不同浓度苦参碱对肝癌细胞增殖及JAK_STAT信号通路的影响

下发生凋亡的内在活性有关[8]。

细胞周期是指连续分裂细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束所经历的整个过程,可分为间期和有丝分裂期,细胞间期又常划分为休眠期(G0),DNA合成前期(G1),DNA合成期(S),DNA合成后期(G2),整个周期可表示为G1→S→G2→M。细胞发生凋亡时,用P I对细胞进行染色,凋亡细胞由于总DNA量降低,于正常G0/G1细胞群前出现一DNA低染细胞群,即G1峰前出现亚二倍体峰(sub2G1),细胞凋亡群。在本实验中,细胞周期检测结果显示,与对照组相比,不同浓度的112羰基2β2乳香酸作用于HCT2116细胞后,都出现了sub2G1峰,有凋亡细胞群产生;G2/M期的细胞比例也明显的增多,表明经药物作用后,细胞周期被阻滞在G2/M期。由此可推测,112羰基2β2乳香酸通过诱导细胞发生凋亡而阻断了细胞周期,使细胞的增殖被抑制。由于细胞凋亡的过程受多种因子的调控,112羰基2β2乳香酸诱导细胞凋亡的分子机制有待进一步研究。

参考文献1　季宇彬.抗癌中药药理与临床.第1版.哈尔滨:黑龙江科学技术出版社,1999∶823～825

2　郭辉,张玲.乳香中化学成分和药理作用研究进展.食品与药品, 2007;9(05A)∶50～52

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8　T ol omeoM,Si m oniD.D rug resistance and apop t osis in cancer treat m ent :Devel opment of ne w apop t osis-inducing agents active indrug resistant ma2 lignancies.CurrMed Che m Canc A gents,2002;2(3)∶387～401

I nh i b itory effect of112carbonyl2β2boswelli c ac i d on HCT2116cell

He Ruiling,Zhang Juanjuan,M iu Shikun,W an L ihong,Zhou M in,Zhou L i m ing3

(W est2China M edical Center,Sichuan Uninversity,Chengdu　610041)

O bjecti ve:To investigate antitu mor effects of112carbonyl2β2bos wellic acid.M ethods:MTT assay and gr owth curve assay were used t o assess the inhibit ory effect of112carbonyl2β2bos wellic acid,the cell cycle and the cellular apop t osis were measured using fl ow cyt ometry.Re2 sults:The p r oliferati on of HCT2116was obvi ously inhibited in dose2dependent manner.112carbonyl2β2bos wellic acid can bl ock cell cycle. Annexin V/P I double staining showed that the apop t osis rate increased by HCT2116cells induced by112carbonyl2β2bos wellic acid48h later. Conclusi on:112carbonyl2β2bos wellic acid can inhibit the p r oliferati on of col on tu mor cell,induce HCT2116cells t o apop t osis and bl ock their cell cycle.

Key words　112carbonyl2β2bos wellic acid;HCT2116;apop t osis

不同浓度苦参碱对肝癌细胞增殖及JAK2ST AT信号通路的影响

蔡怀阳,殷　飞3,杜韶波,张瑞敏1

(河北医科大学第四医院消化内科,石家庄　050011;1河北省邯郸市中心医院,邯郸　056001)

摘　要　目的:观察不同浓度苦参碱对肝癌细胞S MMC27721增殖和JAK2ST AT通路的影响。方法:苦参碱作用于肝癌S MMC27721细胞,用M TT法检测不同浓度苦参碱对S MMC27721细胞增殖的抑制作用;RT2PCR法检测不同浓度苦参碱对S MMC2 7721细胞stat3、stat5、c2jun mRNA的影响,W estern bl ot法检测不同浓度苦参碱对肝癌S MMC27721细胞ST AT3、ST AT5、P2ST AT3、P2 ST AT5、C2JUN蛋白表达的影响。结果:苦参碱能够抑制S MMC27721细胞增殖,呈时间2剂量依赖性。苦参碱能下调stat3、stat5、c2 jun mRNA表达水平,降低ST AT3、ST AT5、P2ST AT3、P2ST AT5、C2JUN蛋白表达量,有剂量依赖性。结论:苦参碱不仅能直接杀伤肿瘤细胞,而且能抑制JAK2ST AT信号通路,从而抑制肿瘤细胞的增殖。

3通讯作者

关键词　苦参碱;肝癌;ST AT3;ST AT5

苦参碱(matrine,MA)有抗炎、抗病毒、抗纤维化的作用,临床上已用于肝炎的保肝治疗,有肯定疗效且毒副作用小[1～3]。近年研究显示,苦参碱能够抑制肝癌细胞增殖诱导凋亡,实验结果表明苦参碱能够抑制信号转导通路中某些蛋白激酶的表达和活化,阻滞引起细胞异常增殖分化的信号转导通路,从而进一步抑制细胞异常增殖,但当不同浓度的苦参碱作用后,其对JAK2ST AT信号通路及其下游信号的影响目前尚不清楚。

1　材料与方法

1.1　试验药物　苦参碱,山东振东金晶制药有限公司,白色粉末状,99%纯;

1.2　细胞　人肝癌细胞株S MMC27721,河北医科大学第四医院科研中心。

1.3　试剂　PCR引物(stat3、stat5、c2jun、β2actin),5OD/EP,上海生物工程公司合成;兔抗人ST AT3、ST AT5、C2JUN、β2actin多克隆抗体,山羊抗人P2ST AT3、P2ST AT5多克隆抗体,200ug/ 1m l,美国Santa Cruz公司。

1.4　仪器　PCR仪,Gene Amp9600型,美国PE公司,主要用于目的基因扩增,并对其进行定量半定量分析。UVP凝胶扫描系统,G DS28000,美国UVP公司,用于非化学发光染色的凝胶、平板、膜的图像采集、文件处理及分析。

1.5　方法　用含10%小牛血清、青霉素100u/m l、链霉素100 mg/m l的RP M I21640培养液培养人肝癌细胞株S MMC27721,置于37℃,5%CO

2

孵育箱中培养,3～4d传代一次,取对数生长期的细胞用于实验。

1.5.1　M TT法检测苦参碱对肝癌S MMC27721细胞株增殖影响　肝癌细胞株应用0.25%胰蛋白酶消化,P BS冲洗,取含2×104S MMC27721细胞悬液接种于96孔培养板,分别加入不同浓度苦参碱溶液,使其终浓度分别为0.1、0.5、1、2、4mg/m l,加RP M I21640培养液至100μl,另设空白孔(只加培养液100μl)和对照孔(只加细胞悬液100μl),每种浓度均作3个平行孔,混匀

后放入C O

2

孵箱中培养。分别于第24、48、72h各取出1板,培养结束前4h加入M TT(5mg/m l)10μl/孔,37℃继续孵育4h,离心弃上清,每孔加入DMS O150μl,震荡10m in,充分溶解结晶。用酶标检测仪测定各孔492n m的光密度值(OD492),根据公式:抑制率=(对照孔OD492值-用药孔OD492值)/对照孔OD492值×100%,计算抑制率。

1.5.2　RT2PCR法检测苦参碱对肝癌S MMC27721细胞stat3、stat5mRNA的影响　将5×105/m l细胞接种于培养瓶,24h后,弃除培养液,加入含不同浓度苦参碱的培养液,使其终浓度为0.5、1mg/m l,以不加药细胞做为对照。作用48h后收集细胞,提取细胞mRNA,进行纯度和完整性检测后进行反转录。stat3引物,上游引物:5’2att caa aca ctt gac cct ga23’,下游引物:5’2att gtt ggt cag cat gtt gt23’,扩增的目的片段长度为238bp。stat5引物,上游引物:5’2gat tctcag gaa aga atg tt23’,下游引物:5’2tgt gtc ctc cag atc gaa g23’,扩增的目的片段长度为387bp。c2jun上游引物: 5’2agt cca gca acg ggc aca tc23’,下游引物:5’2ctc ctg ctc atc tgt cac gtt ct23’,扩增的目的片段长度为80bp。β2actin上游引物:5’tgg cac cca gca caa tga a23’,下游引物:5’2cta agt cat agt ccg cct aga agc a23’,扩增的目的片段长度为186bp。反应条件:PCR的具体循环参数为:95℃5m in;95℃30s;61℃30s;72℃30s,循环35次,以后72℃延伸7m in。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,以目标基因与β2actin扩增产物的灰度值的比值表示基因表达水平。

1.5.3　W estern bl ot法检测苦参碱对肝癌S MMC27721细胞ST AT3、P2ST AT3、ST AT5、P2ST AT5、C2JUN蛋白表达的影响　细胞收集同RT2PCR,提取细胞总蛋白,考马斯亮兰定量,280℃冰箱冻存备用。上样,80V电压,4℃,样品在浓缩胶中电泳约1h, 150V电泳1.5h左右,直到溴酚蓝到达分离胶的底部,关闭电源。100V电压,转膜

2.5h。丽春红染色,5%脱脂奶粉室温振摇封闭1h。以T BS溶液稀释兔抗人ST AT3、ST AT5、C2JUN、β2 actin多克隆抗体(1:200),山羊抗人P2ST AT3、P2ST AT5多克隆抗体(1:80),按0.1m l/cm2加入一抗溶液,4℃过夜。按1:1000稀释二抗溶液,37℃,1h。T BS溶液振摇洗三次,每次10m in,在暗室中进行化学发光,胶片爆光显影后分析结果。以目的蛋白与β2actin的灰度比值表示蛋白表达水平。

2　结果

2.1　不同浓度苦参碱对肝癌S MMC27721细胞增殖的影响　不同浓度苦参碱作用于肝癌S MMC27721细胞24h、48h、72h,抑制率呈浓度2时间依赖性(见表1)。苦参碱0.5mg/m l、1mg/m l 作用48h后,抑制率分别为(26.25±8.15)%,(36.96±6.

88)%,用于进行后续实验。

表1　不同浓度的苦参碱作用于肝癌S MMC27721细胞不同时间的抑制率( x±s,%)

时间0.1mg/m l0.5mg/m l1mg/m l2mg/m l4mg/m l

24h10.59±1.88 18.65±2.14 29.98±3.36 32.21±4.39 48.65±2.17 48h15.00±2.103326.35±2.333336.96±6.883343.51±6.503364.60±5.8633 72h22.50±2.02△△38.08±3.20△△44.57±8.18△△56.93±5.54△△70.45±3.61△△ 3P<0.05,33P<0.01vs48h;△P<0.05,△△P<0.01vs72h

2.2　不同浓度苦参碱对肝癌S MMC27721细胞stat3、stat5、c2 jun mRNA表达的影响　苦参碱(0.5mg/m l、1mg/m l)作用于肝癌S MMC27721细胞48h后,stat3mRNA表达量均有明显下降,与对照组比较差异有显著性(P值分别为0.000,0.000)。stat5 mRNA表达量均有明显下降,与对照组比较差异有显著性(P值分别为0.001,0.000)。c2jun mRNA表达量均有明显下降,与对照组比较差异有显著性(P值分别为0.000,0.000)。苦参碱(1mg/m l)组stat3、stat5、c2jun mRNA表达量较苦参碱(0.5mg/ m l)降低,差异有显著性(P值分别为0.017,0.026,0.032),见表2,图1。

表2　不同浓度苦参碱作用后stat3、stat5、c2jun mRNA的表达情况( x±s)

组别 stat3stat5c2jun

对照组0.478±0.0190.437±0.0330.404±0.039

苦参碱(0.5mg/m l)0.402±0.0120.369±0.0300.336±0.036

苦参碱(1mg/m l)0.375±0.03630.341±0.02830.322±0.0183

图1　不同浓度苦参碱作用后stat3、stat5、c 2jun mRNA 的表达

1对照组,2苦参碱(0.5mg/m l ),3苦参碱(1mg/m l )

2.3　W estern bl ot 检测不同浓度苦参碱对肝癌S MMC 27721细

胞ST AT3、ST AT5、P 2ST AT3、P 2ST AT5、C 2JUN 蛋白表达的影响　

苦参碱(0.5mg/m l 、1mg/m l )作用于肝癌S MMC 27721细胞48h 后,ST AT3、ST AT5、P 2ST AT3、P 2ST AT5、C 2JUN 蛋白表达量均有下

降,与对照组比较差异有显著性。苦参碱(1mg/m l )组ST AT3、

ST AT5、P 2ST AT3、P 2ST AT5、C 2JUN 蛋白表达量较苦参碱(0.5mg/m l )降低,差异有显著性(P 值分别为0.027,0.036,0.014,0.008,0.011),见表3,图2。

表3　不同浓度苦参碱对ST AT3、ST AT5蛋白表达的影响( x ±s )

组别

ST AT3ST AT5P 2ST AT3P 2ST AT5C 2JUN 对照组

0.700±0.0280.666±0.0390.539±0.0240.510±0.0220.522±0.041苦参碱(0.5mg/m l )0.601±0.0440.593±0.0360.467±0.0280.442±0.0320.450±0.045苦参碱(1mg/m l )

0.567±0.0493

0.545±0.0333

0.432±0.0233

0.404±0.0213

3

0.419±0.031

3

图2　不同浓度苦参碱作用后ST AT3、ST AT5蛋白的表达

(1对照组,2苦参碱0.5mg/m l,3苦参碱1mg/m l )

3　讨论

苦参碱提取自豆科植物苦参的干燥根,现代药理研究表明苦参碱具有广泛的药理作用,其中对肿瘤细胞的诱导分化及凋

亡方面的作用,近年来受到了极大的关注[4]。苦参碱抑制肿瘤细胞增殖[5];通过影响粘附分子的表达及抑制血管内皮细胞增殖而起到抑制肿瘤转移的作用[6]

;诱导肿瘤细胞分化和凋

亡

[7]

;影响肿瘤细胞中端粒酶和bcl 22,bax 表达[8]

;逆转肿瘤细

胞多药耐药性;调节机体免疫功能等方面。目前细胞信号转导受到广泛重视,苦参碱通过多种途径起到抗肿瘤作用,其作用机制可能与信号转导途径有关。有研究表明,苦参碱作用后

K562细胞中I L 26和ST AT3基因的表达均呈现下降的趋势,提示苦参碱可能通过下调该通路相关分子的表达,抑制细胞数量的增加[9]。刘北忠等[10]报道在苦参碱诱导K562细胞分化的过程中,苦参碱可特异性地抑制蛋白酪氨酸激酶的活性。苦参碱对肝癌的抑制作用也有较多研究[11～13],本研究显示不同浓度苦参碱作用于S MMC 27721细胞,能够从基因水平抑制stat3、

stat5的表达,进而影响ST AT3、ST AT5蛋白的转录,抑制ST AT3、ST AT5的磷酸化,阻断其下游信号C 2JUN 的传递,苦参碱浓度

越高,抑制作用越明显。C 2JUN 是JAK 2ST AT 途径中的下游信号,是发挥效应的传递途径中的重要一环。这些结果表明苦参

碱能够抑制JAK 2ST AT 信号转导通路中的重要蛋白激酶

ST AT3、ST AT5的活化,阻断其信号通路向下游的信号传递,进

而阻滞了肝癌细胞中异常活跃的信号转导通路,阻断了肝癌的增殖。

本实验研究了苦参碱对肝癌JAK 2ST AT 信号通路的作用,但苦参碱抑制肝癌是否还有其它信号途径的参与,以及这些信号通路与JAK 2ST AT 信号通路的相互关系尚不清楚,苦参碱的多靶点抑制肝癌作用尚待进一步研究。

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指标的变化.中国误诊学杂志,2007;7(3)∶422～424

D i fferen t den sity ma tr i n e to li ver cancer cell m ulti pli ca ti on and JAK 2STAT si gna l tran sducti on i n fluence

Cai Huaiyang 1

,Yin Fei 1

,Du Shaobo 1

,Zhang Rui m in

2

(1Depart m ent of Gastr oenter ol ogy,the Fourth Hos p ital of HebeiM edical University .Shijiazhuang 050011;

2

Handan T own Center Hos p ital of Hebei Pr ovince,Handan 056001)

O bjecti ve:To observe the effect of matrine on cell p r oliferati on and JAK 2ST AT signaling transducti on path way in S MMC 27721cells .

M ethods:Treated with different concentrati on matrine,the inhibit ory on p r oliferati on was detected byMTT,the mRNA exp ressi on of stat3,stat5,c 2jun in S MMC 27721cells was assessed with RT 2PCR.W estern bl ot detected the p r otein exp ressi on of ST AT3,ST AT5,P 2ST AT3,P 2ST AT5,C 2JUN in S MMC 27721cells .Results:Matrine significantly inhibited S MMC 27721cells p r oliferati on in ti m e and dose 2dependent manner .Matrine could degrade the exp ressi onal levels of stat3,stat5,c 2jun mRNA and ST AT3,ST AT5,P 2ST AT3,P 2ST AT5,C 2JUN p r o 2tein in dose 2dependent manner .After treat with matrine,the fluorescence intensity of ST AT3,ST AT5,P 2ST AT3,C 2JUN was significantly weaker than that in contr ol gr oup,The high dose gr oup was more obvi ously .Conclusi on:Matrine could significantly down 2regulate the mR 2NA exp ressi onal evels of stat3,stat5in S MMC 27721cells and decrease the phos phorylati on of ST AT3and ST AT5p r otein and bl ock their downstrea m signal C 2JUN,thus it could inhibit the p r oliferati on of S MMC 27721cells .Key words matrine;hepat ocellular carcinoma;ST AT3;ST AT5

鼠胃肠丹参酮II A 吸收测定方法研究

3

李晓光,李兴平133

,吕玄芬2

,邓文龙

1

(成都大学生物产业学院,成都　610106;1四川省中医药科学院,成都　610041;

2

北京宝泰宁堂生物技术有限公司,成都　610041)

摘　要　目的:建立丹参酚酮片中丹参酮ⅡA 在大鼠胃肠道吸收的含量测定方法。方法:采用HP LC 法测定大鼠胃肠道循环灌注液中丹参酮II A 含量的变化。结果:丹参酮ⅡA 在大鼠胃肠道灌注液中48h 内稳定,平均加样回收率为99.0%,日内、日间精密度RS D 分别为0.3%、0.2%。结论:HP LC 简便、可靠、可用于大鼠胃肠原位循环灌注丹参酚酮片中丹参酮ⅡA 的含量测定。 关键词　丹参酮II A ;吸收;HP LC 丹参酮类成分为丹参的主要有效成分之一,其与丹参酚类成分的药理作用有同有异,一般研究中注意到丹参酚类成分的作用及体内过程,作为丹参总提取物必应考虑到丹参酮类成分的吸收与作用[1～8]。丹参全成分精制提取物丹参酚酮片包含应用超临界C O 2萃取的全部丹参酮类物质,且以丹参酮II A 为药理活性控制的主要有效指标之一,通过了解丹参酮II A 在大鼠胃肠道的吸收情况,对于其在体内药代动力学及生物利用度以评价药剂质量具有重要的意义。本文首先建立了丹参酚酮片中丹参酮ⅡA 在大鼠胃肠道中的含量测定方法。

1　材料与方法

1.1　试验药物　丹参酚酮片,规格100mg/片,批号:080101,

北京宝泰宁堂生物技术公司提供。

1.2　仪器　Agilent 1100HP LC;超声波清洗仪(40KHz,200W )。

1.3　动物　S D 大鼠,一级,200～250g,由四川省中医药科学

院动物室提供,合格证号。

1.4　方法　丹参酮II A 对照品,中国药品生物制品检定所提

供(批号0766-200213,供含量测定用)。

1.4.1　丹参酮II A 对照品溶液　精密称取丹参酮II A 对照品

适量,置棕色量瓶,用乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,得每1m l 中含丹参酮II A 含量0.1mg,置冰箱冷藏(4℃)保存为对照品储备液。取对照品储备液2m l,置棕色量瓶,用乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,得每1m l 中含丹参酮II A 32μg 。

1.4.2　胃/肠灌注液　取丹参酚酮片4片和2片,分别研细,

加8%预胶化淀粉溶液5m l,研磨均匀,转移至m l 量瓶,用8%预胶化淀粉溶液洗涤数次,合并洗涤液至量瓶,加8%预胶化淀粉溶液至刻度,摇匀,即得。

1.4.3　胃药液　选取实验前禁食不禁水24小时的S D 大鼠,

3

2006年四川省科技攻关项目 33通讯作者