基于高通量测序的逆境下植物miRNA的研究现状_杨静
中国蔬菜 2012（20）：7-14
CHINA VEGETABLES
基于高通量测序的逆境下植物miRNA的研究现状
杨 静1，2秦智伟1*
（1东北农业大学，黑龙江哈尔滨150030；2哈尔滨市农产品质量安全检验检测中心，黑龙江哈尔滨 150070）
摘 要：microRNA（miRNA）是一类包含20～30个核苷酸的非编码RNA分子，在植物的生长发育和适应外界各种环境胁迫的过程中起着非常重要的作用。植物中miRNA的数量和种类都很多，而高通量测序技术的出现大大加快了miRNA的发现过程。本文综述了近年来利用高通量测序技术进行的逆境下植物体内miRNA的研究状况，以反映当前植物miRNA的发现、功能和进化等方面的最新研究进展。
关键词：高通量测序技术；微RNA；逆境胁迫；综述
中图分类号：Q789 文献标识码：A 文章编号：1000-6346（2012）10-0007-08 Present Situation of Studies on miRNA of Plant under Adversity Stresses Using High-throughput Sequencing
YANG Jing1，2，QIN Zhi-wei1*
（1Northeast Agricultural University，Harbin 150030，Heilongjiang，China；2Agriculture Products Safety and Quality Inspection Center of Harbin，Harbin 150070，Heilongjiang，China）
Abstract：MicroRNA are 20-30 nucleotides long non-coding RNAs．They have played very important roles in plant growth and development，and also the process of adapting to different environmental stresses．In plant，there are big amount and many species of small RNAs．The emerge of high-throughput sequencing technology has significantly accelerated their discoveries．The authors summarize the situation about studying miRNA by using high-throughput sequencing technology under stress，so as to report the new discovery，function and evolution of miRNA in plants.
Key words：High-throughput sequencing technology；MicroRNA；Adversity stress；Review
MicroRNA（miRNA）是一类调节基因转录后表达中起重要作用的非编码单链小RNA。它通过靶mRNA切割或者转录后沉默及甲基化目的DNA对生物体内基因的表达起着重要的调控作用。武亮和戚益军（2010）研究发现植物中抑制蛋白质翻译也是miRNA调控基因表达的普遍方式，miRNA不仅参与植物的整个发育过程，多种miRNA在植物受到病害、盐害等胁迫时被诱导表达，这表明miRNA参与了植物的抗逆反应（Rubio-Somoza et al.，2009），如盐胁迫后青杨中有161个miRNA表达变化，旱柳中有32个miRNA表达变化（周婧，2010）；低磷酸盐水平下
收稿日期：2012-02-29；接受日期：2012-06-21
基金项目：“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD02B03）
作者简介：杨静，女，农艺师，博士研究生，专业方向：黄瓜分子遗传育种，E-mail：yangjkk@https://www.360docs.net/doc/5d15511295.html,
* 通讯作者（Corresponding author）：秦智伟，教授，博士生导师，专业方向：黄瓜遗传育种，E-mail：qzw303@https://www.360docs.net/doc/5d15511295.html,
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miR399被强烈诱导表达，其靶mRNA丰度首先在根部出现下降（Buhtz et al.，2008）；植物在低铜条件下，诱导miR398表达量上升，重金属胁迫会抑制miR398的表达。
目前，从组织中获得miRNA的方法有两种，包括传统测序方法和高通量测序方法。传统测序方法可以通过构建miRNA的cDNA文库来实现；高通量测序方法是指454、MpSS、Solexa等测序技术的应用，该方法为各物种的miRNA鉴定与定量分析提供了良好的研究平台。本文综述了高通量测序技术的原理及利用该测序方法进行逆境下植物miRNA研究的进展。
1高通量测序技术的原理及优势
高通量测序技术首先将细胞中的所有转录产物反转录为cDNA文库，利用最新的SMS技术可略去这一步，直接对RNA进行测序，然后将cDNA文库中的DNA随机剪切为小片段（或先将RNA片段化后再反转录），在cDNA两端加上接头，利用新一代高通量测序仪测序，直到获得足够的序列，所得序列通过比对（有参考基因组）或从头组装（无参考基因组）形成全基因组范围的转录谱。
高通量测序技术发展了许多研究应用领域，主要是因为该测序技术有其绝对的优势。如454测序技术平台目前可以准确进行400个以上的碱基序列分析；Solexa测序技术平台同传统的Sanger测序方法相比，尽管测序片段长度较短是其主要的技术瓶颈，但却具有高准确性、高通量、高灵敏度、低运行成本等突出优势；SOLiD测序具有极佳的精确性，与传统技术相比，能得到更广泛的表达谱。总之，新一代测序技术使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全面的分析成为可能，是后基因组时代最理想的测序方法。
2利用高通量测序技术进行逆境下植物miRNA的研究
2.1miRNA与植物耐盐胁迫机制
盐胁迫几乎影响植物所有重要的生命进程。许硕（2011）利用Solexa测序平台从大豆Williams82的miRNA差异表达分析中获得了有显著差异的盐胁迫相关miRNA。其中miR169和miR319等上调表达，miR164和miR167等下调表达。而且miR164、miR167与植物耐盐负相关，miR319与植物耐盐正相关。由于miR319、miR164及miR167都能够直接或者间接调节植物体内的激素水平，因此推测可能通过这些miRNA影响信号通路，从而对植物耐盐性产生影响。对于miRNA169，之前对水稻miRNA169家族进行分析时就发现，miRNA169g和miRNA169o 对盐胁迫强烈响应，它们的启动子区存在ABA响应元件ABRE，表明两者均受ABA调控。而且miR169是通过选择性切割CCAAT盒结合转录因子来影响下游基因的作用（Zhao et al.，2009）。此外，miR160是另一个响应盐胁迫的miRNA，高盐处理后miR160b下调表达，推测高盐处理引起miR160b靶基因ARF17表达水平增加，从而影响盐胁迫下根的生长（周立敬，2011）。该研究证明了Mallory等（2005）的研究结论：抑制miR160的表达可以提高ARF17的mRNA水平，导致生长素诱导的GH3类mRNA的水平及其表达的蛋白质发生改变，从而导致根生长缺陷。
2.2miRNA与植物耐旱胁迫机制
干旱对作物产量的影响在诸多自然逆境中居首位。Sunkar等（2008）为了获得水稻应答盐和干旱胁迫相关的小分子RNA，对来自盐和干旱胁迫下生长49 d的水稻幼苗小分子RNA进行了深度测序，在获得的3.3×105个小分子RNA序列中，不仅发现了已知的46个水稻miRNA 家族，还获得了23个新的低拷贝miRNA和40个候选miRNA。陈锐（2009）分析了野生大豆小分子RNA文库，得到141个保守的miRNA和171个新的miRNA，这171个新的miRNA中
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有53个新miRNA预测到共206个靶基因，其功能涉及到植物生长发育和环境响应的各个方面，其中miR319、miR160、miR167等在干旱胁迫后明显下调表达；gso-miR1和gso-miR6干旱胁迫后上调表达。还有研究表明，干旱诱导水稻miR169g表达（Zhao et al.，2007），而miR169g是miR169家族唯一受干旱诱导的miRNA，miR169a和miR169c在拟南芥受干旱胁迫时被抑制表达，过表达miR169a的植株较野生型表现出叶片易失水和抗干旱能力减弱等特点（Li et al.，2008）。干旱胁迫下，拟南芥中有9个miRNA与在oryza sativa中的表达方式相反（Zhou et al.，2010），miR169在拟南芥和紫花苜蓿中下调表达，而在水稻中上调表达（Sunkar et al.，2012）。以上研究表明，不同作物，甚至是同一作物的不同品种对干旱胁迫的响应机制也不尽相同。
2.3miRNA与植物低温胁迫机制
温度胁迫是一种较为普遍的逆境。最初Sunkar和Zhu（2004）利用不同温度胁迫处理拟南芥幼苗构建小RNA文库，发现低温胁迫可以诱导miR393和miR397表达。在逆境胁迫下miR393靶向TIR1，而TIR1是生长素信号的正调控子（Dharmasiri & Estelle，2002），对TIR1 mRNA的抑制能够负向调节生长素信号和幼苗生长，因此，miRNA393对TIR1的正向调控有可能抑制逆境下植株的生长。最近研究表明，低温可以诱导木薯的miRl56a、miR399e等6个miRNA上调表达，而miR171a/b/、miR157b等10个miRNA被抑制表达（薄维平 等，2010），但同时，低温却抑制了毛白杨miRl56的表达，诱导了拟南芥miR171的表达（Lu et al.，2006）。说明不同作物品种（组织）中可能存在不同miRNA调节的耐低温基因。此外，为了适应低温胁迫的不利环境，不同作物已经形成了各自的miRNA调控系统以响应低温胁迫。如对玉米在冷胁迫下miRNA 的调节进行研究发现，56个已知miRNA表达量差异达到显著或极显著水平，其中下调表达和上调表达的miRNA分别为38个和18个，研究预测的靶基因涉及到植物的各个方面（杨光，2010）。而短柄草在低温胁迫的不利环境下，其组织内的保守miRNA和非保守miRNA都参与响应胁迫，但是所有保守的miRNA都被上调表达（Zhang et al.，2009）。
2.4miRNA与植物抗病胁迫机制
Subramanian等（2008）对蔓生大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）侵染3 h后的大豆根的小分子RNA文库进行测序分析，发现其小分子RNA涵盖了50%以上的大豆miRNA，其中 miR159的表达量急剧上升，表明它可能参与了大豆对该菌侵染过程的应答。近年来的研究发现，miR158、miR159等基因在植物抵御病毒侵染的过程中参与调控介导（Ng et al.，2011），证实了Subramanian等（2008）的推测。同时，当拟南芥成熟的miRNA159遇到非洲木薯花叶病毒（African cassava mosaic virus）编码的蛋白时会被阻止对正常目标mRNA的调控，从而干扰了转录后基因沉默共抑制过程（Padmanabhan et al.，2005）。还有些植物病毒如烟草花叶病毒科（Tobamoviridae）和马铃薯Y病毒科（Potyviridae L.）能引起烟草相关miRNA积累水平的变化，其发病症状与这些miRNA的变化水平存在一定的相关性。这一过程并不是抑制PTGS过程，而是直接作用于miRNA的表达水平，从而影响植物的抗病能力（Bazzini et al.，2007）。另外，阴祖军（2011）发现当黄萎病菌侵染棉花后，冀棉11中有38个miRNA表达量下调，15个miRNA表达量上调；海7124中有24个miRNA表达量下调，15个miRNA表达量上调。在正常生长和黄萎病菌侵染的两份棉花材料中，分别有54个和44个miRNA的表达量有显著差异。
2.5miRNA与植物营养胁迫机制
氮素是植物生长发育必需的营养要素。因此，植物的生长会受到低氮胁迫的影响，如冯卓（2012）利用Solexa技术通过比较基因组学的方法对低氮胁迫下黄瓜幼苗差异表达基因进行鉴
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定，结果发现黄瓜幼苗在低氮胁迫下差异表达的基因共有11 655个，其中符合FDR≤0.001且倍数差异在2倍以上的基因共868个，上调表达的有654个，占总数的75.3%，下调表达的有214个，占总数的24.7%。低氮胁迫下，黄瓜幼苗差异表达的基因主要有两大类，第一类主要为酶类，第二类主要包括一些与激素调节相关的基因。GO分析显示差异基因涉及多个生物过程，其中在含氮化合物代谢（nitrogen compound metabolic process）过程中包含了62个差异表达基因，包括44个上调表达基因和18个下调表达基因。同时还发现，在低氮胁迫下黄瓜幼苗差异表达基因显著性分析显示，差异基因共涉及89个Pathway，其中氮代谢通路中共有8个基因差异表达，包括2个上调基因和6个下调基因。其他关于氮素营养的研究，如许振华（2011）在玉米叶片中检测到14个稳定低硝酸盐响应miRNA和9个瞬时低硝酸盐响应miRNA，两种响应的表达模式相反。miR169e对低硝酸盐既有稳定响应也有瞬时响应。在根中检测到8个稳定低硝酸盐响应miRNA和9个瞬时低硝酸盐响应miRNA，且miR169p、miR169i-k在叶片和根中都存在。
目前，已证明miR399是一类与植物耐低磷胁迫密切相关的小RNA家族（Aung et al.，2006；Lin et al.，2008）。miR399通过与UBC24 mRNA的5′-UTR结合下调其表达，同时UBC24 mRNA 的5′-UTR区已被证实与植物缺磷响应有关（Chiou et al.，2006）。除了miR399，当处在低磷条件时，miR398、miR395、miR827等的表达量也出现上调或下调的现象（Chiou，2007；Pant et al.，2009）。其中，miR827的靶基因是E3连接酶NLA（At1g0260），NLA参与植物花青素合成，其突变体在缺氮条件下花青素含量下降，叶片早衰；但磷和氮素同时缺乏时，突变体表现为野生型。表明尽管miR827会抑制NLA表达，但缺磷作为一种信号，足以诱导花青素合成，弥补miR827对NLA的抑制（Pant et al.，2009）。研究还表明，miRNA398除了在低磷胁迫下发挥功能外，在铜素缺乏的情况下也参与介导了Cu/Zn SOD mRNA的降解过程。
2.6miRNA与植物氧化胁迫机制
上述逆境胁迫很多都伴有氧化胁迫的存在。Moldovan等（2010）从经过缺氧处理的拟南芥根组织中鉴定出属于46个家族的65个特异microRNA，属于3个家族的14个tasiRNA，缺氧导致19个家族中46个miRNA及所有tasiRNA发生丰度改变。也有研究表明，miR398是植物响应氧化胁迫的主要miRNA，当植物处于逆境胁迫下，miRNA398的表达受到抑制，释放其对CSD 基因产物的抑制，CSD转录产物的积累表现出植物的抗氧化能力（Sunkar et al.，2006）。
与其他引起植物氧化胁迫的因素相比，涝害是直接导致植物根系周围氧气缺乏，引起氧化胁迫的重要因素。齐晓花等（2011）以黄瓜强耐涝型品种早二N为试材，进行了黄瓜3-磷酸甘油醛脱氢酶基因CsGAPDH的克隆及其涝胁迫响应分析，结果发现CsGAPDH属于黄瓜涝胁迫响应基因，当黄瓜受到涝胁迫后，CsGAPDH在黄瓜的根、茎、叶中均有表达，但在根中被强诱导表达，表达量的上升幅度显著高于茎和叶中的增加幅度，表明黄瓜根细胞是响应涝胁迫的主要组织，同时研究还表明涝胁迫使得茎叶中的糖酵解途径增强，糖代谢能力短时间内得到加强，从而使植物体维持较高的能荷水平而正常生长。
3关于miRNA的进化
植物miRNA的进化过程频繁而快速。目标基因反向复制机制（inverted duplication）是目前研究者比较倾向的一种miRNA起源机制（Adenot et al.，2006；Li & Mao，2007）。高通量测序技术的出现尤其加速了拟南芥中低拷贝和新型miRNA的克隆，不断有拷贝数极低的miRNA被发现（Lu et al.，2006；Rajagopalan et al.，2006）。有意思的是，在这些小分子RNA中有些衍生成员仍始终保持着较低的表达量，而另外一些的表达量则显著增加。这暗示着这些衍生的miRNA
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在功能上已逐渐发生了分化（Lu et al.，2006）。
miRNA的一个重要特性是进化上的高度保守性。如miRNA159、miRNA166等存在于包括拟南芥、水稻等所有陆地植物中，而mir171（mir39）的相似序列在拟南芥、水稻和烟草中可用杂交比对的方法探测到（Llave et al.，2002；Axtell & Bartel，2005）。这种进化上的保守性使得研究者可以借助这些特征在其他植物物种中检测同源的miRNA。如33个水稻miRNA家族在拟南芥或杨树的miRNA中找不到对应的成员，表明杨树中新发现的miRNA大多数可能是杨树特有的（Tuskan et al.，2006）。Yao等（2007）分析了1个由小麦叶片、根和果穗等组织组成的混合小分子RNA文库，得到35个种间保守的miRNA和23个小麦特有的miRNA，而且miR512和miR513分别在小麦的幼穗和根中特异表达，说明它们可能特异参与了小麦幼穗和根的发育。另外，发现了4个单子叶植物特有的miRNA：miR506、miR510、miR514和miR516。可见，这种高度的保守性与其功能的重要性有着密切关系（Nilsson et al.，2007）。
4植物全基因组测序结果的利用
利用高通量测序手段，人类已经快速的步入后基因组时代，即从基因组测序阶段进入利用测序结果进行功能基因组研究的阶段。当前，拟南芥、水稻、玉米、黄瓜等作物的全基因组测序工作已经完成，如何利用这些测序结果已成为当前主要的研究方向。
Moisy等（2008）在葡萄基因组中发现27 个逆转座子序列，并且将其中24个新的逆转座子序列分成10个新的基因家族，分别为Gentil、Edel、Huben、Rangen、Bran、Cremant、Gan、Kaste、Noble和Wintz。
Feng和Chao（2009）基于水稻与拟南芥全基因组序列，在基因组与蛋白质组水平上对这2种模式植物的丝氨酸羧肽酶（SCPs）基因家族进行比较分析。发现水稻与拟南芥中分别存在71个与54个丝氨酸羧肽酶类（SCPL）蛋白编码基因，它们广泛分布于基因组中各条染色体上，并且存在多个基因簇聚区。基因结构分析显示，拟南芥的SCPL基因存在广泛的交替剪接方式，而这种现象在水稻SCPL基因中却不常见。蛋白结构分析表明，所有SCPL家族成员均具有α/β水解酶折叠亚族、S10家族典型的保守结构域和二级结构的特征。
江海洋等（2010）利用公布的高粱全基因组数据对高粱生长素反应因子ARF基因的数量、物理位置、系统进化树、氨基酸序列及保守基序的保守性等进行分析。结果表明，在高粱全基因组中共有26个ARF基因，根据其进化关系可将其分为A、B、C 3类；而且发现高粱基因组中ARF基因存在明显的基因复制现象，基因的复制对高粱基因组中ARF基因数量的扩张起到了重要作用。
2011年，利用全基因组序列信息进行的研究迅速增多。吕婧等（2011）利用在黄瓜全基因组基础上开发的995对SSR引物对来自不同国家和地区的30份黄瓜种质遗传多样性进行探讨，发现供试种质间平均期望杂合度为0.57，平均PIC值为0.60。朱命喜等（2011）通过对拟南芥、水稻等植物已知的转录因子与大豆基因组数据比对，得到44条新的大豆SBP转录因子，通过预测它们的启动子及可能包含的顺式作用元件，发现MBS、MBSⅡ是MYB转录因子家族特有的结合位点，推测其可能与其他转录因子互作共同完成植物生长发育相关的功能。孙思龙（2011）利用锚定的甘蓝基因组与拟南芥基因组、白菜基因组进行注释基因的比较，分析基因间的共线性关系，找到甘蓝与拟南芥、白菜类作物之间的共线性区域。认为甘蓝与拟南芥相比，同样经历了一个三倍化的过程，拟南芥中的1个保守区段能够在甘蓝中找到3个甚至更多复制，这些发现有利地支持了甘蓝起源于六倍体祖先的假设；甘蓝与白菜类作物相比，部分染色体结构与白菜类作物类似，自与白菜类作物分开进化之后未发生大的结构变化，另一部分染色体结构与
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白菜类作物相比却发生了大的变化，与甘蓝染色体的融合重排有关。
张体付等（2012）根据玉米B73全基因组序列（第2版）及玉米Mo17的二代电子拼接序列发现了40 000多个InDel位点，其中约有11 400个含有InDel位点的序列可用于特异性引物的开发。新发展的143个代表基因（＜1 kb）或基因内部的功能性InDel标记在B73及Mo17间得到了验证，并用于玉米杂交种纯度的鉴定。经分析，共有13个共显性InDel标记在6个杂交种亲本间表现出明显的长度多态（>50 bp）。
5展望
逆境胁迫是影响作物生长和产量的重要因素，解决这一问题的前提是弄清作物的抗胁迫机制。但是miRNA的调控网络非常复杂，比如miR160和miR167具有相同的靶基因GH3，miR172和miR156具有相同的靶基因SPL3/4/5。这说明，这些miRNA之间在植物细胞中协同调控的分子机制还需要进一步研究。因此，逆境下植物miRNA的调控网络也有待进一步完善，如植物miRNA是如何协调各种植物激素信号转导和逆境胁迫信号转导在植物体内的平衡；植物某些重要次生代谢产物的代谢调控过程是否也有植物miRNA的参与。通过分析发现，逆境下植物miRNA的研究多集中在下游靶标的研究上，而对其上游调控元件的研究很少。因此，关于植物miRNA上游调控元件的鉴定及其调控机制将是今后研究工作的一个重要方向。同时，当前逆境下miRNA的研究集中在高盐、抗旱及抗病方面，而对高温、碱、钠、铁，尤其是农药胁迫方面的耐逆机制的研究鲜有报道。由于人们越来越重视食品质量安全，因此应尽早探明响应农药胁迫的miRNA的功能，并利用其为解决食品安全问题提供有价值的参考。
miRNA在进化上的高度保守性在研究中应注重利用。将模式植物拟南芥中与植物抗逆有关的miRNA基因（miRNA398、miRNA399等）克隆并导人其他植物中，通过植株再生系统观察转基因植物的表型变化，确定这些miRNA在其他植物抗逆过程中的作用，从而推断导入miRNA在其他植物中的功能；比较这些基因在不同植物中的功能，发现这些基因在进化上的特性，为miRNA的起源提供试验依据。同时，也正是由于miRNA基因是一类高度保守的非编码基因大家族，各种miRNA都能在其他种系中找到同源体（Svoboda & Cara，2006）。因此，可以认为miRNA在植物各物种间的差异不会很大。在拟南芥等模式植物中找到的miRNA，可能在其他植物中找到相关的miRNA。模式植物中应答逆境胁迫的miRNA有可能改变其他植物的逆境适应性。
当前，由于高通量测序手段被广泛采用，越来越多的作物全基因组测序工作开始或已完成，研究重心也应逐步由“结构”向“功能”转移。“功能”指基因组功能信息的提取、鉴定和开发利用，以及与此相关的数据资料、基因材料和技术手段的贮存和使用。目前在农业方面，随着拟南芥基因组、水稻基因组以及各种模式植物基因组的研究利用，科学家根据不同物种之间的进化距离和功能的同源性，建立起与植物良种繁育相关的基因数据库，可以方便地找到各种作物与其经济效益相关的基因，并加以改造，培育农作物良种，为全面了解植物的基因组序列和农业重要性状相关基因的相互作用、机理以及分离、克隆新的有重要理论和使用价值的基因开辟了新的途径。
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