主要功能是参与DNA损伤的修复，而与DNA复制并无直接的关系。因为已发现缺失PolⅡ活性的大肠杆菌突变株，仍然可以正常存活。这说明PolⅡ的确不是参与DNA复制的必要的聚合酶。

（3）Pol Ⅲ

在发现大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ之后不久，研究者们便已注意到尽管此酶的含量十分丰富，但它并不是细胞内参与DNA复制的主要的聚合酶。事实上含量远不如PolⅠ的Pol Ⅲ，才是催化大肠杆菌染色体DNA进行复制的主要的聚合酶。因为实验观察表明，Po1Ⅰ缺陷的大肠杆菌突变株虽然丧失了合成PolⅠ的能力，但却依然能够复制存活。而且与PolⅠ相比，Pol Ⅲ更具诸多方面的优点。首先，Pol Ⅲ聚合作用速度快捷，每秒钟可参入1000个左右的核苷酸分子，与大肠杆菌DNA复制叉前进速度吻合。而PolⅠ的聚合作用速度则相当缓慢，每秒钟仅能参入20个左右核苷酸，还不到复制叉前进速度的1%。其次，Po1Ⅲ可长时间地与DNA分子保持结合状态而不发生解离，因此具有很高的持续合成能力。它每次同DNA分子结合之后，所参入的核苷酸分子数可高达500，000个，超出PolⅠ的2500倍（表5-2）。所以说在PolⅠ、PolⅡ和Pol Ⅲ三种DNA聚合酶当中，只有Pol Ⅲ才是细胞催化染色体DNA 复制所必不可少的一种DNA聚合酶。正因为如此，人们通常也称Pol Ⅲ为DNA复制酶（DNA replicase）。

DNA聚合酶Ⅲ全酶（DNA polymerase Ⅲholoenzyme）的分子结构，要比DNA聚合酶Ⅰ复杂得多。它是由15个分属于10种不同类型的多肽亚基组成的一种多肽复合物（表5-2），负责从引物延伸合成前导链和后随链。DNA聚合酶Ⅲ全酶含有两个核心聚合酶(core polymerase)、一个γ-复合物和2个β亚基（图5-22）。每个DNA聚合酶Ⅲ的核心聚合酶都是由α、ε和θ三个亚基组合而成。其中α亚基具有5，→3，方向的DNA聚合酶活性，它的功能是负责参与DNA链的合成，同时也可提高ε亚基的活性；ε亚基具有3，→5，方向的核酸外切酶活性，能够行使校正功能，及时将错误参入的核苷酸碱基清除掉，并可促进α亚基的聚合酶活性；至于θ亚基，目前有关其功能作用知之甚少，可能会促进ε亚基的核酸外切酶活性。

表5-3 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的亚基成分

_____________________________________________________________________________

亚基名称亚基数量编码基因分子量（kD）主要功能

______________________________________________________________________________ α 2 dnaE 132 具有5，→3，方向的DNA聚合酶活性，

参于DNA链的合成。

ε 2 dnaQ 27 具有3，→5，方向的核酸外切酶活性，校

正错误参入的碱基。

θ 2 holE 10 可能会促进ε亚基的核酸外切酶活性。τ 2 dnaX71 具有ATPase活性，可使核心酶二聚化

并与γ复合物结合。

β 2 dnaN 37 以二聚体形式存在，形成β滑动夹环

（sliding clamp）。

γ 1 dnaX52 与A TP结合，促使核心酶二聚化,系

滑动夹环装载器的组份之一。

δ 1 holA 35 与β亚基结合，系滑动夹环装载器的组

份之一。

δ， 1 holB 33 与γ及δ亚基结合，系滑动夹环装载器

的组份之一。

χ 1 holC 15 与单链DNA结合蛋白（SSB）结合，系

活动夹环装载器的组份之一。

ψ 1 holD12 与χ及γ亚基结合，系活动夹环装载器

的组份之一。

______________________________________________________________________________

注：*1. 表中所有亚基的分子量均为单体的分子量。

*2. dnaX基因的编码产物包括τ亚基和γ亚基，τ亚基氨基端有8%的氨基酸序列与γ亚基的相同。

*3. 活动夹环装载器系指Pol Ⅲ的γ复合物。

*4. dnaE基因现名polC基因，编码的Pol Ⅲ全酶之α亚基，即Pol ⅢDNA聚合酶。

*5. dnaθ原名mutD基因。

*6. DNA聚合酶Ⅲ的核心酶包括α、ε和θ三个亚基。

*7. γ复合物系由γ2、δ、δ，、χ和ψ等5种6个亚基聚合而成，是β滑动夹环的装载器。

图5-22 DNA聚合酶Ⅲ全酶的亚基组成

DNA聚合酶Ⅲ的核心聚合酶含有α、ε和θ3个亚基。以τ亚基

为中介，两个核心聚合酶与一个γ复合物结合形成具9种共13个

亚基的复合物，叫做DNA聚合酶Ⅲ。DNA聚合酶Ⅲ再与一个β二聚体结合形成具10种共15个亚基的复合物，叫做DNA聚合酶Ⅲ全酶。

τ亚基是一种连接蛋白质，它一端与DNA聚合酶Ⅲ的核心聚合酶结合，另一端则与γ复合物结合。于是经过两个τ亚基的这种连接作用，便形成了由两个核心聚合酶和一个γ复合物组成的多蛋白质复合物。我们称这种具有9种共13个亚基的复合物为DNA聚合酶Ⅲ。在τ亚基中，与核心聚合酶结合的结构与同γ复合物结合的结构域之间，有一段柔性接头。它可使两个核心聚合酶作相对独立的运动，从而使得一个核心聚合酶可以参与前导链的合成，而另一个核心聚合酶却可参与后随链的合成。

γ复合物（γ complex）系由5种不同亚基结合形成的一种异源5聚体（γδδ，χψ）蛋白质。由于它可以携带一个由β二聚体构成的滑动夹环，并通过水解ATP释放能量来协助此β滑动夹环与DNA分子结合，因此文献中通常也叫γ复合物为β滑动夹环装载器（sliding

clamp loader）（图5-23）。

β滑动夹环是由两个β亚基聚合形成的一种环状结构，在其内部有一个直径约为35?足以容纳一条双螺旋DNA分子穿过的中央孔道（图5-24）。由于这种β滑动夹环环绕在DNA 分子上，二者之间形成的空隙充满着水分，所以DNA聚合酶Ⅲ不但不容易从DNA分子上解离下来，而且滑动夹环还能携带着它沿着DNA分子滑动，结果使得DNA聚合酶Ⅲ的持续合成能力得到极大的提高。

图5-23 大肠杆菌β滑动夹环的装载器

β滑动夹环的装载器亦即是γ复合物，系由γ、δ、δ，、χ及ψ等

5种亚基组成的一种5聚体多亚基蛋白质。

图5-24 大肠杆菌β滑动夹环的三维结构

大肠杆菌DNA聚合酶的β滑动夹环，是由两个β亚基聚合成的

环形二聚体多肽。DNA双螺旋分子穿过β滑动夹环的中央孔道。

（4）PolⅣ和PolⅤ

1999年，人们又分别从大肠杆菌中分离出DNA聚合酶Ⅳ和DNA聚合酶Ⅴ。前者是由dinB基因编码的，故又叫做DinB聚合酶；后者系操纵子umuDC的编码产物，所以也称为UmuD，2C复合物。这两种DNA聚合酶的主要功能是参与DNA跨损修复（translesion repair）。同时由于它们都具有造成核苷酸碱基错配的倾向，所以对于细胞的适应性突变形成，也具有一定的功能作用。

2. 真核DNA聚合酶

与原核生物大肠杆菌相比，真核细胞所具有的DNA聚合酶，不仅类型相当繁多，而且含量也特别丰富。例如每个大肠杆菌细胞平均只含有10～20个拷贝的PolⅢ全酶；而每个哺乳动物细胞仅Polα一种聚合酶，其拷贝数就高达20000～60000个。这种情况是与真核染色体基因组DNA的多复制起点的结构特征相适应的。

（1）真核DNA聚合酶的归类

真核细胞中至少含有15种以上不同的DNA聚合酶（表3-4），例如人类基因组就编码着17种DNA聚合酶。依据催化功能的差异，真核DNA聚合酶可粗略地分为DNA复制型和损伤修复型两大类群；而按照氨基酸一级序列结构的同源性，真核DNA聚合酶又可分属于A、B、X和Y等数个不同的家族。其中Polγ属于A家族，Polα、Polδ、POlζ和Polε属于B家族。鉴于Polβ、Polλ、Polμ和末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT）这4种真核DNA聚合酶，彼此之间氨基酸序列结构惊人的相似，而与大肠杆菌DNA聚合酶之间又不存在实质性的同源性关系，因此被特别归类在X家族。Y家族的成员有Polη、Polι、Polκ和Rev1等多种。

表5-4 真核生物DNA聚合酶的特性

______________________________________________________________________________ 名称亚基数3，→5，外切酶主要功能

______________________________________________________________________________ Polα 4 无一种高保真的复制酶，在DNA复制与修复过程中，

参与RNA引物的合成和DNA合成的起始。

Polβ 1 无碱基切除修复和双链断裂修复。

Polγ 2 有线粒体DNA（mt DNA）的复制与修复。

Polδ 4 有前导链DNA的复制，碱基切除修复，双链断裂修复，

碱基错配修复，核苷酸切除修复。

Polε 4 有后随链DNA的复制，碱基切除修复，双链断裂修复，核

苷酸切除修复。

Polθ 1 无DNA链间交联（interstrand cross-link）修复。

Polζ 2 无跨越胸腺嘧啶二聚体损伤的跨损DNA合成

（translesion DNA synthesis）。

Polλ 1 无与减数分裂相关的DNA修复，跨损DNA合成。

Polμ 1 无非同源末端连接，双链断裂修复。

Polκ 1 无缺失与碱基取代之缺损DNA合成，非同源末端连接。

Polη 1 无跨越胸腺嘧啶二聚体损伤的跨损DNA合成，这是一种比较

精确的DNA复制。

Polι 1 无细胞减数分裂期间发生的跨损DNA合成。

Polν 1 无可能参与DNA交联修复（cross-link repair）。

Rev1 1 无具有脱氧胞苷转移酶活性，可催化脱碱基位点合成

（abasic site synthesis）。此即是说在缺失碱基的核苷酸

之对应位置上，插入一个胞苷（C）。

TdT 不需要模板便能催化dNTP的聚合作用，合成同聚物尾

巴。

_____________________________________________________________________________

不同类型的真核DNA聚合酶，对特定抑制剂的抑制作用，存在着不同的敏感性。例如2，，3，-双脱氧核糖核苷酸（dideoxyribonucleotide），可以强烈地抑制Polβ和Polγ的催化活性，而另一种抑制剂蚜肠菌素（aphidicolin），则能够阻断Polα、Polδ和Polε的催化活性。因此，特定抑制剂对DNA聚合酶的抑制效应，为DNA聚合酶的分类提供了有价值的参考依据。

（2）参与真核DNA复制的DNA聚合酶

Polα、Polδ和Polε，是参与染色体DNA复制的三种必不可少的真核DNA聚合酶。所有真核生物的Polα，都是由4个亚基组成的蛋白质复合物，包括2个亚基的DNA聚合酶α和2个亚基的引发酶。由于这种蛋白质复合物既具有合成RNA引物又具有延长DNA新生链的双重功能，所以通常也称之为DNA聚合酶α/引发酶（Polα/primase）。DNA聚合酶α是由分子量为165kD和67～86kD的两个亚基构成的一种异源二聚体蛋白质。而DNA引发酶是在DNA合成引发阶段发挥功能作用的一种特殊的RNA聚合酶，它也是一种由分子量分别为58kD和48kD的两个亚基构成的异源二聚体蛋白质。当这种DNA聚合酶α/引发酶同染色体DNA复制起点结合之后，首先由引发酶活性催化合成出长度为10nt的RNA引物，形成RNA引物-模板连接体结构；接着DNA聚合酶活性便会在RNA引物之后延长出一段

30～40nt的DNA互补链，即所谓的起始DNA（initiation DNA，iDNA）。可见真核DNA聚合酶α的持续合成能力并不强，每次与DNA结合期间聚合的dNTP的数目至多也不超过100个。

除此之外，Polα/引发酶在DNA复制的协调、DNA损伤的修复以及细胞周期关卡（cell cycle checkpoints）等方面，也起到重要的作用。

另外两种参与真核DNA复制的重要的聚合酶Polδ和Polε，其持续合成能力要比较弱的Polα强得多。因此当Polα完成了起始DNA合成之后，很快就会被Polδ或Polε所取代，分别继续催化前导链和后随链的合成。这种在真核DNA复制起始阶段发生的DNA聚合酶类型的更替现象，叫做聚合酶替换（polymerase switching）（图5-25）。由此可知在真核DNA 复制叉部位，至少有3种不同类型的DNA聚合酶参与DNA的复制。但Polδ和Polε与Pol α不同，它们二者均具有3，→5，方向的核酸外切酶校正活性，可参与DNA损伤的修复。

图5-25 真核染色体DNA复制起始阶段DNA聚合酶的替换

（a）首先结合在模板链3，-末端的DNA聚合酶Polα的引发酶活性

催化合成出一段10nt的RNA引物。（b）接着Polα的聚合酶活性合

成一段30～40nt的起始DNA（iDNA）。（c）活动夹环装载器将PCNA

加到新合成的互补链的3，-0H末端，募集Polδ或Polε取代Polα/

引发酶。（d）Polδ或Polε继续延伸新链DNA。

Polδ和Polε之所以具有强势的持续合成能力，是依赖于一种叫做增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的辅助蛋白质的功能作用。这种蛋白质属于一类能够增进相关DNA聚合酶持续合成能力的复制因子，因此也叫做持续合成因子（processivity factor）。它在DNA活跃复制的增殖细胞核中含量相当丰富，可形成三聚体形式的环绕DNA分子的滑动夹环，把Polδ和Polε募集（recruitment）到DNA的复制部位，从而使Polδ或Polε的持续合成能力提高约40倍。

线粒体在进化上呈现双重特性，一方面它存在着与原核生物一样的环形的基因组DNA，另一方面它又具有与真核生物类似的DNA复制机理。在线粒体颗粒内部存在的DNA聚合酶Polγ，是由寄主细胞核基因组编码的。它是参与线粒体DNA复制与修复的惟一的一种蛋白质复合物。例如人类的Polγ便是一种异源三聚体蛋白质，包括一个分子量为140kD的催化亚基（Polγ-A），和两个分子量为55kD的辅助亚基（Polγ-B）。这两个辅助亚基的功能作用是促使Polγ紧密地结合在DNA序列上，以增强其持续合成的能力。催化亚基有两个主要的结构域：定位在聚合酶多肽链N-端的是3，→5，方向的核酸外切酶校正结构域，负责清除错配的核苷酸碱基；定位在聚合酶多肽链C-端的是聚合酶结构域，其功能是催化DNA新生链的合成。在这两个主要结构域之间有一段连接区，它通过与邻近辅助亚基接触的方式，促使Polγ DNA聚合酶同线粒体DNA结合，从而增进其持续合成能力。

由真核基因编码的线粒体DNA聚合酶γ，与其他的真核DNA聚合酶一样，也能够利用合成的RNA引物-模板连接体结构，将反应体系中游离的dNTP参入到新生链上自由的3，-0H 末端基团。这种聚合酶对其抑制剂2，，3，-双脱氧核糖核苷酸的抑制作用相当敏感，但却能抗御另一种抑制剂蚜肠菌素的抑制作用。氨基酸序列分析显示，Polγ同PolA家族的成员，诸如PolⅠ和T7 DNA聚合酶之间，存在着同源性关系。

人类线粒体DNA聚合酶Polγ的催化亚基Polγ-A和辅助亚基Polγ-B，分别由位于细胞核染色体基因组上的P0LG1和P0LG2基因编码的。这两个基因如若发生突变，就将导致线粒体疾病的发生。例如P0LG1基因突变引起线粒体功能障碍（mitochondrial disorder）。许多严重的疾病，诸如肌病（myophaty）、智力功能障碍（mental disorder）、神经性疾病（neuropathy）、绝经期提前（premature menopause）以及怕金森综合征（Parkinsonism）等，都与P0LG1基因突变有关。

（3）参与真核DNA损伤修复的DNA聚合酶

真核细胞X家族的DNA聚合酶，广泛地存在于脊椎动物、植物和菌物中。这个家族DNA 聚合酶的主要功能是参与DNA损伤的修复，而不是DNA的复制。此外，其中的Polβ和Pol λ这两种DNA聚合酶，还具有5，-脱氧核糖磷酸裂合酶（5，-deoxyribose phosphate lyase），简称dRP裂合酶的活性。X家族中的Polβ、Polλ和Polμ三个成员，虽然在总体结构上十分类似，但由于也存在着一些细微结构的差别和具有不同的组织特异性表达的缘故，所以便呈现出一些不同的特性（表5-5）。

表5-5 X家族DNA聚合酶Polβ、Polλ和Polμ的基本特性

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Polβ Polλ Polμ

_____________________________________________________________________________ 编码基因 P0LB（～33kb）P0LL（～9kb） P0LM（～4kb）

蛋白质分子量 39kD 68kD 55kD

聚合作用速率 10-14nt/秒 2nt/秒 0.006-0.076nt/秒DNA底物具有3，-0H和5，-P 具有3，-0H和5，-P 具隐蔽末端的DNA；不末端基团的1nt单末端基团的单链缺口；存在互补关系的末端连

链缺口带有配对末端的不连接；不依赖于模板的

续模板 DNA合成

细胞作用碱基切除修复非同源末端连接；可非同源末端连接；可变

变区（高变区）连接区（高变区）连接区重

区重组组

在小鼠中缺失因有丝分裂后神小鼠存活；免疫球蛋小鼠存活；免疫球蛋白经元大规模凋亡白重链加工缺陷轻链加工缺陷

而使小鼠死亡

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（引自J.Yamtich and J.B.Sweasy,2010）

在人类中，PolβDNA聚合酶是一种单亚基多肽。全长335个氨基酸残基组成的多肽链，

可分成两个结构域：N-端结构域具有dRP裂合酶活性，C-端结构域具有核苷酸转移酶活性。

Polβ酶的编码基因P0LB定位在8号染色体的p11区。在小鼠中发现，如若P0LB基因从染色体上缺失，便会引起有丝分裂后神经元（postmitotic neurons）大量凋亡，最终导致小鼠死亡。PolβDNA聚合酶是按照模板指导（template-directed）的方式，催化DNA链的合成。由于该酶能够与具不同结构特征的DNA底物结合，因此对于具有隐蔽末端、单链切口及单链缺口等不同形式的DNA损伤修复，均可发挥功能作用。但它的主要功能却是参与

碱基切除修复过程中产生的、具有3，-0H和5，-P末端基团的单核苷酸缺口的填补。

PolλDNA聚合酶也是一种单亚基的多肽，其编码基因P0LL定位在10号染色体的q23区。该酶通常按照依赖于DNA模板的方式催化DNA新生链的合成，但并不具有校正的活性。近年来还报导，Polλ也具有不依赖于模板链的末端转移酶活性。如同Polβ一样，Polλ亦能够参与修复具有3，-0H和5，-P末端基团的单链缺口。与Polβ不同的是，Polλ还能够使用具有配对引物末端（paired primer teminus）的不连续的DNA模板（discontinuos DNA template），催化新生链DNA的合成。因此，Polλ适于参与非同源末端连接（non-homologous end-joining,NHEJ），和可变区（高变区）连接区重组（variable-diversity-joining recombination）（简称VDJ重组）。

Polμ与Polβ及Polλ两种DNA聚合酶一样，都是属于一种单亚基的DNA聚合酶，其编码基因P0LM定位在7号染色体p13区。该酶可以按照依赖于模板和不依赖于模板两种不同的机理，催化DNA新生链的合成，但它不具备校正活性。此外与Polλ一样，Polμ也具

有末端转移酶活性。除了这些活性之外，Polμ还能够使用非配对的引物末端（unpaired primer terminus）和不连续的DNA模板，催化DNA新生链的合成。因此，Polμ同样也适于参与非同源末端连接和可变区（高变区）连接区重组。

X家族DNA聚合酶的第4个成员末端脱氧核苷酸转移酶（TdT），也叫做末端转移酶（terminal transferase），是一种从小牛胸腺中分离出来的特殊的真核DNA聚合酶。它能够在没有模板的条件下，将反应体系中游离的脱氧核糖核苷三磷酸dNTP，逐个地加到DNA 分子的3，-单链延伸末端自由的3，-0H基团上，催化5，→3，方向的DNA聚合作用。而且末端转移酶还是一种非特异性的酶，4种dNTP中的任何一种都可作为它的底物。因此，如若反应体系中只存在一种游离的脱氧核糖核苷三磷酸，如dATP，便可被TdT聚合形成同聚物尾巴poly（dA）

除了上述提到的这八种DNA聚合酶之外，其他类型的真核DNA聚合酶的主要功能都是参与DNA损伤的修复。诸如碱基切除修复、碱基错配修复、双链断裂修复以及跨损DNA合成等。

（4）依赖于RNA的DNA聚合酶

依赖于RNA的DNA聚合酶，也叫做RNA指导的DNA聚合酶或反转录酶（reverse transcriptase）。已经从许多种RNA肿瘤病毒中分离到这种酶，但最普遍使用的则是来源于禽成髓细胞瘤病毒［avian myeloblastosis virus（AMV）］的反转录酶。它含有α和β两个亚基，其分子量分别为65 kD和95 kD。

其中α亚基具有反转录酶和RNaseH活性。RNaseH是α亚基经蛋白酶水解切割之后产生

的一种多肽片段（分子量为24 kD），具有核糖核酸外切酶活性。它可以按5，→3，或3，→5，的方向特异地降解RNA-DNA杂种分子中的RNA链。β亚基则具有以RNA-DNA杂交分子为底物的5，→3，方向的脱氧核酸外切酶活性。

反转录酶是分子生物学中最重要的核酸酶之一，它的5，→3，方向的聚合酶活性，取决于有一段引物和一条mRNA模板分子的存在。所以这种酶能够利用已同oligo（dT）（寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷）退火的、具poly（A）的mRNA作模板，合成新生的DNA链。反转录酶同样还能利用单链DNA或RNA作模板，合成供实验用的分子探针。在这些反应中的引物可以是oligo（dT），也可以用大量的随机形成的寡聚脱氧核苷酸的混合物。应用各种各样的这类寡聚脱氧核苷酸，以便确保它们当中必有一部分能够同模板核苷酸中的序列互补。在与模板退火之后，这些寡核苷酸便可供作反转录酶的引物。由于不同的寡核苷酸是同模板中的不同序列结合，因此所形成的DNA以等同的频率代表着模板的各个部分（至少在理论上是如此）。而且随机的寡核苷酸，可以作为任何单链DNA或RNA模板的引物。相反地，oligo（dT）则只能同poly（A）结合，以引导DNA的合成。这便是在mRNA模板3，-末端合成DNA互补序列的主要方式，

以mRNA模板合成cDNA，是反转录酶的主要用途。此外，还可以用来对具5，突出末端的DNA片段作末端标记。

3. DNA聚合酶催化作用的分子机理

（1）DNA聚合酶的三维结构

DNA分子是由DNA聚合酶催化合成的。因此，要深入了解DNA聚合酶催化作用的分子机理，弄清它的三维结构显然是十分必要的。

当DNA聚合酶同其底物结合之后，便会形成特殊的DNA-蛋白质复合物。对这类复合物进行的晶体学研究发现，在各种不同的DNA聚合酶中，活性区域的整体构象都比较相似，均呈现出有如人之右手的形状（图5-26）。它们都具有手掌域（palm domain）、拇指域（thumb domain）、手指域（fingers domain）、核酸外切酶活性域（exonuclease domain）和N-端终止域（N-terminal domain）等5个共有的结构域。无论是病毒、原核生物和真核生物的DNA聚合酶，还是反转录酶，乃至于RNA聚合酶，它们的活性区域都具有这样基本的三维结构特征。

图5-26 DNA聚合酶共有的三维结构

DNA聚合酶活性位点位于手指域和拇指域之间的手掌域上，因此新合成的DNA结合在手掌域。紧挨引物-模板双链区的单链模板上的头一个碱基，恰好位于同新参入的游离的dNTP对应的位置上。此头一个碱基与其5，上游的第二个碱基之间的磷酸二酯键，发生90O 的向外翻折，从而使其后面的所有单链模板上的碱基都远离活性位点，避免了与参入活性位点的dNTP发生碱基错配的可能性。

（2）DNA聚合酶聚合作用的分子机理

由手掌域、拇指域和手指域形成的大槽沟（large cleft），是底物DNA的结合部位。其中手掌域存在的一段重要的氨基酸保守基序，含有同参与催化作用之金属离子（通常是

Mg2＋或Zn2＋）特异性结合的酸性氨基酸，以及与引物末端和dNTP的α磷酸相互作用的氨基酸。这段保守的氨基酸序列是聚合酶催化DNA合成的活性位点（或称催化位点），因此新合成的DNA链是与手掌域相连的。手指域的功能是将未复制的单链模板DNA，正确地定位在手掌域中的活性位点上，此外，手指域的一部分也参与同参入的dNTP之间的结合作用。拇指域的功能是通过同引物-模板双螺旋区的结合，使得RNA引物自由的3，-0H末端，准确地定位在聚合酶激活位点中恰好与参入的dNTP相对的位置。同时，这样结合的结果，会使DNA聚合酶不易脱离DNA分子，因此它对于提高酶的持续合成能力也具有重要的意义。

（3）DNA聚合酶校正作用的分子机理

PolⅠ和PolⅢ这两种DNA聚合酶，都具有3，→5，方向的核酸外切酶活性，可以把刚参入的碱基错配的核苷酸，从新生链的3，-0H末端清除掉。DNA聚合酶校正碱基错配的分子基础是，它的手掌域除了催化聚合作用之外，还具有检测新参入的核苷酸碱基配对正确性的功能。其机理比较简单。当新参入的核苷酸与模板链上相应的核苷酸正确配对时，DNA聚合酶的手掌域便会与新合成的DNA小沟中的任何碱基对，形成大量的氢键，从而维持聚合酶同引物-模板连接体之间的稳定结合。如果新参入的核苷酸不能与模板链上相应的核苷酸正确配对时，便不会形成这类特殊的氢键。于是碱基错配的DNA不仅使聚合酶的催化活性降低，而且还会促使新合成的DNA引物链的3，末端与聚合酶活性位点的亲合力下降。但却提升了它与核酸外切酶活性域之活性位点的亲和力，并使核酸外切酶的活性增加10倍。结果导致引物-模板连接体从所结合的聚合酶活性位点上解脱下来，重新结合到聚合酶的核酸外切酶活性域上。这样便会在核酸外切酶活性域的催化作用下，将碱基错配的核苷酸从引物链的3，末端清除掉。在DNA聚合酶三维结构中，这个外切酶活性位点与手掌域中的催化DNA合成的活性位点相距甚远。DNA聚合酶的这种校正能力，对于确保DNA复制的保真性（fideliy）的提高，无疑具有重要的作用。

（本文选自吴乃虎、黄美娟“分子遗传学原理”第五章）