外源碳源和盐度对微拟球藻QA2生长和油脂积累的影响_王通

植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (9): 909~916909

收稿 2013-05-10 修定 2013-07-04

资助 国家重点基础研究发展计划课题(2011CB200904)、山东

省自然科学基金(ZR2011CM010)和青岛农业大学人才基金(630743)。

*

通讯作者(E-mail: qdyiyanjun@https://www.360docs.net/doc/5e14359230.html,; Tel: 0532-********)。

外源碳源和盐度对微拟球藻QA2生长和油脂积累的影响

王通1, 刘帅帅1, 刘家尧1, 刘建国2, 衣艳君1,*

1

青岛农业大学生命科学学院, 山东省高校植物生物技术重点实验室, 山东青岛266109; 2中国科学院海洋研究所, 山东青岛266071

摘要: 微藻因生长速度快、含油量高、可作为生物柴油的优质原料而备受关注。本实验以一株海洋微拟球藻QA2为材料, 研究了外源碳源的种类和浓度对其生长和油脂积累的影响。结果表明, 以NaHCO 3、CH 3COONa 和Na 2CO 3为外源碳源均能促进QA2藻株的生长, 但以培养液中添加15 mmol·L -1 CH 3COONa 对QA2藻株的生长和油脂积累的促进作用最为明显, 总脂和脂肪酸的日产率分别是对照的2.73倍和5.67倍。同时利用叶绿素荧光技术研究了盐度对QA2光合作用的影响, 表明QA2对盐度有较宽的适应范围, 盐度在1.5%~6.0%范围内, 不会对油脂产率造成明显的影响, 但盐度增加能抑制QA2藻株PSII 的电子传递, 引起反应中心色素和捕光色素的降解, 影响QA2的光合作用和生长, 可见QA2培养的最适盐度应为3.0%。这为开放式规模培养微藻及其相关研究提供依据和参考。关键词: 微拟球藻; 碳源; 盐度; 生长; 油脂积累

Effects of Exogenous Carbon Sources and Salinity on the Growth and Oil Ac-cumulation of Nannochloropsis sp. QA2

WANG Tong 1, LIU Shuai-Shuai 1, LIU Jia-Yao 1, LIU Jian-Guo 2, YI Yan-Jun 1,*1

University Key Laboratory of Plant Biotechnology in Shandong Province, College of Life Sciences, Qingdao Agricultural University, Qingdao, Shandong 266109, China; 2Institude of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao, Shandong 266071, China

Abstract: Microalgae lipids are regarded as the feedstock for sustainable biodiesel production because microal-gae had much higher growth rate and photosynthetic efficiency than conventional terrestrial plants. In this study, a marine microalgae strain (Nannochloropsis sp. QA2) was used to study the type and concentration of exogenous carbon source to its growth and oil accumulation in an autotrophic culture condition. The results showed that the strain QA2 could use Na 2CO 3, NaHCO 3 or CH 3COONa as a carbon source to promote the mi-croalgae growth. Further study revealed that the daily yield of total lipid and fatty acid were 2.73-fold and 5.67-fold increase respectively when the CH 3COONa at 15 mmol·L -1 was added. The effect of salinity on the photo-synthesis of the strain QA2 was analyzed by chlorophyll ? uorescence, and the results showed that the optimal salinity of the strain QA2 was 3.0%, although the QA2 had a wide range of salinity adaptation (1.5% to 6.0%), and no signi ? cant effect of the salinity on the oil production of QA2 was observed. With the increase of salinity the electron transfer of PSII was inhibited, which caused the degradation of the reaction center pigments and light harvesting pigments. This study also provided a theoretical basis for an outdoor open scale cultivation of microalgae.

Key words: Nannochloropsis sp.; carbon sources; salinity; growth; oil accumulation 生物柴油作为一种可再生的生物新能源, 已受到广泛关注。目前, 正面临原料供应不足这个“瓶颈”问题, 寻找新一代生物柴油原料已迫在眉睫。微藻生长速度快、周期短、油脂含量高, 已成为人们青睐的生物柴油原料之一(李建等2012; 杨忠华等2012)。我国具有广阔的海域, 海洋微藻资源丰富, 为开发利用微藻生产生物柴油奠定了基础。

微藻细胞内的油脂是以CO 2为起始反应物经

一系列的代谢反应而合成的。微藻利用细胞表面的碳酸酐酶将HCO 3?转化成CO 2再被1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPCase)固定(Blanco-Rivero 等2012), CO 2、Na 2CO 3、NaHCO 3和CH 3COONa 等多

植物生理学报910

种外来碳源可被微藻利用(Babich等2011; Devgo-swami等2011; 赵华等2012)。郑洪立等(2011)研究

了3种无机碳源Na

2CO

3

、NaHCO

3

和CO

2

及其初始

浓度对小球藻(Chlorella vulgaris)产油特性的影响,

发现CO

2是最佳无机碳源, CO

2

浓度为6%时小球藻

生长最快, 生物量和产油量都达到最高。Barghba-

ni等(2012)的研究表明, 低浓度的NaHCO

3

能够促进微藻的生长, 浓度超过6.0 g·L-1则无法生长。蔡佳佳等(2011)在SE培养基中添加30 mmol·L-1的

CH

3

COONa, 小球藻(Chlorella sp.)的生物量提高了200%, 油脂含量提高了120%。虽然目前有关外源碳源对微藻生长和油脂含量影响有一些研究, 但微藻种类和藻株不同, 研究结果也各不相同。

QA2是由本实验室分离纯化的一株海洋微绿藻, 该藻株生长周期较短(8 d), 油脂含量高(总脂占干重42%), 是非常有希望用于工业化生产生物柴油的藻株。为此, 我们对该藻株进行了多种环境因子的优化培养, 本文主要报道添加外源碳源对

其生长及油脂积累的研究结果。QA2藻株采用L

1 (Guillard和Hargraves 1993)海水培养基进行基础培养。在室外开放式养殖时, 水分的蒸发极易导致培养液盐度的升高。由于盐度能影响微藻的渗透压、对营养盐的吸收以及悬浮性(茂华等2007), 过高或过低均会影响藻细胞的正常代谢, 甚至导致死亡(Xu和Beardall 1997), 因而, 生产上需要不断补充淡水以降低盐度。另外, 盐度也能影响藻细

胞固定CO

2

的速度和碳酸酐酶的活性, 进而影响脂肪酸的合成(朱松玲和王怡洁2005)。因此, 本文同时也研究了不同盐度对QA2生物量、总脂及脂肪酸含量的影响, 明确适宜QA2生长的盐度范围, 为大规模培养和节约用水提供资料。

材料与方法

1实验材料与培养

QA2是本实验室筛选出来的一株高含油量藻株, 经鉴定属于真眼点藻纲(Eustigmatophyceae), 微拟球藻属(Nannochloropsis)。藻种保存于青岛农业大学生命科学学院植物逆境生物学实验室。藻

种用L

1

培养基培养, 海水取自青岛近海海域, 经过滤和高压灭菌后使用。培养条件为光照周期14 h/10 h, 温度(23±1) ℃, 光强75 μmol·m-2·s-1, 每天定时摇瓶4次。2外源碳源的添加

以L

1

培养基为基础, 取处于对数生长期的

QA2藻液分别接种到添加5 mmol·L-1的NaHCO

3

、

CH

3

COONa和Na

2

CO

3

的培养液中培养, 筛选最佳

碳源。另以L

1

培养基为基础, 分别添加浓度梯度为

0、1、3、5、7、10、15、20 mmol·L-1的CH

3

-COONa和浓度梯度为0、1、3、5、7、10、15

mmol·L-1的Na

2

CO

3

, 取对数生长期QA2藻液分别加入上述培养液中培养, 筛选最佳碳源浓度。所有实验均设3个重复。

3盐度实验

盐度设为5个梯度: 1.5%、3.0%、4.0%、

5.0%和

6.0%。以L

1

海水培养基(盐度约3.0%)为基础, 通过稀释和浓缩来配制培养液的盐度。取对数生长期QA2藻液离心去上清, 分别加入上述培养液中培养, 并设3个重复。

4生物量测定

每天定时用紫外可见分光光度计测定藻液在750 nm处的吸光度(OD) (Salim等2011), 用血球计数法计算小球藻细胞密度, 并制作生长曲线。每个测定设3个重复。用公式K(OD·d-1)=(㏒OD t–㏒

OD

)/t×3.322计算微藻的平均生长速度(张桂艳等2011), 用公式G(d)=0.301/K计算平均倍增时间(黄

翔鹊等2002), OD

为初始吸光度, OD

t

为培养t天后的吸光度, t为培养天数。

5 总脂及脂肪酸含量测定

总脂提取采用Folch的方法(Chen等2009); 脂肪酸甲酯化采用硫酸-甲醇法(王九思等2002)。脂肪酸检测使用GC112A型气相色谱仪, 色谱柱: DM-FFAP, 30 m×0.25 mm×0.25 μm; 程序升温条件: 初始温度110 ℃, 以20 ℃·min-1速率升至150 ℃并停留2 min, 再以4 ℃·min-1速率升至230 ℃并停留8 min。载气为高纯度氮气, 流速为90 mL·min-1, 进样量1 μL, 内标为C17, 设3个重复。

6油脂产率计算

用下列公式计算总脂和脂肪酸的日产率: 总脂日产率(mg·L-1·d-1)=生物量(mg·L-1)×总脂含量(%)/培养时间(d); 脂肪酸日产率(mg·L-1·d-1)=生物量(mg·L-1)×脂肪酸含量(%)/培养时间(d)。

7 叶绿素a荧光参数的测定

快速叶绿素荧光诱导动力学曲线用便携式植物效率分析仪(Handy PEA; 英国)测定, 激发光波

王通等: 外源碳源和盐度对微拟球藻QA2生长和油脂积累的影响911

长为650 nm 。测定方法按照本实验室之前已建立的方法(丁彦聪等2011)。叶绿素a 荧光参数由Handy PEA 软件直接从测定的叶绿素荧光快速诱导动力学曲线中获得。8 统计分析

利用SPSS13.0和Excel 软件对数据进行处理分析。

实验结果

1 外源碳源对QA2藻株生长及油脂积累的影响1.1 不同碳源对QA2藻株生长及油脂积累的影响培养液添加5 mmol·L -1 CH 3COONa 、NaHCO 3

和Na 2CO 3三种碳源后, QA2藻株的生长曲线(图1)显示, 实验选用的3种碳源均能促进QA2藻株的生长。其中, CH 3COONa 对QA2藻株生长的促进作用最为明显, 虽然在添加的最初2 d, 由于培养液中pH 的升高, 导致QA2藻株的生长速度略低于对照, 但随培养时间的延长, 藻细胞的浓度迅速增加, K 值为0.184, G 值为1.636 (表1), 达稳定期后, 生物量是对照的1.7倍。添加外源NaHCO 3和Na 2CO 3也分别促进了其生长, 稳定期的生物量分别是对照的1.39和1.40倍。

其总脂和脂肪酸的日产率, 结果显示添加CH 3COONa 后, QA2的总脂和脂肪酸的日产率分别是对照的2.0和2.4倍(图3)。添加Na 2CO 3后, QA2的总脂和脂肪酸的日产率分别是对照的2.1和1.7倍(图3)。培养液添加NaHCO 3后, 虽然QA2的总脂和脂肪酸的日产率同对照相比也有所提高, 但效果明显低于培养液中添加Na 2CO 3和CH 3COONa, 因此, 本研究选择培养液中添加Na 2CO 3和CH 3COONa 进行进一步实验。

表1 不同碳源培养下QA2藻株生长速度及平均倍增时间Table 1 Growth rate and the double time of Nannochloropsis

sp. QA2 in different carbon sources

处理

平均生长速度(K )/OD·d -1 平均倍增时间(G )/d

对照

0.148 2.0345 mmol·L -1

Na 2CO 3 0.158

1.9055 mmol·L -1

NaHCO 3 0.156 1.929

5 mmol·L -1

CH 3COONa 0.184 1.636

图1 不同碳源对QA2藻株生长的影响

Fig.1 Effects of different carbon sources on the growth of

Nannochloropsis

sp. QA2

培养液添加5 mmol·L -1 CH 3COONa 后, QA2藻株的总脂和脂肪酸含量明显高于对照, 其中脂肪酸含量比对照增加了23.5% (图2)。添加5 mmol·L -1 Na 2CO 3后, 其总脂含量得到明显提高(图2)。综合分析

图2 不同碳源对QA2藻株总脂及脂肪酸含量的影响Fig.2 Effects of different carbon sources on the total lipid and

fatty acid contents of Nannochloropsis

sp. QA2

图3 不同碳源对QA2藻株总脂和脂肪酸的日产率影响Fig.3 Effects of different carbon sources on the daily total

lipid yield and daily fatty acid yield of

Nannochloropsis

sp. QA2

植物生理学报

9121.2 Na 2CO 3和CH 3COONa 添加浓度对QA2生长及油脂积累的影响

培养液中CH 3COONa 添加浓度在1~15 mmol·L -1范围内均能促进QA2的生长, 浓度为7 mmol·L -1时, QA2的K 值最大, G 值最小, 收获期(培养10 d)的细胞密度

是对照的1.75倍(表2、图4)。浓度高于15 mmol·L -1时, 培养液pH 偏高, 反而影响生长, 甚至导致藻细胞死亡。与CH 3COONa 的影响相似, 培养液中添加浓度在1~15 mmol·L -1范围内的Na 2CO 3时, 均能促进QA2的生长, 浓度为7 mmol·L -1时, QA2生长最快(表2、图5)。

添加外源CH 3COONa 后QA2藻株总脂含量随着添加浓度的增加呈现下降趋势, 脂肪酸含量则有所增加, 添加浓度为15 mmol·L -1时脂肪酸含量最高, 比对照提高了63% (图6)。综合分析其总脂和脂肪酸的日产率, 结果显示添加15 mmol·L -1 CH 3-COONa 后, QA2的总脂和脂肪酸的日产率分别是对照的2.73倍和5.67倍(图7)。不同浓度Na 2CO 3对QA2总脂及脂肪酸含量的影响, 表现为随着添加浓度的增加, 总脂和脂肪酸含量呈下降的趋势(图8)。在添加Na 2CO 3为7 mmol·L -1时, 总脂和脂肪酸

图4 不同浓度CH 3COONa 对QA2藻株生长的影响

Fig.4 Effects of different concentration of CH 3COONa on the

growth of Nannochloropsis

sp. QA2的日产率最高, 分别是对照的1.64倍和1.58倍(图9)。可见培养液中添加15 mmol·L -1 CH 3COONa 是提高QA2产油量的最佳方案。

2 盐度对QA2的光合作用、生长和油脂积累的影响2.1 盐度对QA2光合作用的影响

室外开放式养殖时, 水分的蒸发极易导致培养液盐度升高, 微藻对生活环境的盐度变化有一定的适应范围, 过高或过低均会影响其正常生长。一般而言, 海洋微藻能耐受约0.5 mol·L -1 NaCl 的渗透压(Xu 和Beardall 1997)。本研究测定了

图5 不同浓度Na 2CO 3对QA2藻株生长的影响

Fig.5 Effects of different concentration of Na 2CO 3 on the

growth of Nannochloropsis

sp. QA2

表2 不同浓度CH 3COONa 和Na 2CO 3培养下QA2藻株的平均生长速度及平均倍增时间

Table 2 Growth rate and the double time of Nannochloropsis sp. QA2 in different concentration of CH 3COONa and Na 2CO 3

CH 3COONa/ 平均生长速度(K )/

平均倍增 Na 2CO 3/ 平均生长速度(K )/

平均倍增 mmol·L -1

OD·d -1

时间(G )/d mmol·L -1

OD·d -1

时间(G )/d

0 0.133 2.263 0 0.199 1.513 1 0.161 1.870 1 0.210 1.433 3 0.185 1.627 3 0.219 1.374 5 0.201 1.498 5 0.230 1.309 7 0.207 1.454 7 0.266 1.13210 0.163 1.847 10 0.221 1.36215 0.142 2.120 15 0.229 1.31420 0.083 3.627

王通等: 外源碳源和盐度对微拟球藻QA2生长和油脂积累的影响913

QA2在不同盐度下的叶绿素荧光动力学曲线, 获得了各项叶绿素a 荧光参数值(表3), 结果显示, QA2生长的最适盐度约为3.0%, 随盐度的增加, QA2 PSII 最大光化学效率(F v /F m )、单位面积内反应中心的数量(RC/CS 0)、光合机构单位面积捕获的能量(TR 0/CS 0)、单位面积用于电子传递的能量(ET 0/CS 0)、光合机构电子传递的量子产额(ET 0/ABS )以

及以吸收光能为基础的性能指数(PI ABS )均呈现不同程度的降低(P <0.05)。分析其叶绿素a 荧光参数的变化, 发现盐度的增加, 首先是影响了微藻的电子传递速率, 然后引起反应中心色素降解和捕光色素的降解, 最终导致PSII 实际光化学效率降低, 性能指数明显下降(图10)。

2.2 盐度对QA2生长及油脂积累的影响

盐度对QA2的生长亦有一定影响。本研究结果显示, 海水的盐度(3.0%)仍是QA2生长的最适盐度, 在此盐度下, QA2生长最快。盐度增加或降低都会影响其生长速度(图11)。但是, 盐度的增加并没有降低其总脂及脂肪酸的含量(图12), 甚至在高盐度条件下油脂的积累还略有增加。因此, 在实验盐度范围内, QA2总脂和脂肪酸的日产率无明显差别(图13)。可见, QA2在室外开放式大规模培养时, 培养液盐度控制在1.5%~6.0%范

围内, 不会影响QA2的油脂积累, 但是盐度过高, 会影响其光合作用, 从而降低生长速度, 产油量也受到影响。

图6 不同浓度CH 3COONa 对QA2藻株总脂和脂肪酸

含量的影响

Fig.6 Effects of different concentration of CH 3COONa on the total lipid and fatty acid contents of Nannochloropsis

sp. QA2

图7 不同浓度CH 3COONa 对QA2藻株总脂和脂肪酸

日产率的影响

Fig.7 Effects of different concentration of CH 3COONa on the

daily total lipid yield and daily fatty acid yield of

Nannochloropsis

sp. QA2

图8 不同浓度Na 2CO 3对QA2藻株总脂和脂肪酸含量的影响Fig.8 Effects of different concentration of Na 2CO 3 on the total lipid and fatty acid contents of Nannochloropsis

sp. QA2

图9 不同浓度Na 2CO 3对QA2藻株总脂和脂肪酸

日产率的影响

Fig.9 Effects of different concentration of Na 2CO 3 on the daily

total lipid yield and daily fatty acid yield of

Nannochloropsis

sp. QA2

植物生理学报

914表3 不同盐度培养下QA2藻株叶绿素a 荧光参数

Table 3 Chlorophyll a ? uorescence parameters of Nannochloropsis sp. QA2 under different salinity

荧光参数

盐度/%

F v /F m ET 0/CS 0 TR 0/CS 0

RC/CS 0 ET 0/ABS PI ABS

1.5 0.731±0.002a 204.804±4.581b 434.982±9.161b 207.778±6.607b 0.344±0.001b 0.841±0.014b 3.0 0.732±0.002a 213.390±1.899a 446.886±5.247a 218.150±3.837a 0.349±0.002a 0.889±0.026a 4.0 0.712±0.000b 17

2.587±1.263c 364.562±2.711c 192.900±2.578c 0.337±0.001c 0.838±0.008c 5.0 0.707±0.005c 14

3.264±1.619d 322.582±5.137d 167.966±1.614d 0.330±0.004d 0.785±0.034c 6.0 0.679±0.002d 140.057±1.850e 299.719±3.557e

157.134±2.334e 0.302±0.003e

0.599±0.019c

同列数据后不同小写字母表示差异达显著水平(P <0.05)。

图10 不同盐度对QA2藻株叶绿素a 荧光参数的影响

Fig.10 Effects of different salinity on the chlorophyll a ? uorescence parameters of Nannochloropsis

sp. QA2

讨 论

微藻能利用无机碳作为外来碳源已有相关报道(Babich 等2011; Devgoswami 等2011), 但不同微

藻可利用的最佳碳源种类、添加浓度以及对微藻油脂积累的促进能力并不相同(郑洪立等2011; Barghbani 等2012; 蔡佳佳等2011)。从本研究结果可以看出, 以L 1海水培养基为基础, 培养液中添加

图11 不同盐度对QA2藻株生长的影响

Fig.11 Effects of different salinity on the growth of

Nannochloropsis

sp. QA2图12 不同盐度对QA2藻株总脂及脂肪酸含量的影响Fig.12 Effects of different salinity on the total lipid and fatty

acid contents of Nannochloropsis

sp. QA2

王通等: 外源碳源和盐度对微拟球藻QA2生长和油脂积累的影响915

NaHCO 3、CH 3COONa 、Na 2CO 3三种碳源均能促进海洋绿藻QA2藻株的生长, 但以添加15 mmol·L

-1

浓度的CH 3COONa 对QA2藻株的生长和油脂积累的促进作用最为明显, 总脂和脂肪酸的日产率与对照相比分别增加了173%和467%, 本实验结果与Wang 等(2012)对三角褐指藻(Phaeodactylum trico-rnutum )的研究结果基本一致, 因此CH 3COONa 是QA2藻株培养的最佳碳源。

盐度对微藻具有多方面的影响。已有的研究表明, 高盐度下微藻的电子传递速率降低, 导致ATP 的合成量也明显减少, 对微藻的生长和光合作用具有明显抑制作用(余锦兰等2011)。本实验对不同盐度培养下QA2的叶绿素a 荧光动力学研究也得出一致的结果, 盐度升高导致微藻叶绿素a 荧光参数不同程度的降低, 高盐度不仅影响微藻的电子传递速率, 也引起反应中心色素降解和捕光色素的降解, PSII 实际光化学效率降低, 影响微藻光合作用。同时在高盐度环境下微藻细胞内储存物质的脂肪含量也会有相应增加, 但生长过程中会消耗更多的能量(茅华等2007)。也有研究表明, 随着盐度增加, 微藻脂肪酸饱和度增加, 使脂肪酸的种类及含量改变(Xu 和Beardall 1997)。因此, 盐度的增加使QA2生长速度降低, 但并没有降低其总脂及脂肪酸的含量, 甚至在高盐度条件下油脂的积累还略有增加。可见QA2在室外开放式大规模培养时, 培养液盐度控制在1.5%~6.0%范围内, 不会影响QA2的油脂积累, 但是盐度过高, 会影响其光

合作用, 从而降低生长速度, 产油量也受到影响。从生长和产油效率来讲, QA2最适生长盐度应为天然海水的盐度。

碳源和盐度是影响海洋微藻生长的两个重要环境因子, 本实验结果可为筛选和培养高产油微藻提供重要依据, 也为开放式规模培养微藻及其相关研究提供参考。

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图13 不同盐度对QA2藻株总脂和脂肪酸日产率的影响Fig.13 Effects of different salinity on the daily total lipid yield and daily fatty acid yield of Nannochloropsis

sp. QA2

植物生理学报916

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